专利名称：同时制备magnoloside A和magnoloside B化学对照品的方法
技术领域：
本发明涉及一种同时制备magnolosideA和magnoloside B化学对照品的制备工艺。主要包括提取、溶剂萃取、树脂柱分离及中压反相液相富集和高压反相液相制备四步高
效纯化，收集流份、干燥即可同时获取两种对照品。其结构式如下
OHOH
背景技术：
厚朴为大宗常用中药材之一，具有燥湿消痰、下气除满的功能，用于湿滞伤中、脱痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘、痰饮喘咳。厚朴酚与和厚朴酚被认为是厚朴的活性成分，同时也是《中国药典》中厚朴药材含量测定的成分；余盛贤等报道了苯乙醇苷类化合物为厚朴水溶性部位的主要成分，指出苯乙醇苷-magnoloside A在厚朴的产地加工过程中含量有较大变化(中国中药杂志，2010，35 (14) 1831-1835)。苯乙醇苷类化合物具有广泛的生物活性，而对中药厚朴中苯乙醇苷类化合物的化学成分研究少有报道，对苯乙醇苷类成分的定性定量研究更是未见报道。因此，制备magnoloside A, magnoloside B对照品对于厚朴药材及相关复方的多指标质量控制具有重要意义。目前，对照品市场上也未见magnoloside A和magnoloside B的供应，其分离制备方法也少有报道。Hasegawa takashi首次报道了从日本厚朴(Magnolia obovata)中分离得至Ij magnoloside A 禾口 magnoloside B，并申请了新化合物专利(JP 63310899)。其制备步骤如下日本厚朴用甲醇提取物，混悬于水中，经正丁醇萃取，正丁醇萃取部位反复经硅胶柱层析纯化，最后经HW-40F纯化得到纯品。该方法制备工艺较为复杂，制备周期较长，且没有进行纯度检验。本发明以厚朴为原料，经醇提取得到提取物，通过萃取、树脂柱分离、反相中压液相色谱制备和反相高效液相制备色谱四步高效纯化，收集相应流份，干燥，可批量同时获取两个个对照品。
三、发明内容
本发明提供了一种工艺较简单、易规模化的制备新方法，从厚朴中同时制备纯度大于98%的magnoloside A和magnoloside B两种化学对照品，制备规模为克级。为实现上述目的，本发明采用的技术方案(1)将厚朴药材粉碎，得到粗粉，用70%乙醇水加热回流提取。(2)将(1)乙醇水提取的提取液浓缩至2g生药/mL，用等体积的氯仿萃取三次。(3)将(2)中萃取后的水溶液过大孔树脂柱，用5倍柱体积的蒸馏水洗脱除杂，再用5倍柱体积20%乙醇水洗脱。(4)将(3)中20%乙醇水洗脱液浓缩至干，用0% -25%的甲醇水溶解，配置成浓度为 lOO-lOOOmg/mL。(5)中压反相制备色谱柱的填充填料为C18，制备柱长30-100cm、直径2-5cm ；采用的流动相为A:甲醇；B:pH 3-4的醋酸水溶液，两相溶剂以按照体积分数比为11 89到35 65进行梯度洗脱；进样量与色谱填料的比为1 30-1 100，流速控制在15-100ml/min ；收集两个主峰。(6)两个主峰收集液分别浓缩，经高压反相制备液相纯化，填充填料为C18，制备柱长25-50cm，直径2-5cm ；采用的流动相为30%甲醇水等度洗脱，流速为lO-lOOmL/min。(7)收集液40°C低压回收有机溶剂，然后冻干。以本发明从厚朴中分离magnoloside A和magnoloside B化学对照品具有如下优点和进步(1)本发明针对性强，工艺较简单。氯仿萃取除去厚朴中的脂溶性化合物，再经大孔树脂分离，最大程度地富集目标产物，有利于中压反相制备色谱中填料的保护和分离效果的提高；中压反相液相制备较文献反复硅胶柱层析，具有较好的重现性和快速等优点；高压制备液相中采用甲醇-水溶剂等度洗脱，不需平衡柱子，提高了效率、节约了试剂。(2)本发明中采用的技术手段适于放大进行规模化生产。大孔树脂具有价格便宜、可再生反复使用等特点，适于规模化生产；采用的中压反相色谱和高压反相色谱也具有规模生产的优点。(3)本发明得到的对照品具有纯度高(大于99% )，色泽较好(淡黄色)。
四
图 1 为 magnoloside A 的 HPLC 分析图谱(3^nm)；图 2 为 magnoloside B 的 HPLC 分析图谱(3^nm)；图 3 为 magnoloside A 的 1H-NMR 图谱；图 4 为 magnoloside A 的 13C-NMR 图谱；图 5 为 magnoloside B 的 1H-NMR 图谱；图 6 为 magnoloside B 的 13C-NMR 图谱；图7为厚朴中制备magnolosideA和magnoloside B对照品的工艺流程图。
五具体实施例方式现结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。厚朴干燥树皮8. Okg,粉碎，用4倍量70%乙醇加热回流提取池，提取3次，浓缩至4L，用4L氯仿萃取3次。水部位经4L的DlOl大孔树脂分离，5倍柱体积蒸馏水洗脱除杂后，再用5倍柱体积的20%乙醇洗脱，收集20%乙醇洗脱部分，浓缩干燥得棕色浸膏250g。取浸膏50g，用50mL 20%甲醇溶解，经微孔滤膜滤过，注入反相中压色谱柱，色谱柱直径5cm，长50cm，色谱柱的填充填料为50 μ m C18 (YMC)，流速控制为100mL/min，检测波长为328nm，流动相梯度为0-1001^11,11^-35%甲醇-醋酸水(pH = 3)。收集两个主峰，40°C减压旋转浓缩，得至丨J magnoloside A 10. 5g, magnoloside B 7g。反相高压液相制备取magnoloside A粗品1. 5g，溶于IOmL 20%甲醇水中，经微孔滤膜滤过，吸取ImL滤液经高压反相制备柱分离，柱长度为25cm，内径2cm，流速IOmL/min,合理收集主峰得到IOOmg的magnoloside A，纯度大于98%。吸取5mL滤液经高压反相制备柱分离，柱长度为50cm，内径5cm，流速150mL/min，合理收集主峰得到480mg的magnoloside A，纯度大于98%。外观为淡黄色粉末。取magnoloside B粗品1. 5g，溶于IOmL 20%甲醇水中，经微孔滤膜滤过，吸取ImL滤液经高压反相制备柱分离，柱长度为25cm，内径2cm，流速lOmL/min，合理收集主峰得到90mg的magnoloside B,纯度大于98%。吸取5mL滤液经高压反相制备柱分离，柱长度为50cm，内径5cm，流速150mL/min，合理收集主峰得到400mg的magnoloside B,纯度大于98%。外观为淡黄色粉末。
权利要求
1.同时制备magnolosideA和magnoloside B化学对照品的方法，其特征在于厚朴药材经醇提取得粗提物，经萃取、树脂柱分离、反相中压液相制备及反相高效液相制备四步高效纯化，同时获取纯度大于98%的magnoloside A和magnoloside B两种化学对照品；具体步骤如下(1)提取和萃取厚朴药材用乙醇溶液提取得粗提物，回收乙醇并浓缩至一定体积，用氯仿萃取除掉脂溶性杂质。(2)树脂柱粗分水层经树脂柱分离，先以水洗脱除去杂质，然后以体积分数在20%-30%之间的任一乙醇溶液洗脱，收集相应乙醇洗脱物，浓缩干燥得棕色浸膏。(3)反相中压液相色谱富集和高效液相制备色谱精制棕色浸膏用水或低浓度甲醇溶液溶解，微孔滤膜过滤，反相中压液相色谱分离，以甲醇-醋酸水溶液为洗脱体系，紫外检测器328nm下监测，收集图谱中两个主要的色谱峰，蒸干，即可得到纯度大于85%的magnoloside A和magnoloside B粗品；再经反相高效液相制备色谱分离，甲醇-水溶液为洗脱体系，即可得到纯度大于98%的对照品，其外观为淡黄色粉末。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中提取溶剂可为0-95%乙醇。其用量是药材的4-10倍。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中加热回流提取的时间为1-2小时，提取次数为2-4次。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中浓缩至l_2g生药/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中氯仿的用量为被萃取溶液体积的1-2倍，萃取次数2-3次。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤O)中粗分离中采用的树脂为D101、HPD 100、Diaion HP-20 或AB-8。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤O)中各梯度洗脱的体积为3-5倍柱体积。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C3)样品用水或者为体积分数不高于25%的甲醇溶解，样品浓度为lOO-lOOOmg/mL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中反相中压液相制备柱的填充填料为C18，制备柱长30-100cm、直径2_5cm。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C3)中反相高压液相制备柱的填充填料为C18，制备柱长25-50cm、直径2_5cm。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中反相中压液相采用的流动相为甲醇利含醋酸的水溶液两相体系，醋酸水的PH值为3-4，两相溶剂以体积分数比为11 89 35 65进行梯度洗脱，流速为30-100mL/min。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C3)中反相高压制备液相进样体积为l-50mL，流速控制在10-200mL/min ；采用的流动相为30%甲醇水溶液。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中反相中压液相和反相高压制备液相上样量与填料之比为1 30-1 10。
全文摘要
本发明涉及一种同时制备magnoloside A和magnoloside B化学对照品的制备工艺。厚朴药材经醇提取得粗提物，经萃取、树脂柱分离、反相中压液相色谱制备和反相高效液相色谱制备四步高效纯化，即可获得纯度大于98％的magnoloside A和magnoloside B两种化学对照品。本发明工艺步骤较简单、纯度高、色泽好，并且适于规模化生产。
文档编号C07H1/08GK102391328SQ20111025932
公开日2012年3月28日 申请日期2011年9月5日 优先权日2011年9月5日
发明者余盛贤, 晏仁义, 杨滨 申请人:中国中医科学院中药研究所