专利名称：一种植物渗透或水分变化原初感应的蛋白分子、及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种植物体内的渗透变化或水分感应的蛋白分子、及其基因和应用。
背景技术：
植物感知、适应逆境涉及一系列复杂的基因表达网络调控，细胞受到逆境胁迫之后，通过感应分子的作用能迅速感知外界信号，依靠复杂的信号转导途径，一方面激活特定转录调控因子，与特定的顺时作用元件结合，进而调控目标基因的转录表达，另一个方面， 在翻译后水平激活特异的修饰蛋白，调节靶蛋白和靶基因，最终提高植物的耐逆性。植物在从感知胁迫的信号到基因表达产生适应性的过程中，进化出一系列复杂机制以最大限度减轻胁迫伤害，其中一些基因在快速应答的过程中起了至关重要的作用，它们成为将物理性的逆境信号，如干旱、高温、低温等逆境，转化为生化信号的原初载体，脱水或渗透势的变化是这类逆境反应的共同特征，即引起细胞模形变的机械刺激，在转录水平上，植物中发现了一类快速应答诱导基因，命名为ERD基因(脱水诱导早期应答基因) (Taji T，et al.，1999)，主要结果局限在拟南芥的研究，然而原初的信号接收分子，却一直是一个不解之谜。在拟南芥中已经找到16个ERD成员，这些基因分别属于叶绿体ATP蛋白依赖酶， 热激蛋白hsp70-l和hsp80-2、质膜蛋白、脯氨酸脱氢酶、糖转运蛋白、衰老诱导基因，硫代谷胱甘肽转移酶、II型LEA蛋白、茉莉酸甲酯合成酶和泛素蛋白等。ERDl基因是拟南芥中研究比较深入的一个脱水诱导早期应答基因，编码一个类似叶绿素蛋白酶的调节亚基(Nakashima K, et, al. 1997，Lam-Son P T, et, al. ,2007) ERD2、ERD8和ERD16受干旱胁迫强烈表达，分别属于热激蛋白hsp70-l、hsp80-2和泛素蛋白(Kiyosue T，et, al.，1994)。ERD4编码一个膜蛋白，推测有9个跨膜区，但它的功能目前还不清楚(Froehlich J E，et, al，，2003)。ERD5编码脯氨酸脱氢酶O^roDH)，催化脯氨酸转化成谷氨酸的第一步反应(Nakashima K，et, al.，1998)。ERD6是在拟南芥干旱胁迫 Ih后获得的，研究表明该基因编码的蛋白具有12个跨膜区，并且有一个亲水中心，属于糖转运蛋白，受干旱和冷诱导表达(Kiyosue T，et, al, .1998)。ERDlO和ERD14属于II型 LEA蛋白家族(Kiyosue T，et，al.，1994)。ERD14在磷酸化的状态下具有离子结合的活性， 主要结合Ca2+和!^e2+离子，它的作用机制还在研究中(Muath KA，et，al.，2003)。ERDll和 ERD13编码的产物属于硫代谷胱甘肽转移酶(Kyiosue T，et, al.，1993)。ERD15可能是一个新的与ABA信号胁迫相关的调节器，该基因的功能和作用机制还需要深入研究(Kariola T，et, al.，2006)。综上所述，在拟南芥中获得的16个ERD基因属于不同的基因家族，作用不同的代谢途径，它们可能分别通过感知并传递信号胁迫，产生功能蛋白，参与重要的代谢反应，降解毒素等不同的方式增强拟南芥的耐逆性。水分的重要性不言而喻，越来越严重的干旱等逆境胁迫对作物产量的影响尤为严重，从感应水分的原初反应出发，发掘关键的分子开关基因，并对其功能进行深入的解析， 从而利用这一分子的特性，不仅可以为抗旱(逆)育种提供具有巨大应用价值的基因资源， 也可以为人类应对水分的流失或皮肤的衰老提供全新的防护理论。
发明内容
本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了这一发明。本发明的目的是提供一种植物体内的渗透或水分变化感应的蛋白分子。本发明的再一目的是提供一种植物体内的渗透或水分变化感应的基因。本发明的再一目的是提供上述植物体内的渗透或水分变化感应蛋白分子的应用。根据本发明的植物体内的渗透变化或水分感应的蛋白分子，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1 所示。根据本发明的植物体内的渗透变化或水分感应的基因，编码上述蛋白分子，优选地，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。本发明还提供了上述植物体内的渗透或水分变化感应的蛋白分子作为钙离子通道的应用。钙离子作为细胞的第二信使，其胞内浓度的变化或者说波动，可以启动一系列的生理反应过程，根据本发明的技术方案，所述钙离子通道的定义为钙离子通道是可以介导钙离子快速跨膜转运的分子结构，细胞内钙离子的波动，主要是依赖钙离子通道的调控。细胞的渗透势可以帮助维持细胞的形状，物质的流动，渗透势的变化，反应细胞内水分和离子浓度的变化，也会引起细胞形状的变化。本发明发明阐述了 AtERDRTOS分子，据二级结构分析具有两个明显的功能区，首先是作为水分变化的感应分子，其中一部分(如膜外结构域)能感知渗透势引起的细胞膜的轻微变动，并将这种变化传导到分子的另一部分(通道结构域)，通过这一分子的通道结构部分，行使钙通道的功能，将原初感知、传递和启动钙第二信使合为一个分子，这也是本发明的一个最重要的特性，也是30多年来，很多研究者孜孜以求，而未发现的原初信号感应、接收分子。本发明还提供了包含上述植物体内的渗透变化或水分感应的基因的植物表达载体。本发明还提供了上述植物体内的渗透变化或水分感应的蛋白分子用于感应植物体内的渗透变化或水信号变化的应用。进而，本发明还提供了上述植物体内的渗透变化或水分感应的蛋白分子用于植物抗旱的应用。本发明首先选定具有跨膜结构域的ERD4和ERD6类似同源基因家族为研究对象， 将15个⑶S克隆到pcDNA3. 1，转化CHO细胞，获得了多个转化的细胞株，通过Fura2荧光检测筛选，转化AtERDRT08 (At4g22120)的细胞株与转化空白质粒pcDNA3. 1对照细胞株相比，经过高渗溶液处理，可获得显著瞬时上升的钙信号(图1)，同时获得了 AtERDRTOS相关基因的T-DNA突变体库，然后利用不同的逆境因子处理，获得了同一个基因的两个耐高渗胁迫的纯和突变体株系，具有强烈抵御高渗的能力，进一步分析发现，这一基因可对渗透势的变化作出快速而精细的反应，介导钙离子的快速内流，类似动物中冷、热的感受通道的变化，具有去敏化的钙通道特征。渗透势的变化是冷、热、干旱逆境反应的共同特征，也是水分变化的本质，通过比对发现AtERDRTOS的同源基因存在于已知的所有多细胞生命体，因此， 这一分子有可能是多细胞生物体感受水分或渗透变化的分子感应通道。具体地，根据本发明的实施例，首先从拟南芥(Arabdopsis t)中克隆了 ERD相关基因的15个同源CDS，转化动物细胞CHO筛选到转化AtERDRT08基因(At4g22120)的细胞株具有明显的渗透刺激钙信号，通过鉴定获得T-DNA插入突变体，观察突变体植株在高渗处理条件下的萌发和生长情况，发现突变体生长优于野生型，由此初步验证了 AtERDRTOS基因对水分变化信号的快速感应；进一步，利用双电极电压钳技术(TEVC)和体外异源表达系统-非洲爪蟾卵母细胞，表达分析了 AtERDRT08离子通道活性、发现AtERDRT08为一个Ca2+ 通道，而且在高渗处理时通道活性可以快速改变。虽然ERD基因发现已经10多年的时间了， 但是大多数的工作主要集中在转录水平的研究，即水分逆境诱导的转录水平变化。原初信号的接收分子功能一直无从知晓，解析何种分子将机械刺激的信号转化为具有生理功能的生化信号，是RaSmUSSen1978年提出钙第二信使之后，30多年来，人们追求的目标，至今为止，世界范围内没有任何的报道，本发明通过推测，利用异源细胞系(CHO)转化基因，经过渗透刺激筛选引起早期(1分钟之内)钙信号的膜蛋白基因，发现了具有感应和钙通道活性的分子，这一分子可以将渗透变化的原初机械刺激信号转化为生化的钙第二信使信号，在高渗刺激时，通道活性可以导致细胞内钙流的快速波动，形成具有脱敏特性的钙波-钙第二信使，由此启动应对水分变化的下游生理过程，包括诱导应答基因的表达、行使生理功能等。本发明为有效利用这一基因资源打下了坚实的基础。
图1、拟南芥AtERDRT08基因的克隆，AtERDRT08基因的PCR扩增产物和pEASY_Tl 重组质粒的酶切及PCR鉴定，其中，图 IA :M 为 Marker III (TransGene) ；lane2 为 AtERDRT08 的 PCR 结果；图 IB :M 为 Marker III (TransGene) ；Ianel 为 AtERDRT08 的 BamHI/Xbal 酶切结果；图 1C:M 为 Ikb plus marker (TransGene) ；lanel，9，10，12，15 为菌落 PCR 检测结^ ο图2、拟南芥AtERDRT08转化CHO细胞，检测钙荧光反应。图3、Aterdrt08T-DNA纯合突变体的鉴定，图 3A 为基因组鉴定结果，M 为 Marker III(TransGene) ；lanel，2，3，4，5，7，8，9， 10，11，12，13 为 T-DNA insertion 检测结果，WT 为野生型(Col-O)。图;3B =WT为野生型^ol-O) ；lane2为Aterdrt08的RNA检测结果，表示为纯合突变体。图4、Aterdrt08表现出强烈地抵御高渗的能力图4A 左图为1/2MS培养基的结果；右图为含300mM甘露醇的1/2MS培养基的结果，图中右为Aterdrt08 ；左为野生型Col-O ；图4B 突变体莲座叶的失水实验左为Aterdrt08 ；右为野生型Col_0。图5、拟南芥AtERDRT08表达载体的构建与鉴定图 5A 左lanel，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，16 为 pCAMBIA1302 菌落PCR检测结果，M 为 Marker III(TransGene)；右M为MarkerIII(TransGene) ；Ianel 为 pCAMBIA1302 的BamHI/Xbal 酶切结果。图 5B :lanel，2，3，5，6，7 为 AtERDRT08 启动子 ρΒΙΙΟΙ. 1 菌落 PCR 检测结果；M 为 Marker III (TransGene)。图6 :AtERDRT08定位于原生质体质膜从左至右依次为可见光、红光、绿光和红绿融合图7 :AtERDRT08具有感应渗透变化的典型反应、Ca2+通道活性和去敏化特征，介导 Ca2+的瞬时内流A 基本浴液为IOmM MES-TRIS pH5. 6，1. 8mM氯化镁，2mM氯化钙，30mM氯化钠， 150mM甘露醇；B :10mM MES-TRIS pH5. 6，1. 8mM氯化镁，30mM氯化钙，300mM甘露醇，溶液灌流具体方式如图7所示。图8为pGEMHE载体图。
具体实施例方式实施例1 拟南芥AtERDRT08基因的克隆提取生长4周的拟南芥总RNA并以其为模板，以Oligo dT为引物作逆转录，反应完成后取1 μ 1逆转录产物作为模板，以At4g22120特异引物ERDRT8F和ERDRT8R进行PCR 扩增。结果得到约2. 3kb左右的单一产物(图1A)。将此扩增条带纯化回收后，与peasyTl Vector连接的重组质粒，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α。挑取单克隆质粒进行酶切检测(图1Β)及菌落PCR鉴定(图1C)后，选取阳性克隆并测序。ERDRT8F :ATGGCGACACTTCAGGATATTGGERDRT8R TTAGACTAGTTTACCACTAAAGAtERDRT08的cDNA序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列如下SEQ ID No. 1 MATLQDIGVS AGINILSAFV FFIIFAVLRL QPFNDRVYFS KffYLKGLRSSPARGGAFAQR60FVNLDFRSYM KFLNWMPEAL KMPEPELIDH AGLDSVVYLR IYffLGLKIFTPIAVLAffAVL120VPVNWTNNTL EMAKQLRNVT SSDIDKLSVS NIPEYSMRFff THIVMAYAFTIffTCYVLMKF180YETIA匪RLQ FVASEARRPD QFTVLVRNVP PDADESVSEL VEHFFLVNHPDHYLTHQVVC240NANKLADLVK KKKKLQNWLD YYQLKYARNN SQRIMVKLGFLGLffGQKVDA IEHYIAEIDK 300ISKEISKERE EVVNDPKAIM PAAFVSFKTR WAAAVCAQTQ QTRNPTQffLTEffAPEPRDVF360WSNLAIPYVS LTVRRLIMHV AFFFLTFFFI VPIAFVQSLA TIEGIVKAAPFLKFIVDDKF420MKSVIQGFLP GIALKLFLAF LPSILMIMSK FEGFTSISSL ERRAAFRYYIFNLVNVFLAS480
VIAGAAFEQLNSFLNQSANQ IPKTIGVAIP MKATFFITYI MVDGWAGVAG
EILMLKPLIM540
FHLKNAFLVKTDKDREEAME)PGSIGFNTGE PRIQLYFLLG LVYAPVTPML
LPFILVFFAL600
AYIVYRHQIINVYNQEYESA AAFWPDVHGR VIAALVISQL LLMGLLGTKH
AALAAPFLIA660
LPVLTIGFHHFCKGRYEPAF IRYPLQEAMM KDTLETAREP NLNLKGYLQN
AYVHPVFIffiD720
EDDYDIDDKLGKFEDEAIIV PTKRQSRRNT PAPSIIS⑶D SPSLPFSGKL
V771
SEQ ID No.2
atggcgacacttcaggatattggtgtatcagctgggataaacattctcagtgcctttgtt60
ttcttcataatctttgcggttttgaggcttcagcctttcaatgatagagtttacttctca120
aaatggtatctcaaggggttaagaagcagccctgctcgtggtggcgcctttgcgcagagg180
tttgtgaacctggacttcaggtcttatatgaagttcttgaattggatgccagaggctctg240
aagatgcctgagcctgagcttattgatcatgctggtttggattcagttgtttatctccgg300
atttactggctggggcttaagatctttactccaatagcagtgcttgcttgggcagttctt360
gtgccagtcaactggactaataacacattggagatggctaagcagttaaggaatgtaact420
tcgagcgacattgacaaactctctgtttcaaatattccagagtattcaatgaggttttgg480
actcatatagtaatggcttatgcctttaccatctggacttgttatgtgctgatgaaagaa540
tatgagacaattgctaacatgaggctccagtttgttgcatcagaagctcgtcgacctgac600
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aatgcaaacaagctggccgatttggtgaaaaagaagaaaaagctgcagaattggcttgat780
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cttgggctatggggacaaaaagtcgatgccattgaacattacattgctgaaattgacaaa900
atatcaaaagagatcagtaaagaaagagaggaagtggtgaatgatcctaaggccattatg960
ccagcagcgtttgtctcctttaaaacacgatgggctgctgCggtttgtgCtcagactcaa1020
cagacccgaaacccaacccaatggctgaccgaatgggctccagaaccgcgtgatgtgttt1080
tggtcaaatcttgctattccatatgtttctctgacagtaaggaggttgatcatgcatgtt1140
gccttcttcttcctaaccttcttcttcattgtccccatcgcgtttgttcaatctcttgct1200
accattgaagggattgtgaaagctgctccgttcttgaagtttattgtagatgataaattc1260
atgaaatcggtgatacaaggtttccttccgggtattgcactgaagcttttcctcgccttt1320
ctgccatccattttgatgatcatgtccaaatttgaaggcttcacatcgatctcatcttta1380
gagagacgagcagcgtttcgatattacatcttcaacttagtgaacgtctttcttgctagc1440
gttatcgctggagctgcgtttgaacagcttaactctttcctcaatcaatccgcaaaccaa1500
cltCCCCclclclclccattggtgtggcgataccgatgaaagcaactttcttcatcacgtatata1560
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ttccatctcaaaaacgccttcttggttaagactgataaagacagagaggaagcaatggac1680
ccgggaagcattggttttaacacgggtgagcctcggatacagctctactttcttctcggt1740
cttgtctacgctcctgtgacaccgatgcttcttccttttatcttggtcttcttcgccctt1800
gcttacattgtatatcgccaccaaatcattaacgtatacaatcaagaatacgagagtgct1860
gcagcgttttggccagacgttcatggacgagtcatagcagcattggtaatatcacagttg1920
cttctgatgggtctattgggaacaaagcacgctgcattagctgcaccgtttctcattgct1980
ttgcctgtgcttaccattggtttccaccacttctgcaaaggtcgttatgagccagctttc2040
atcagataccctttacaggaagctatgatgaaagatacattagaaaccgcaagagaacca2100
aacctgaaccttaaaggctacttgcaaaatgcttacgttcatccggttttcaaaggcgat2160
gaagacgattatgacattgatgacaagctcgggaagtttgaggatgaagccattattgtt2220
cccaccaaacgtcagtcgaggagaaatactccggctcctagcataatcagtggggacgat2280
tcgccgtctttgccctttagtggtaaactagtctaa2316实施例2 拟南芥AtERDRT08基因感应高渗刺激，介导钙离子内流。克隆AtERDRT08基因，构建pcDNA3. 1载体，转染CHO细胞，筛选稳定表达的细胞系，Fura2染色，含有IOmM CaC12的高渗和等渗溶液灌流，通过荧光显微镜观察记录，经过高渗和等渗处理的细胞系，发现高渗处理可以记录到明显的钙离子内流，即钙离子的荧光， 恢复等渗溶液后，荧光消失，表明AtERDRTOS具有感应高渗刺激的功能，同时，还可以转化为生化信号，即钙离子的内流波动(图2)，以其他粒子取代灌流液中的钙离子，未观察到荧光信号变化。实施例3 拟南芥AtERDRT08基因T-DNA插入突变体的获得以及表型分析购买AtERDRTOS基因的T-DNA插入突变体，采用“双引物法”对突变体进行鉴定 (图3A)，然后挑选鉴定为纯和插入突变的植株提取RNA进行鉴定(图:3B)。结果显示已经成功获得该基因的插入突变体。将获得突变体种子与野生型的种子一起进行高渗处理(在1/2MS培养基中加入 300mM的Marmitol)，结果发现突变体的生长状况都优于野生型植株(图4A)，此外还发现与野生型相比，突变体植株失水更快(图4B)。证明AtERDRTOS在植物早期脱水反应过程中发挥作用。实施例4 拟南芥AtERDRTOS基因的真核表达载体的构建及亚细胞定位分析1、拟南芥AtERDRT08表达载体的构建将拟南芥AtERDRT08构建到pCAMBIA1302载体中(该载体购自hvitrogen公司)，将该基因上游2.0Kb的片段作为启动子区构建到ρΒΙΙΟΙ. 1载体中(该载体购自 Invitrogen公司)，转化大肠杆菌后，提取质粒并检测(图5)。2、重组质粒的瞬时表达将构建好的pCAMBIA1302: :AtERDRT08质粒，通过PEG介导转化拟南芥原生质体， 进行瞬时表达，在激光共聚焦显微镜下观察AtERDRTOS在细胞内的定位(图6)。实施例5 拟南芥AtERDRT08基因的电生理功能分析将拟南芥AtERDRT08基因构建到pGEMHE载体(该载体最先由Harvard Medical School的Liman等将非洲爪蟾的一个β -globin基因的3，-UTR和5，UTR引入pGEM_3Z 载体改造而成,本实验所用的pGEMHE载体由University of California at Berkeley的 Dr. E Y. Isacoff赠与，载体结构图参见图8)(载体鉴定如图5A)，以特异引物M13和M13R进行PCR扩增，将产物做Capping RNA，通过显微注射技术将其注射到Xenopus oocytes中表达约2天，再利用TEVC (Two-electrode voltage-clamp)技术对AtERDRT08基因做电生理分析。结果表明该基因具有Ca2+通道活性，而且高渗灌流(300mM Mannitol, IOmM HEPS pH7. 4, IOmM CaCl)时，介导Ca2+的瞬时内流，具有典型去敏化特征，用同样的溶液刺激，Ca2+ 的瞬时内流越来越小；当灌流液中Mg2+取代Ca2+，纪录不到明显的阳离子内流，用其他的单价阳离子(K+、Na+、Li+、NH4+)得到相似的结论。因此，结合CHO的钙离子荧光的测定结果 (实施例2)，AtERDRTOS在异源系统中表达，可以特异的选择Ca2+，不选择其他的单价阳离子K+、Na+、Li+、NH4+和Mg2+、Ba2+等二价阳离子，阴离子的变化也不影响其活性，只介导Ca2+ 的内流，离子通道的活性被渗透势变化调节，高渗透势激活者一同到活性，说明本发明的分子为感应渗透变化的Ca2+通道。
权利要求
1.一种植物体内的渗透水或分变化原初感应的蛋白分子，其特征在于，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。
2.一种植物体内的渗透或水分变化原初感应的基因，其特征在于，编码权利要求1所述的蛋白分子。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
4.权利要求1所述的蛋白分子作为接受机械刺激信号的应用。
5.权利要求1所述的蛋白分子作为钙离子通道的应用。
6.包含权利要求2所述基因的植物表达载体。
7.权利要求1所述的蛋白分子用于感应植物体内的渗透变化或水信号变化的应用。
8.权利要求1所述的蛋白分子用于植物抗旱和水分胁迫的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种植物体内的渗透或水分变化原初感应的蛋白分子、及其基因和应用。根据本发明的植物体内的渗透变化或水分感应的蛋白分子，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明，通过鉴定AtERDRT08T-DNA插入突变体，观察突变体植株在高渗处理条件下的萌发和生长情况，发现突变体生长优于野生型，由此初步验证了AtERDRT08基因对水信号的感应；进一步，发现AtERDRT08为一个Sensor-like Ca2+通道，这一分子可以将渗透变化的原初机械刺激信号转化为生化的钙的第二信使信号，在高渗刺激时，通道活性可以导致细胞内钙流的快速波动，形成具有脱敏特性的钙波-钙第二信使，由此启动应对水分变化的下游生理过程。本发明为有效利用这一基因资源打下了坚实的基础。
文档编号C07K14/415GK102329383SQ20111028557
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者李乐攻, 田望, 郝艳丽 申请人:首都师范大学