专利名称：用于治疗组织炎症的新多肽的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域。本发明涉及多肽固相化学合成、多肽大规模纯化及冻干、理化性质测定、治疗应用等技术。
背景技术：
炎症是致炎因子 对机体的损害作用所诱发的以防御为主的综合性反应，是生理学和免疫学事件的一个完整的过程。炎症的特征是毛细管的扩张、白细胞的浸泡、发红、发热、疼痛和肿胀。多形核中性白细胞和嗜酸性细胞是主要的炎症介质和释放生长因子、细胞因子、前列腺素、白三烯和加剧组织损伤的蛋白酶的名单中的物质。以血管系统改变为中心的一系列局部反应，有利于清除消灭致病因子，液体的渗出可稀释毒素，吞噬搬运坏死组织以利于再生和修复，使致病因子局限在炎症部位而不致蔓延全身。因此，炎症是机体的防御性反应，通常对机体是有利的，如果没有炎症反应，人们将不能长期生存于这个充满致炎因子的自然环境中。但是炎症对机体也有潜在的很大危害性，严重的过敏反应可危及病人的生命；心包腔内纤维索性渗出物机化可形成缩窄性心包炎，进而影响心功能；发生于脑实质或脑膜的炎症可引起颅内压升高，甚至形成脑疝致使生命中枢受压而造成病人死亡；此外声带急性炎症水肿可导致窒息，等等。因此在一定情况下应采取措施控制炎症反应。英国Scripps研究院的Tamas Bartfai在一篇评论中解释说,在发生周围炎症之后，研究人员发现原炎性细胞素的IL-1 β脑脊髓液浓度可增高10000倍，主要是向大脑发出有关局部炎症信息的IL-1 β在脑脊髓液中的水平增高。鞘内给予可抑制IL-1 β产生或阻断神经元的IL-1 β受体的药物能明显地减少痛觉过敏。当采用系统性给药方式投用相同药物时，其抑制作用较差低浓度时是有效的。目前用于治疗炎症的抗炎药如免疫抑制剂、非甾类抗炎药、环氧合酶(C0X-2)抑制剂和蛋白酶抑制剂。但这些抗炎药中许多具有副作用。如非留体消炎药副作用，主要在胃肠道方面如胃肠道出血、胃溃疡等。蛋白酶抑制剂不良反应表现为，一些接受抗HIV治疗的患者在服用蛋白酶抑制剂后出现了脂肪的异常分布。因此，需要新的抗炎药的开发以减少或消除其带来的副作用。
发明内容
本发明的目是公布一种新的具有组织保护活性的多肽。该多肽含有8-15个氨基酸残基、分子量为900-1600道尔顿，实验结果表明具有多种组织保护活性。本发明多肽作为治疗组织炎症的主要成分具有新的医药用途。本发明公布了采用本发明多肽与一种或多种药物载体组合制备各种药物机型的方法以及本发明多肽对于各种组织炎症具有良好的保护，治疗和治愈作用。本发明多肽可通过多肽的固相化学合成获得。本发明公布了其序列、化学合成方法、纯化以及理化性能。
本发明多肽以多种方式给予很低剂量(通常为毫克或纳克/公斤体重)时即对几乎所有的器官和组织显示出保护作用。多项动物实验表明，本发明的多肽可以削弱由化学诱导引起的肝、肺、结肠和胃等组织的损伤，抑制炎性反应，减少消化道溃疡，减少肝脏和胆道的损伤，还具有抗焦虑和抗抑郁作用。可以促进血管生成、促进创伤愈合等，可以逆转由神经毒素MPTP诱导的帕金森症模型中的异常。另外，对于胃粘膜具有显著的保护作用，还可以缓解炎症反应。本发明 公布的多肽序列具有以下结构通式:XaaZaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro AlaAsp ZaaAla Xaa Xaa Xaa或者:[Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala]其中Xaa是中性脂肪族氨基酸残基，特别是Ala、bAla、Leu、lie、Gly、Val.Nle或Nva,Yaa是碱性氨基酸残基,特别是Lys、Arg、Orn或His,Zaa是酸性氨基酸残基,特别是Glu、Asp、Aad或Apm。本发明多肽的氨基酸序列的具体组合记录于序列表中。本发明的多肽合成后，可以做成游离态形式，也可以做成阳离子盐，如:TFA盐(三氟乙酸盐)，HCl盐(盐酸盐)，醋酸盐形式。本发明的多肽，选择和一种或多种药物载体组合，制成多种药物剂型，用于治疗。这些药物剂型涵盖:注射溶液、片剂、霜剂、胶囊、软膏、洗剂、舌含片等剂型局部或全身给药。剂量优选在10_5 10_2mg/kg体重的范围内，以0.1%-0.5%的较高浓度全身或局部给药。对于具体治疗的最佳剂量的确定是本领域技术人员熟知的。具体实施方法实施例1:多肽的化学合成及纯化:以SEQ ID No所示的氨基酸序列为例化学合成多肽。采用Fmoc固相法合成:采用固相合成仪器，选用0.5克的val-2氯三苯甲基树脂为起始树脂，合成反应管中依次加入:Fmoc-leu, Fmoc-gly, Fmoc-ala, Fmoc-Asp (otbu)fmoc-asp (otbu), Fmoc-ala,Fmoc-pro, Fmoc-lys (boc)，FMoc-gly, FMoc-pro, Fmoc-pro, FMoc-pro, Fmoc-Glu(otbu),Fmoc-gly.
试剂瓶中加入DIC/DMF溶液和H0BT/DMF溶液和DMF溶液。启动合成仪器连接电脑，输入合成程序，开始合成。合成的后处理:把树脂从合成反应柱中取出，放入一底部有烧结玻璃滤片的玻璃容器中，分别依次用DMF ( 二甲基甲酰胺)，DCM( 二氯甲烷)，MeOH(甲醇)，DCM, Me0H5_10倍的树脂体积冲洗树脂。冲洗后的树脂冷冻干燥。树脂冲洗完毕，另取一带玻璃塞的试管，配置20毫升裂解试剂，配置方式如下:(1):加17.5毫升TFA (三氟乙酸)于试管中(TFA有强腐蚀性和挥发性，应在通风厨中操作)
(2):加 EDC0.5 毫升(3):加 thioanisole I 毫升(4):加 anisole0.4 毫升以上试剂 都加入后，轻微震荡混匀，加入放入树脂的玻璃容器中。反应2.5小时。待反应完毕，用真空抽滤的办法分离树脂和裂解试剂。把裂解试剂放入一球形烧瓶中，用旋转蒸发的办法减压蒸去液体物质，只留下固体。另取100毫升的冷乙醚加入球形烧瓶中，此时有大量的白色沉淀物质，为粗多肽。离心分离乙醚和多肽。丢弃上清乙醚，多肽继续用冷乙醚洗涤，离心，得到多肽粗品。多肽粗品用冻干机冻干，用于下一步纯化。合成产物的纯化:多肽粗品I克，溶于5毫升的纯水中，过滤，上制备级高效液相色谱。色谱配40*250mm的C18反相柱。流动相:A相0.1 %的TFA+水B 相 0.1 % 的 TFA+ 乙腈。采用程序:B在40分钟内从5%上升到55%，收集主峰，得到溶于流动相的多肽纯
品O上述溶液状态的多肽，采用低温旋转蒸发方式初步浓缩，然后用冻干机冷冻干燥。得到纯品。纯品的质谱
图1及HPLC图2见说明书附图。实施例2:稳定性试验将本发明多肽于40°C保温76天和120天测试其稳定性。稳定性试验采用HPLC方法进行测定。水溶液中多肽的浓度为0.2% (w/v):柱，Kromasill00，5u，250x 4.6mm ;流动相，0.1 %三氟乙酸的水/乙睛溶液(O至50vol.%)，在25分钟内梯度洗脱，流速lml/min ；检测:UV，218nm。为了进行比较，使用游离的多肽及其单乙酸盐。表I
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权利要求
1.一种多肽，其特征是，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ ID No所示的氨基酸序列的多肽。
2.权利要求1记载的多肽，其特征是，含有8-15个氨基酸残基、分子量为900-1600道尔顿并且具有多种组织保护活性。所述多肽具有结构通式:Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa YaaPro Ala Asp Zaa Ala Xaa XaaXaa或者:[ZaaProProProXaaYaaProAla], 其中乂8&是中性脂肪族氨基酸残基，特别是41&4么1&、1^11、116、617、￥&1、犯6或化&， Yaa是碱性氨基酸残基,特别是Lys、Arg、Orn或His, Zaa是酸性氨基酸残基,特别是Glu、Asp、Aad或Apm。
3.一种药物制剂，其特征是，权利要求1或2记载的多肽，选择与一种或多种药物载体组合，制成多种药物剂型。这些药物剂型涵盖:注射溶液、片剂、霜剂、胶囊、软膏、洗剂、舌含片等剂型局部或全身给药。
4.权利要求1、2或3记载的多肽 或药物制剂用于组织炎症的治疗。
全文摘要
一种用于治疗组织炎症的多肽，公布了多肽的序列，结构以及制备方法。作为一种医药组合物，具有良好的组织，器官保护作用，可用于抗炎制剂。
文档编号C07K7/06GK103087151SQ201110280490
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者不公告发明人 申请人:赵婷