专利名称：一种利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种利用工业废酵 母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法。
背景技术：
我国酵母资源丰富，特别是工业废酵母，从资源综合利用角度考虑，可以使用废酵母制备葡聚糖和甘露聚糖，实现产业化生产。不仅可以增加经济效益，还能解决环境污染问题(朱俊东，黄国荣等，啤酒酵母中提取核糖核酸的研究[J]，食品科学， 2006(27) 160-162)。酵母β _葡聚糖具有独特的三股螺旋结构，其螺旋外侧有一些亲水基团，能与机体的免疫细胞受体特异性结合，刺激其处于高度活性状态，其能刺激体液免疫和细胞免疫， 具有非特异性免疫机制和造血功能(Bohn et al, 1995 ；DiLuzio et al, 1985 ；Wagnerova et al，1991)。甘露聚糖通过充当免疫刺激辅助因子来调节免疫系统，提高机体的免疫应答能力(Ballou et al, 1980) 国内外曾有人分别采用碱法、酸碱法、酶碱法等提取酵母葡聚糖，但这些工艺酸碱用量大，对环境污染严重，所得产品得率低，纯度低(钟文辉，李文明等，1996)，(Spiros J，Chokyun R et al, US 5028703)。另外，还有单独提取葡聚糖的专利(杜昱光，余亦珂等，CN101748172),(王庆华，刘山等，CN101560269A),(徐泽平，杨传伦等 CN101353383B) 或单独提取甘露聚糖或甘露糖蛋白(俞学锋，李知洪等，CN102051400A)，(胡博然， CN1986829A)。这些方法的特点大多是破坏性的方法去掉另一种组分(多糖或蛋白质)而得到单一的产品。不仅浪费原料，而且不利于环境的保护。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法，该方法不仅可以一次性提取三种酵母细胞壁中的活性物质，而且可降低废酵母排放对环境的污染，是一种变废为宝的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下—种利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法，它包括如下步骤(1)以工业生产后的废酵母为原料，加碱溶液洗涤萃取，调pH值至中性后离心，上清液含甘露糖和蛋白，沉淀含葡聚糖；(2)将步骤(1)得到的含甘露糖和蛋白的上清液，加入正丁醇和氯仿的混合溶液， 剧烈震荡后离心，得上、中、下三层，上层为清液含甘露糖，中层含蛋白，下层为氯仿层；(3)将步骤(2)得到的上层清液减压浓缩后加入甲醇沉淀，再离心，干燥得到甘露糖粉末；(4)将步骤(2)得到的中层经喷雾干燥或甲醇沉淀得到蛋白质固体；(5)将步骤(1)得到的含葡聚糖的沉淀加水溶解后经超声破碎，加入蛋白酶酶解，再加NaOH溶液保温反应后离心得沉淀，经无水乙醇洗涤，再经乙醚洗涤，干燥后得到葡聚糖粉末。步骤(1)中，所述的碱溶液为氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液，碱溶液质量百分浓度为2 4%，碱溶液的重量为废酵母干重量的3 8倍。步骤(1)中，调pH值至中性时，一般使用1.5 3mol/L的HC1。步骤(2)中，所述的正丁醇和氯仿的混合溶液，其中正丁醇和氯仿的体积比为 1 (4 5)；含甘露糖和蛋白的上清液与正丁醇和氯仿的混合溶液的体积比为5 (1 3)。 步骤(3)中，减压浓缩温度为60 85°C，减压浓缩至原体积的30 50%。步骤(3)中，甲醇的加入量为浓缩液体积的3 5倍，沉淀条件为在0 7°C冰箱中放置6 24h。步骤(3)或(5)中，干燥条件为40 80°C下干燥8h 24h。步骤⑷中，喷雾干燥温度为120 160°C，所述的甲醇沉淀，甲醇的加入量为中层蛋白层体积的3 5倍，沉淀条件为在0 7°C冰箱中放置6 24h。步骤(5)中，沉淀加水溶解，水的重量为沉淀重量的1 3倍；超声破碎条件为 300 600W超声破碎20mi 50min。步骤(5)中，所述的蛋白酶为中性蛋白酶或碱性蛋白酶，酶的用量为500 5000U/ g沉淀，酶解反应时间为2 12h。步骤(5)中，所述NaOH溶液的浓度为3 5wt %，NaOH溶液的加入体积为酶解液体积的1 3倍，加NaOH溶液的反应温度为80 90°C，反应时间为2 6h有益效果本发明的优越性在于1、以工业废酵母作为原料生产的葡聚糖可以用于食品、医药、化妆品、造纸和建筑材料等行业，甘露糖可用于食品、饮料的添加剂，对糖尿病人、肥胖症、便秘和高胆固醇等疾病患者有良好的辅助治疗作用；2、通过对传统工艺的改进和优化，利用高温、加压、超声、酶制剂、浓缩等方法，一次提取葡聚糖和甘露糖蛋白，缩短生产时间，相比独立生产三种产品工序少，成本低，提取率能高达到24%、8. 7%和2% ；3、利用工业废酵母提取活性多糖和蛋白质，不仅变废为宝，而且大大提高了其附加值；4、减少工业废酵母的排放，对环境保护具有重要意义。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 (1)以工业生产后的废酵母(来源于啤酒厂商)为原料，加KOH溶液，KOH溶液的重量为废酵母干重量的3倍，洗涤萃取2h，用1. 5mol/L HCl调pH值至中性后离心，上清液含甘露糖和蛋白，沉淀含葡聚糖。(2)将步骤(1)得到的含甘露糖和蛋白的上清液，加入正丁醇和氯仿的混合溶液，正丁醇和氯仿的体积比为1 4，含甘露糖和蛋白的上清液与正丁醇和氯仿的混合溶液的体积比为5 1，剧烈震荡后离心，得上、中、下三层，上层为清液含甘露糖，中层含蛋白，下层为氯仿层。(3)将步骤(2)得到的上层清液85°C减压浓缩至原体积的30%，然后加入3倍体积量的甲醇，在4°C冰箱中放置6h，沉淀，离心得到甘露糖固体，60°C下干燥8h得到甘露糖粉末。
(4)将步骤⑵得到的中层经120°C喷雾干燥或加入3倍体积的甲醇，在4°C冰箱中放置6h，沉淀得到蛋白质固体。(5)将步骤⑴得到的含葡聚糖的沉淀加1倍重量的水溶解后经300W超声破碎 20min，调pH6，室温下加中性蛋白酶(500U/g沉淀)酶解2h，再加3wt% NaOH溶液80°C下保温反应2h后离心得沉淀，NaOH溶液的加入体积为酶解液体积的1倍，经无水乙醇洗涤2 次，再经乙醚洗涤1次，60°C干燥8h后得到葡聚糖粉末。制得的酵母葡聚糖为浅褐色粉末，得率为20. 2%，纯度48. 3%。甘露糖蛋白为黄色粉末，得率为5%，纯度68%。蛋白质得率为1. 1%，纯度85%。实施例2 (1)以工业生产后的废酵母(来源于啤酒厂商)为原料，加3wt% KOH溶液，KOH溶液的重量为废酵母干重量的5倍，洗涤萃取4h，用2mol/L HCl调pH值至中性后离心，上清液含甘露糖和蛋白，沉淀含葡聚糖。(2)将步骤(1)得到的含甘露糖和蛋白的上清液，加入正丁醇和氯仿的混合溶液， 正丁醇和氯仿的体积比为1 5，含甘露糖和蛋白的上清液与正丁醇和氯仿的混合溶液的体积比为5 1，剧烈震荡后离心，得上、中、下三层，上层为清液含甘露糖，中层含蛋白，下层为氯仿层。(3)将步骤(2)得到的上层清液75°C减压浓缩至原体积的40%，然后加入4倍体积量的甲醇，在4°C冰箱中放置12h，沉淀，离心得到甘露糖固体，60°C下干燥12h得到甘露糖粉末。(4)将步骤⑵得到的中层经140°C喷雾干燥或加入3倍体积的甲醇，在4°C冰箱中放置12h，沉淀得到蛋白质固体。(5)将步骤(1)得到的含葡聚糖的沉淀加1倍重量的水溶解后经400W超声破碎 30min，调pH7，室温下加碱性蛋白酶(2500U/g沉淀)酶解6h，再加4wt% NaOH溶液90°C下保温反应4h后离心得沉淀，NaOH溶液的加入体积为酶解液体积的2倍，经无水乙醇洗涤3 次，再经乙醚洗涤2次，60°C干燥12h后得到葡聚糖粉末。 制得的酵母葡聚糖为浅褐色粉末，得率为22.7%，纯度58 %。甘露糖蛋白为黄色粉末，得率为7.2%，纯度77%。蛋白质得率为1.5%，纯度95%。实施例3 (1)以工业生产后的废酵母(来源于啤酒厂商)为原料，加4wt% KOH溶液，KOH溶液的重量为废酵母干重量的8倍，洗涤萃取6h，用3mol/LHCl调pH值至中性后离心，上清液含甘露糖和蛋白，沉淀含葡聚糖。(2)将步骤(1)得到的含甘露糖和蛋白的上清液，加入正丁醇和氯仿的混合溶液， 正丁醇和氯仿的体积比为1 5，含甘露糖和蛋白的上清液与正丁醇和氯仿的混合溶液的体积比为5 1，剧烈震荡后离心，得上、中、下三层，上层为清液含甘露糖，中层含蛋白，下层为氯仿层。(3)将步骤(2)得到的上层清液65°C减压浓缩至原体积的50%，然后加入5倍体积量的甲醇，在4°C冰箱中放置24h，沉淀，离心得到甘露糖固体，60°C下干燥24h得到甘露糖粉末。(4)将步骤(2)得到的中层经160°C喷雾干燥或加入3倍体积的甲醇，在4°C冰箱中放置24h，沉淀得到蛋白质固体。(5)将步骤⑴得到的含葡聚糖的沉淀加1倍重量的水溶解后经600W超声破碎 50min,调pH8，室温下加碱性蛋白酶(5000U/g沉淀)酶解12h，再加5wt% NaOH溶液90°C 下保温反应6h后离心得沉淀，NaOH溶液的加入体积为酶解液体积的3倍，经无水乙醇洗涤 4次，再经乙醚洗涤3次，60°C干燥24h后得到葡聚糖粉末。制得的酵母葡聚糖为浅褐色粉末，得率为24%，纯度78%。甘露糖蛋白为黄色粉末，得率为8. 7 %，纯度89 %。蛋白质得率为2 %，纯度95 %。
权利要求
1.一种利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法，其特征在于，它包括如下步骤(1)以工业生产后的废酵母为原料，加碱溶液洗涤萃取，调pH值至中性后离心，上清液含甘露糖和蛋白，沉淀含葡聚糖；(2)将步骤(1)得到的含甘露糖和蛋白的上清液，加入正丁醇和氯仿的混合溶液，剧烈震荡后离心，得上、中、下三层，上层为清液含甘露糖，中层含蛋白，下层为氯仿层；(3)将步骤(2)得到的上层清液减压浓缩后加入甲醇沉淀，再离心，干燥得到甘露糖粉；(4)将步骤(2)得到的中层经喷雾干燥或甲醇沉淀得到蛋白质固体；(5)将步骤(1)得到的含葡聚糖的沉淀加水溶解后经超声破碎，加入蛋白酶酶解，再加 NaOH溶液保温反应后离心得沉淀，经无水乙醇洗涤，再经乙醚洗涤，干燥后得到葡聚糖粉末。
2.根据权利要求1所述的利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的碱溶液为氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液，碱溶液质量百分浓度为 2 4%，碱溶液的重量为废酵母干重量的3 8倍。
3.根据权利要求1所述的利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的正丁醇和氯仿的混合溶液，其中正丁醇和氯仿的体积比为 1 (4 5)；含甘露糖和蛋白的上清液与正丁醇和氯仿的混合溶液的体积比为5 (1 3)。
4.根据权利要求1所述的利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中，减压浓缩温度为60 85°C，减压浓缩至原体积的30 50%。
5.根据权利要求1所述的利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法，其特征在于，步骤⑶中，甲醇的加入量为浓缩液体积的3 5倍，沉淀条件为在0 7°C冰箱中放置6 24h。
6.根据权利要求1所述的利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法，其特征在于，步骤⑶或(5)中，干燥条件为40 80°C下干燥8 24h。
7.根据权利要求1所述的利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法，其特征在于，步骤(4)中，喷雾干燥温度为120 160°C，所述的甲醇沉淀，甲醇的加入量为中层蛋白层体积的3 5倍，沉淀条件为在0 7°C冰箱中放置6 24h。
8.根据权利要求1所述的利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法，其特征在于，步骤(5)中，沉淀加水溶解，水的重量为沉淀重量的1 3倍；超声破碎条件为300 600W超声破碎20mi 50min。
9.根据权利要求1所述的利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的蛋白酶为中性蛋白酶或碱性蛋白酶，酶的用量为500 5000U/g 沉淀，酶解反应时间为2 12h。
10.根据权利要求1所述的利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述NaOH溶液的浓度为3 5wt %，NaOH溶液的加入体积为酶解液体积的1 3倍，加NaOH溶液的反应温度为80 90°C，反应时间为2 6h。
全文摘要
本发明公开了一种利用工业废酵母联产葡聚糖、甘露糖和蛋白的方法，该方法利用工业废酵母为原料，通过萃取、反应、分层、超声、酶处理、浓缩等工艺一次性得到葡聚糖、甘露糖和蛋白三种物质。本发明的优越性在于以工业废酵母作为原料生产的葡聚糖可以用于食品、医药、化妆品、造纸和建筑材料等行业，甘露糖可用于食品、饮料的添加剂，对糖尿病人、肥胖症、便秘和高胆固醇等疾病患者有良好的辅助治疗作用；通过对传统工艺的改进和优化，利用高温、加压、超声、酶制剂、浓缩等方法，一次提取葡聚糖和甘露糖蛋白，缩短生产时间，相比独立生产三种产品工序少，成本低，提取率能达到24％、8.7％和2％。
文档编号C07H1/08GK102329380SQ20111028863
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月26日 优先权日2011年9月26日
发明者周蕊, 应汉杰, 张磊, 王淑娟, 盛兵, 蔡家栋, 陈晓春, 黄小权 申请人:南京同凯兆业生物技术有限责任公司, 南京工业大学