专利名称：一种抗人精胺氧化酶的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及单克隆抗体领域，更具体的，本发明涉及一种抗人精胺氧化酶的单克隆抗体，本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法、检测或鉴定方法，本发明还涉及该单克隆抗体的应用，属于免疫化学技术领域。
背景技术：
多胺，包括腐胺，精脒，精胺，是广泛存在于生物体组织中的一类多价阳离子小分子化合物，它们能与带负电荷的大分子如DNA，RNA和蛋白质等结合，进而参与染色体生成、基因转录活化、信号传递和细胞程序性凋亡等多种重要的生理病理过程(Heather MW, Alison VF, Alun HA. A perspective of polyamine metabolism[J]. Biochem J, 2003, 376(1):1-14. ； Moinard C, Cynober L, De Bandt JP. Polyamine:metabolism and implications in human diseases[J]. Clinical Nutrition, 2005, 24(2):184-197.)。 多胺不仅为正常细胞生长所必须，还与肿瘤的发生和快速生长密切相关。由此多胺代谢途径逐渐成为抗肿瘤治疗的新靶点(Casero RA and Pegg AE. Polyamine catabolism and AiseaseW]-Biochem J, 2009，421 (3) :323-338. ； Casero RA, Marton LJ. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases [J]. Nat Rev Drug Discov, 2007, 6 (5) : 373-390. ； Casero RA and Woster PM. Recent advances in the development of polyamine analogues as antitumor agents[J], Medical Chemistry, 2009， 52(15):4551-4573.)。精胺氧化酶(spermine oxidase, SM0)是新近被成功克隆和鉴定、主要参与多胺分解代谢途径的关键酶，该酶以精胺为首选底物，将其分解为精脒和氨基丙醛，同时产生过氧化氧(Wang Y，Devereux W，Woster P，Stewart T，Hacker A，Casero R Jr. Cloning and characterization of a human polyamine oxidase that is inducible by polyamine analogue exposure. Cancer Res, 2001 ； 61:5370 - 5373. )。SMO 表达水平可以被各种剌激诱导而上调，包括抗肿瘤多胺类似物(Casero RA md Woster PM. Recent advances in the development of polyamine analogues as antitumor agents[J]. Medical Chemistry, 2009, 52(15):4551-4573. ； Wang Y， Devereux W, Woster P， Stewart T，Hacker A，Casero R Jr. Cloning and characterization of a human polyamine oxidase that is inducible by polyamine analogue exposure. Cancer Res, 2001;61:5370 - 5373. ； Hacker A，Marton LJj Sobolewski M，Casero RA Jr. In vitro and in vivo effects of the conformationalIy restricted polyamine analogue CGC-I1047 on small cell and non-small cell lung cancer cells. Cancer Chemother Pharmacol 2008;63:45 - 53. [PubMed: 18301893] ； Zahedi K, Bissler JJj Wang Zj Josyula A，Lu L，Diegelman P，Kisiel N，Porter CWj Soleimani M. Spermidine/ spermine Nl-acetyltransferase overexpression in kidney epithelial cells disrupts polyamine homeostasis, leads to DNA damage, and causes G2 arrest. AmJ Physiol Cell Physiol 2007 ； 292 C1204 - 1215. [PubMed 17065202] )0 研究发现，SMO 不仅在抗肿瘤研究中具有潜在的应用价值，而且在许多疾病的发生中发挥着非常重要的作用，如炎症，感染，缺血再灌注损伤，肿瘤等。由此，SMO成为许多疾病化学预防和治疗的一个潜在靶点。作为多胺分解代谢的关键酶之一，SMO有作为抗肿瘤分子靶点的重要潜在应用价值。鉴于目前国内外尚未见商品化的人SMO单克隆抗体供应，限制了组织、细胞和分子水平上对SMO的研究。为了填补这一空白，我们采用原核表达获得重组人精胺氧化酶，并以此重组蛋白作为抗原制备出鼠抗人精胺氧化酶单克隆抗体，该抗体可广泛用于生物科学和医学的相关研究领域。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种特异性强、免疫效果好、可大量生产、且针对人精胺氧化酶的单克隆抗体，该单克隆抗体能识别或检测源自哺乳动物的精胺氧化酶，为人精胺氧化酶的进一步研究提供了有力的工具，如以精胺氧化酶(SMO)为靶点的抗肿瘤基础和临床研究。本发明还有一个目的是提供一种分泌抗人精胺氧化酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 SP2/0-SM0。所述杂交瘤细胞株SP2/0-SM0于2011年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201159，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学(邮编430072)。所述杂交瘤细胞株能合成和分泌高效价的抗SMO单克隆抗体，经间接Elisa法测定，其效价达到 1:512 000。本发明还有一个目的是提供一种制备抗人精胺氧化酶的单克隆抗体的方法。本发明还有一个目的是提供一种能识别哺乳动物精胺氧化酶的单克隆抗体的应用，所述单克隆抗体可以检测或鉴定源自哺乳动物的精胺氧化酶，其中哺乳动物为人、小鼠或猴，所述检测或鉴定是定性分析或定量分析。本发明还有一个目的是提供一种利用抗人精胺氧化酶的单克隆抗体在检测精胺氧化酶的应用，其中包括所述单克隆抗体在免疫印迹检测精胺氧化酶的应用、所述单克隆抗体在ELISA分析检测精胺氧化酶的应用，所述单克隆抗体在免疫组织化学分析检测精胺氧化酶的应用、所述单克隆抗体在免疫荧光分析检测精胺氧化酶的应用、所述单克隆抗体在免疫沉淀检测精胺氧化酶的应用、所述单克隆抗体在流式细胞术检测精胺氧化酶的应用。本发明还有一个目的是提供一种检测细胞中的精胺氧化酶的方法，该方法包括
(1)将抗人精胺氧化酶的单克隆抗体与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液进行接触；
(2)判断是否有阳性反应。其中，所述阳性反应是通过ELISA、免疫组织化学分析、免疫荧光分析、免疫沉淀或流式细胞术来进行判断的；所述细胞为哺乳动物细胞。本发明所述的抗人精胺氧化酶的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤 ①精胺氧化酶(SMO)抗原的制备
将人SMO全长编码序列(SEQ ID NO :1所示的基因)转化入大肠杆菌，诱导重组人SMO 表达，表达的蛋白产物经分离纯化、透析复性后，测定浓度，获得纯化的精胺氧化酶。其中，分离纯化是将诱导表达好的大肠杆菌培养液离心获得沉淀，用Buffer B (8mol/L 尿素，0. 1 mol/L NaH2P04, 0.01 mol/L Tris-HCl, pH 8. 0)裂解菌体，离心后取上清，用M-NTA树脂亲和层析纯化从而获得精胺氧化酶；所得精胺氧化酶进行透析复性以去除尿素；复性后的纯化的精胺氧化酶用SDS-PAGE和Western blot进一步鉴定，再进行浓度测定。②动物免疫
用佐剂与纯化的精胺氧化酶等体积混合成乳化混合液，对Balb/C小鼠进行初次免疫、 二次免疫、三次免疫和加强免疫。其中初次免疫、二次免疫、三次免疫采用背部皮下多点注射，初次免疫时间为4 周，二次免疫时间为2周，三次免疫时间为2周；加强免疫步骤中不加入佐剂，直接使用精胺氧化酶对小鼠进行腹腔注射。③筛选
用ELISA法检测免疫鼠血清抗精胺氧化酶的效价。所述免疫鼠血清是通过取加强免疫后的Balb/C小鼠的尾血从而制备的多克隆抗体血清。④细胞融合、杂交瘤细胞株的筛选及克隆化
选取抗血清效价高的免疫Balb/C小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行体外融合，经过2 3 次亚克隆后，选取能稳定分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞株。细胞融合在加强免疫后3天进行；所述骨髓瘤细胞为对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5 :1至10 :1，其中50%PEG 4000溶液为融合剂。⑤单克隆抗体的大量制备
将所选取的单克隆细胞株扩大培养，采用诱生腹水法大量制备抗精胺氧化酶的单克隆抗体。其中，预先1周在Balb/C小鼠腹腔注射石蜡油致敏，然后在Balb/C小鼠腹腔接种筛选获得的杂交瘤细胞，10 d后抽取腹水(可抽取多次)，离心取上清即得单克隆抗体溶液，抗体置于-20 °C保存。⑥单克隆抗体鉴定
采用ELISA测定抗体效价，经间接Elisa法测定，其效价达到1:512 000。采用Wfestern blot检测抗体特异性，该单克隆抗体可与精胺氧化酶原核表达蛋白特异性结合，而不与其它无关带His标签蛋白结合；该单克隆抗体还能特异性识别小鼠原核表达精胺氧化酶 mSMO ；该单克隆抗体可与真核细胞中变性条件的SMO特异性结合，可用于定性和定量分析， 该单克隆抗体还可以识别猴和小鼠的SM0。该单克隆抗体可用于免疫印迹分析、ELISA、免疫组织化学分析、免疫荧光分析、免疫沉淀等。其中，免疫组织化学分析和免疫荧光分析显示，该单克隆抗体可检测Hela细胞中的SMO蛋白表达情况；免疫荧光分析显示，该单克隆抗体可识别人培养细胞中的SMO蛋白；免疫组织化学分析显示，该单克隆抗体可识别可识别鼠源的SMO蛋白；免疫沉淀实验显示，该单克隆抗体可与细胞裂解液中的SMO蛋白结合并沉淀下来。此外，该单克隆抗体可用于流式细胞术分析。
图1为鉴定原核表达与纯化的重组SMO蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道1为 BL21/pET-15b/SM0 细菌，IPTG 诱导前；泳道 2 为 BL21/ pET_15b/SM0 细菌，IPTG 诱导 6 小时；泳道3为用Ni-NTA树脂亲和纯化的SM0;泳道4为蛋白标准431。图2显示抗His标签抗体对SMO重组蛋白的flfestern blot鉴定结果。泳道1为 BL21/pET-15b/SM0 细菌，IPTG 诱导前；泳道 2 为 BL21/ pET_15b/SM0 细菌，IPTG 诱导 6 小时；泳道3为用Ni-NTA树脂亲和纯化的SM0。图3显示间接ELISA法检测不同免疫小鼠抗SMO抗体效价的对比结果。图4显示间接Elisa法测定单克隆抗体效价的结果。图5显示Western Blot检测制备抗体对于原核表达SMO蛋白的特异性结果。其中，图 5A:泳道 1 为 BL21/pET-15b/SM0 细菌，IPTG 诱导前；泳道 2 为 BL21/ pET_15b/SM0 细菌，IPTG诱导6小时；泳道3为用Ni-NTA树脂亲和纯化的SMO ；图5B:泳道1为纯化的 SMO重组蛋白；泳道2为纯化的H0AZ-1重组蛋白；泳道3为纯化的SSAT重组蛋白；图 5C:泳道 1 为 BL21/pET-15b/mSM0 细菌，IPTG 诱导前；泳道 2 为 BL21/pET_15b/mSM0 细菌，IPTG诱导6小时。图6显示Wesern Blot检测制备抗体对于真核蛋白的特异性结果。其中，图6A: 泳道1为人宫颈癌Hela细胞株；泳道2为转染ρ⑶NA3. 1 (+) /SMO的Hela细胞株；图6Β 泳道1为人Α549肺癌细胞株；泳道2为用多胺类似物CPEN处理的Α549细胞株；图6C: Cos7细胞株；图6D:小鼠B16-F1细胞株。图7显示所制备单抗通过免疫细胞化学分析真核细胞中SMO蛋白的表达情况 (父400倍)。其中A为人宫颈癌Hela细胞，未加入一抗；B为Hela细胞，加入一抗和二抗； C为转染ρ⑶NA3. 1 (+) /SMO的Hela细胞，加入一抗和二抗。图8显示制备单抗通过免疫荧光法分析真核细胞中SMO蛋白的表达情况(X 400 倍)。其中，(I): A.人宫颈癌Hela细胞，未加入一抗；B: Hela细胞，加入一抗和二抗； C: CPEN处理的Hela细胞，加入一抗和二抗。(II): A.人宫颈癌Hela细胞，未加入一抗； B: Hela细胞，加入一抗和二抗；C: CPEN处理的Hela细胞，加入一抗和二抗。(I)为FITC 荧光素标记的二抗，(II)为罗丹明荧光素标记的二抗。 图9显示制备单抗用于分析小鼠组织切片中SMO蛋白的表达情况(X 400倍)。图10显示制备单抗用于免疫沉淀分析的结果。图11为制备单抗用于流式细胞分析的结果。其中，A.人宫颈癌Hela细胞，未加入抗体；B: Hela细胞，未加入一抗；C: Hela细胞，加入一抗和二抗；D.转染ρ⑶NA3. 1 (+)/ SMO的Hela细胞，加入一抗和二抗。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明做进一步描述。以下实施例将有助于本领域普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。材料和方法 (1)化学试剂
Ni-NTA蛋白纯化树脂购自Qiagen公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、抗β-action和抗His标签单克隆抗体为Sigma公司产品；蛋白质分子量标准和PVDF膜购自BIO-RAD公司；ECL试剂盒购自Pierce公司；HRP标记的羊抗小鼠IgG多克隆抗体购自武汉博士德公司；其他化学试剂由Sigma和华美公司供应。多胺类似物CPENSpm由美国Johns Hopkins 大学医学院Robert A. Casero教授惠赠。(2)菌株、细胞与动物
宿主大肠杆菌BL21 (DE3)，骨髓瘤细胞SP2/0，人宫颈癌细胞株Hela，人肺癌细胞A549 为本研究所传代保存。6-8周龄雌性Balb/C小鼠由湖北省实验动物中心提供。实施例1、抗人精胺氧化酶的单克隆抗体的制备 USMO抗原的制备
将pET-15b/hSM0质粒(含人SMO全长编码DNA序列，即序列表SEQ ID NO :1所示的DNA序列，编码SEQ ID NO :2所示的蛋白质，本研究组前期工作中构建)转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，挑取成功转化的单克隆菌株转入含氨苄青霉素的LB培养液中培养。细菌生长至对数期时加入IPTG至终浓度1 mmol/L，于37 ！诱导培养6 h。分别取IPTG诱导前后菌液各200 L，离心去上清后，将细菌沉淀溶于40 L ddH20中，再加入10 L 5XSDS上样缓冲液，100 °C煮沸5 min后，进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，以确定SMO诱导性表达的效率。pET-15b/SM0质粒成功转化的大肠杆菌BL21 (DE3)细胞经IPTG诱导6小时后，细胞内合成出大量的重组SMO蛋白，在12%SDS-PAGE电泳分析中，其表观分子量( 63kd) 与理论预期值一致(图1)。放大培养并用IPTG诱导的E. coli菌用Buffer B (8 mol/L尿素，0. 1 mol/ L NaH2P04, 0. 01 mol/L Tris-HCl, pH 8. 0)裂解后离心后取上清，上清中所含SMO用 Ni-NTA树脂亲和层析纯化。所得SMO进行透析复性以去除尿素，透析缓冲溶液为50 mmol/ L Tris-HCl (pH 7. 4) ,250 mmol/L NaCl,0. 1 mmol/L EDTAU mmol/L DTT 和 0· 2 mol/L FAD，其中尿素含量分别为 5 mol/L (12 h)、2. 5 mol/L (12 h)、l mol/L (12 h)、0 mol/L (12 h)。将复性后的纯化蛋白样品用SDS-PAGE和Western blot进一步鉴定，最后对所纯化的蛋白进行浓度测定，置-40 °C保存备用。 转化大肠杆菌后，质粒pET_15b/SM0将在细胞内指导合成出带有6 XHis标签的重组SMO蛋白。为鉴定纯化所得蛋白的正确性，我们又用抗His标签的抗体对纯化蛋白 Western blot鉴定。结果证实纯化的SMO重组蛋白带有His标签，且分子量大小与理论预期值一致(图2)。2、动物免疫
选取4只6-8周龄，体重约20 g的雌性Balb/C小鼠为免疫接种对象。初次免疫用弗氏完全佐剂与纯化的SMO蛋白样品(50 g/只)等体积混合，经超声充分乳化后，背部皮下多点注射，4周后进行第二次免疫，用不完全弗氏佐剂和SMO蛋白(50 g/只)等体积混合，经超声充分乳化后，背部皮下多点注射，2周后进行第三次免疫，用不完全弗氏佐剂和SMO蛋白 (25 g/只)等体积混合，经超声充分乳化后，背部皮下多点注射。第三次免疫2周后进行一次加强免疫，无须佐剂，用SMO蛋白(25 g/只)每只小鼠，腹腔注射。加强免疫之后3天进行细胞融合。3、多克隆抗体血清效价检测
7取加强免疫后Balb/C小鼠的尾血并制备血清(多克隆抗血清)，ELISA法检测血清抗 SMO效价。方法为纯化的SMO蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为1 mg/L，用此溶液包被 96孔酶标板，每孔100 L0 4 ！包被过夜后再分别加入1 1 000 1 256 000稀释的SMO 抗血清，37 °C孵育1 h，洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG (1 5 000) 37 °C孵育1 h， 然后用TMB法显色。实验中以未免疫小鼠血清为阴性对照、PBS为空白对照，酶标仪测量每孔OD45tl值。以空白对照调零，待测孔OD45tl值与阴性对照孔OD45tl值的比值彡2. 1即判定为阳性。以能获得阳性的最大稀释度作为抗体的效价。用纯化SMO重组蛋白免疫Balb/C小鼠后，取血清间接ELISA法检测其抗SMO抗体效价。结果所选取的4只免疫小鼠中，以小鼠2血清效价最高(1 :1 000)(图3)。该小鼠的脾细胞备用作随后的细胞融合实验。4、细胞融合与杂交瘤细胞的筛选、克隆
加强免疫之后3天进行细胞融合。取抗血清效价高的免疫Balb/C小鼠的脾细胞， 用无血清培养液洗涤并计数，同时，收集对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗涤并计数，将二者以5:广10:1 (脾细胞SP2/0骨髓瘤细胞)的比例进行融合， 50% PEG 4 000溶液为融合剂。将融合细胞接种到含有饲养细胞的96孔培养板中，用HAT (含hypoxanthine/aminopterin/thymidine)培养液做选择性培养，第7 d后改用HT (含 hypoxanthine/thymidine)培养基，第17 d后改用M1-1640培养基培养。待杂交瘤细胞集落超过96孔板孔底的1/4面积时，取培养上请用间接ELISA法筛测定抗SMO抗体效价。经2-3次检测均为阳性者用有限稀释法进行单克隆化，选取能稳定分泌抗体的单克隆细胞株扩大培养作为建株细胞，置液氮中保存。用小鼠2的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后筛选所得的多个单克隆细胞株中，其中1株细胞能合成和分泌高效价的抗SMO单克隆抗体，即杂交瘤细胞株SP2/0-SM0。 经间接Elisa法测定，其效价达到1:512 000 (图4)。5、单克隆抗体的大量制备
采用诱生腹水法大量制备抗SMO单克隆抗体。预先1周在Balb/C小鼠腹腔注射石蜡油致敏，然后在Balb/C小鼠腹腔接种已建株的杂交瘤细胞，10 d后抽取腹水(可抽取多次)， 离心取上清即得单克隆抗体溶液，抗体置于-20 °C保存。实施例2、单克隆抗体的特异性分析 1、ELISA测定抗体效价
纯化的SSAT蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为lmg/L，用此溶液包被96孔酶标板，每孔100 L0 4 °C包被过夜后，加入稀释度为1 2 000 1 512 000抗SMO单抗溶液37 °C孵育1 h，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG (1 5 000) 37°C孵育1 h后，用TMB法显色。 抗体效价的确定同实施例1中“多克隆抗体血清效价检测”部分。2、Western blot检测抗体特异性
如下蛋白样品被用于Astern blot分析BL21 (DE3)空菌；pET_15b/SM0转化的BL21 (DE3 ) ;pET-15b/SM0转化并经IPTG诱导的BL21 (DE3 )，原核表达的钙网蛋白(CRT)、原核表达的人抗酶-1 (H0AZ1 )，原核表达与纯化的SSAT蛋白，人肺癌A549全细胞裂解液，多胺类似物CPENSpm (10 μ mol/L)处理M小时的A549全细胞裂解液，人宫颈癌Hela细胞全细胞裂解液，SMO高表达的Hela细胞(Hela/SMO)全细胞裂解液，非洲绿猴肾成纤维细胞Cos7细胞及小鼠黑色素瘤细胞B16全细胞裂解液。上述蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳后， 电转至PVDF膜。膜用5%的脱脂牛奶室温封闭2 h，加入本实验制备的鼠抗人SMO单克隆抗体，4 ！过夜，然后加入标记有HRP的二抗室温孵育1 h，ECL显色，X光片曝光记录结果。经Western blot分析显示，该单克隆抗体可与SMO原核表达蛋白特异性结合而不与其它无关带His标签蛋白结合(图5A和B)；另外，发现该单克隆抗体还能特异性识别小鼠原核表达精胺氧化酶mSMO (图5C )。经Western blot分析显示，该单克隆抗体可与真核细胞中变性条件的SMO特异性结合(图6)，可用于定性和定量分析；鉴于人与猴和小鼠的SMO蛋白的一级结构同源性高达98. 5%和95%，本实验另取非洲绿猴肾成纤维细胞Cos7细胞及小鼠黑色素瘤细胞B16全细胞裂解液做Western blot，结果表明该抗体可以识别猴和小鼠的SM0。3、SMO单抗用于免疫组织化学分析和免疫荧光分析
将对照Hela细胞和Hela/SMO细胞接种于置有小圆盖玻片的6孔板中以制备细胞爬片。培养M小时左右取出细胞玻片，以本实验制备的抗SMO单克隆抗体为一抗作免疫组化分析。将对照Hela，A549细胞和Hela/SMO细胞，经CPENS处理的A549细胞接种于12孔板中，培养M小时左右取出进行实验，以本实验制备的抗SMO单克隆抗体为一抗作免疫荧光分析。用所制备单抗通过免疫细胞化学和免疫荧光法检测Hela，Hela/SMO细胞中的SMO 蛋白表达情况(图7，图8 I )；有报道指出，多胺类似物CPENSpm处理诱导SSAT表达(王艳林，韩钰，袁太宁，等。CPENSpm通过干扰多胺代谢抑制肺癌细胞的增殖[J].中国药理学通报，2008，M (1):132-135.)的同时，也导致SMO的高表达。本实验中我们首先用多胺类似物CPEN处理人肺癌A549细胞，然后以本实验制备的单抗为一抗用于培养A549肺癌细胞的免疫荧光分析。结果显示，制备单抗可识别人培养细胞中的SMO蛋白(图8 II)。鉴于本单克隆抗体可识别小鼠的SM0，本实验中我们以此单抗为一抗用于小鼠6 种脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)组织切片的免疫组化分析。结果显示，制备单抗可识别鼠源的 SMO蛋白，并发现在分析的小鼠器官中，以肾脏中SMO的表达水平最高(图9)。4、SMO单抗用于免疫沉淀
收获Hela，和Hela/SMO细胞全细胞裂解蛋白各200 μ g ；各加入10 μ L SMO单克隆抗体，4°C缓慢摇晃孵育过夜；取20yL protein a琼脂糖珠，用细胞裂解缓冲液预处理后加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中，4°C缓慢摇晃孵育4 h，使抗体与protein a琼脂糖珠偶连；免疫沉淀反应后，用裂解缓冲液充分洗涤弃上清，最后加入40μ L的ddH20和10 μ L 5 X SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟，离心5000r/min ；取上清做^festern blot分析。用所制备单抗通过免疫沉淀实验检测Hela，Hela/SMO细胞中的SMO蛋白，取全细胞裂解蛋白各200 μ g做免疫沉淀实验，结果表明该单克隆抗体能与全细胞裂解液中的SMO 蛋白结合并沉淀下来(图10)。5、SMO单抗用于流式细胞术
流式细胞分析检测Hela，Hela/SMO细胞中的SMO蛋白表达情况(图11)，结果表明该制备单抗可用于流式细胞术实验。本发明利用E. coli原核表达系统，通过IPTG诱导高效表达出SMO重组蛋白，由于重组SMO的N末端含有6XHis标签，我们采用Ni-NTA树脂亲和层析法，成功表达纯化出人 SMO重组蛋白。以此重组蛋白为抗原免疫Balb/C小鼠，利用杂交瘤技术成功制备了人SMO 单克隆抗体。经ELISAJestern blot分析证实，本实验中用重组SMO制备的单克隆抗体能特异性识别原核表达的人及小鼠的SM0,能与其发生抗原-抗体反应，而不与其它带His标签的无关蛋白发生反应，真核细胞的Western blot实验证明，该抗体不仅能识别人SMO蛋白，还能识别猴，小鼠的SMO蛋白。该单克隆抗体能广泛应用于免疫组织化学，免疫荧光，流式细胞分析，免疫沉淀等实验研究，具有操作简单、检测速度快、灵敏度及准确性高的特点。
本发明通过杂交瘤技术制备出的SMO单克隆抗体，效价高、特异性强，具有广泛的实用价值和商业开发前景。
权利要求
1.一种杂交瘤细胞株SP2/0-SM0，其保藏编号为CCTCC C201159。
2.权利要求1的杂交瘤细胞株CCTCCC201159在制备抗人精胺氧化酶的单克隆抗体上的应用。
3.一种抗人精胺氧化酶的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1的杂交瘤细胞株CCTCC C201159分泌产生的。
4.权利要求3所述的单克隆抗体在定性或定量分析源自哺乳动物的精胺氧化酶中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中哺乳动物为人、小鼠或猴。
6.权利要求3所述的单克隆抗体在检测精胺氧化酶的应用，其中所述检测是通过免疫印迹分析、ELISA分析、免疫组织化学分析、免疫荧光分析、免疫沉淀或流式细胞术来进行的。
7.—种检测哺乳动物细胞中的精胺氧化酶的方法，该方法包括(1)将权利要求3所述的单克隆抗体与待检测的分离的哺乳动物细胞或该细胞的裂解液进行接触；(2)判断是否有阳性反应。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述阳性反应是通过免疫印迹分析、ELISA分析、 免疫组织化学分析、免疫荧光分析、免疫沉淀或流式细胞术来进行判断的。
全文摘要
本发明涉及一种高特异性、高效价的抗人精胺氧化酶的单克隆抗体、其制备方法及其应用。所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株CCTCC C201159产生。该单克隆抗体能识别包含人、小鼠和猴的哺乳动物的精胺氧化酶，并可以进行定性或定量分析，还可以广泛应用于免疫印迹、ELISA、免疫组织化学分析、免疫荧光分析、流式细胞术、免疫沉淀等实验研究中，用来检测精胺氧化酶。
文档编号C07K16/40GK102367436SQ201110263239
公开日2012年3月7日 申请日期2011年9月7日 优先权日2011年9月7日
发明者李春红, 杨建林, 王艳林, 蔡富强, 韩钰 申请人:三峡大学