专利名称：一种人源性纤维蛋白原样蛋白2免疫原性肽段及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶免疫原性肽段NPG-12和应用该肽段制备的抗体，以及该抗体作为人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶特异性抑制剂的应用。
背景技术：
人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶(Human Fibrinogen-Iike Protein 2Prothrombinase, fgl2凝血酶原酶)介导的凝血途径的激活在许多微循环障碍疾病中扮演着重要角色。与传统内源性和外源性凝血途径不同，它不依赖fe因子而从“旁路”直接催化凝血酶原转变成有活性的凝血酶，从而快速启动凝血反应导致微血管内原位血栓形成。 大量的研究证实，在细菌和病毒感染性疾病(如内毒素休克，病毒性肝炎)、肾小球肾炎、癌症、同种或异种器官移植排斥反应、自发性流产、心肌缺血再灌注损伤病理模型中均发现新的促凝剂——fgl2凝血酶原酶异常高表达于微血管内皮，fgl2凝血酶原酶的激活可导致广泛的“纤维蛋白性”微血栓，从而导致组织和器官坏死。因此，fgl2凝血酶原酶成为微循环障碍性疾病新的干预靶点。hfgl2凝血酶原酶基因位于人7号染色体长臂第1区第1条带的第23个亚带，英文简写为7qll. 23。该hfgl2凝血酶原酶是丝氨酸蛋白酶，由439个氨基酸组成的一种II 型跨膜蛋白，有2个氨基酸的胞浆结构域、21个氨基酸的跨膜结构域和416个氨基酸的胞外结构域；现已证实hfgl2凝血酶原酶表达于内皮细胞、巨噬细胞、THP-I细胞、T淋巴细胞等细胞膜上。研究表明，表达于膜上的hfgl2凝血酶原酶具有较强的促凝活性。分析hfgl2凝血酶原酶蛋白质结构表明，其胞外结构域羧基端与纤维蛋白原的β和Y链有高度同源性， 该结构域被称为hfgl2凝血酶原酶纤维蛋白原相关结构域(Fibrinogen related domain, FRED片段)，具有免疫调节作用，但不是促凝活性的关键部位；而位于胞外氨基端91位丝氨酸残基是hfgl2促凝血活性结构域的关键位点，具有丝氨酸蛋白酶生物学活性。目前制备的针对hfgl2凝血酶原酶FRED片段抗体虽能抑制hfgl2凝血酶原酶的促凝活性，然而由于FRED片段与纤维蛋白原的β和γ链有高度同源性，许多研究已证实纤维蛋白原超家族有免疫调节作用，因此该抗体既在抑制hfgl2凝血酶原酶促凝活性的同时也影响免疫调节作用。再者，hfgl2凝血酶原酶促凝活性的关键位点是胞外氨基端91位丝氨酸残基，且抗hfgl2凝血酶原酶FRED片段抗体因内源性交叉反应可能会影响纤维蛋白原的免疫调功能。目前尚无针对hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近富含谷氨酸肽段的特异性抑制剂，也缺乏针对原位微血栓治疗的市售的特异性药物。若能通过生物学手段，制备针对hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近富含谷氨酸连续肽段的抗体，理论上则可特异地抑制hfgl2凝血酶原酶的促凝活性，抑制原位微血栓的形成， 且不影响人体免疫调节和纤维蛋白原的生理功能。目前尚未见抗hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近富含谷氨酸的免疫原性肽段NPG-12及其抗体的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近富含谷氨酸的免疫原性肽段NPG-12，通过免疫学的方法制备针对该肽段的特异性抗体 Anti-NPG-12抗体，基于该肽段制备的抗体，可以作为hfgl2凝血酶原酶新的、特异性抑制剂。实现本发明的具体技术方案(1) hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端NPG-12的选择本发明的设计人从hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近筛选出富含谷氨酸肽段NPG-12，作为抗原决定簇或半抗原。具体氨基酸序列为=Glu-Glu-Val-Phe-L ys-Glu-Val-Gln-Asn-Leu-Lys-Glu,并应用该肽段作为抗原决定簇/半抗原制备针对该肽段的抗体。0)NPG-12 的合成根据NPG-12氨基酸序列采用FMOC固相合成法，应用PSSM-8多肽自动合成仪合成。(3) Anti-NPG-12 抗体的制备采用戊二醛偶联法，以牛血清白蛋白作为载体蛋白合成NPG-12-BSA完全抗原。将此抗原与完全或不完全弗氏佐剂免疫新西兰大白兔，制备Anti-NPG-12抗体。定期测定血清中该抗体的滴度。于免疫5次后取血，亲合层析法提纯该抗体。(4)表达hfgl2凝血酶原酶细胞模型的建立采用20ng/ml IFN-γ刺激人急性单核细胞白血病细胞株ΤΗΡ-1细胞12小时，细胞可表达hfgl2凝血酶原酶。(5) Anti-NPG-12抗体的特异性鉴定通过间接酶联免疫吸附试验，检测新西兰大白兔血清中Anti-NPG-12抗体的滴度。通过免疫荧光组织化学法，检测Anti-NPG-12抗体与受IFN- γ刺激的THP-I表达 hfgl2凝血酶原酶的结合。通过免疫印迹法，检测Anti-NPG-12抗体与受IFN- γ刺激的THP-I表达hfgl2凝血酶原酶的结合。(6) Anti-NPG-12抗体对hfgl2凝血酶原酶凝血活性的影响通过单向凝集试验(one stage clotting assay)，检测Anti-NPG-12抗体对表达 hfgl2凝血酶原酶的人急性单核细胞白血病THP-I细胞株促凝活性的抑制作用。(7) Anti-NPG-12抗体对健康人血浆PT和APTT的影响通过对血浆凝血酶原酶时间(Prothrombin Time, PT)测定，检测Anti_NPG_12抗体对健康者血浆PT的影响。ffl yg ^ ΜIfiI yg Bl fs] (Activated partial thromboplastin time, APTT)测定，检测Anti-NPG-12抗体对健康者血浆APTT的影响。本发明提供的肽段的有益效果(DNPG-12可作为抗原决定簇/半抗原制备针对该肽段的抗体，该肽段也可用作检测、筛选和鉴定对hfgl2凝血酶原酶具有抑制功能的抗体所针对的抗原决定簇。(2)基于hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近富含谷氨酸肽段 NPG-12制备的抗体——Anti-NPG-12抗体可作为hfgl2凝血酶原酶新的、特异性抑制剂，用于对hfgl2凝血酶原酶功能的研究。基于NPG-12肽段所制备的单克隆抗体将有助于抑制微循环原位血栓的形成。
图1 :hfgl2凝血酶原酶预测图。A :hfgl2凝血酶原酶氨基酸的亲水性预测图，黑线表示所取肽段NPG-12 ；B :hfgl2凝血酶原酶氨基酸抗原指数预测图，黑线表示所取的肽段NPG-12 ；C :hfgl2凝血酶原酶氨基酸柔韧性预测图，黑线表示所取肽段NPG-12。图2 Anti-NPG-12抗体滴度。第一次免疫后2周，抗体滴度为1 3200 ；第二次免疫后2周，抗体滴度为1 25600 ；第三次免疫后2周，抗体滴度为1 51200 ；第四次免疫后2周，抗体滴度为1 51200 ；第五次免疫后1周抗体滴度为1 40000。图3 Anti-NPG-12抗体与hfgl2凝血酶原酶的结合免疫荧光结果显示A =Anti-NBG-12抗体3 μ g/ml)与未受IFN-γ刺激的 THP-I细胞膜表达蛋白的结合，Al :a为无绿色荧光显示细胞核；A2 无绿色荧光显示抗体与细胞膜的结合。表明Anti-NBG-12抗体不能与未受IFN- γ刺激THP-I细胞表达膜蛋白结合。B Anti-NBG-12抗体(28. 3 μ g/ml)与受20ng/ml IFN- γ刺激的THP-I细胞膜表达 hfgl2凝血酶原酶的结合，Bl :a为无绿色荧光显示细胞核；B2 :b为绿色荧光显示抗体与细胞膜的结合。表明Anti-NBG-12抗体能与表达于受20ng/ml IFN- γ刺激THP-I细胞膜上 hfgl2凝血酶原酶结合。C 经NPG-12孵育后的Anti-NPG-12抗体与受IFN- γ刺激THP-I 细胞表达蛋白的结合，Cl :a为无绿色荧光显示细胞核；C2 无绿色荧光显示抗体与细胞膜的结合。表明经NPG-12孵育后的Anti-NPG-12抗体与受IFN- γ刺激THP-I细胞表达膜蛋白无结合。免疫印迹结果显示D 刺激组，Anti-NBG-12抗体与受20ng/ml IFN-γ刺激THP-1 细胞膜表达hfgl2凝血酶原酶的特异性结合；未刺激组，Anti-NBG-12抗体与未受IFN- γ 刺激THP-I细胞表达蛋白无结合；NPG-12孵育组，经NPG-12孵育后的Anti-NPG-12抗体与受IFN- γ刺激THP-I细胞表达蛋白无结合。表明Anti-NBG-12抗体能与hfgl2凝血酶原酶(6涨(1)特异性结合。图4 Anti-NPG-12抗体对hfgl2凝血酶原酶促凝活性的抑制作用。A 静息细胞组，未受IFN- γ刺激THP-I促凝活性；B 刺激细胞组，受20ng/ml IFN- γ刺激THP-I促凝活性；C :Anti-NBG-12抗体(113. 2 μ g/ml)干预刺激细胞组后促凝活性；D :Anti-NBG-12抗体(56. 6 μ g/ml)干预刺激细胞组后促凝活性；E Anti-NBG-12抗体3 μ g/ml)干预刺激细胞组后促凝活性。每组重复3次，用单因素方差分析，P <0.05差异有统计学意义。sA 与B组促凝活性相比，P < 0. 05差异有统计学意义；*C，D，E与B组促凝活性相比，P < 0. 05 差异有统计学意义。图5 Anti-NPG-12抗体对正常人血浆PT的影响。空白组A 血浆；B =PBS 血浆(1 9) ；C =PBS 血浆(1 49) ；D =PBS 血浆(1 99)。抗体干预组E 抗体血浆(1 9)，抗体浓度为283 μ g/ml ;F:抗体血浆(1 49)，抗体浓度为56. 6 μ g/ml ；G 抗体血浆(1 99)，抗体浓度为观.3 48/!111。各组间相比差异无统计学意义。表明 Anti-NBG-12对外源性凝血途径无影响。图6 :Anti-NPG-12抗体对正常人血浆APPT的影响。空白组A 血浆；B :PBS 血浆(1 9) ；C =PBS 血浆(1 49) ；D =PBS 血浆(1 99)。抗体干预组E 抗体 血浆(1:9)，抗体浓度为283 μ g/ml ；F 抗体血浆(1 49)，抗体浓度为56. 6 μ g/ml ； G 抗体血浆(1 99)，抗体浓度为观.3 μ g/ml。各组间相比差异无统计学意义。表明 Anti-NBG-12对内源性凝血途径无影响。
具体实施例方式以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。实施例1抗原的合成应用DNASTAR、HomoloGene软件根据hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端氨基酸的亲水性、抗原性、柔韧性和表露性，采用Jameson-Wolf算法，通过计算机抗原指数预测分析，选择亲水性好、抗原指数高、柔韧性好、富含谷氨酸残基、暴露在蛋白分子表面、无种内同源性并在91位丝氨酸残基附近的12个连续氨基酸的肽段——NPG-12，其氨基酸序列为Glu_G Iu-Val-Phe-Lys-Glu-Val-Gln-Asn-Leu-Lys-Glu。根据其氨基酸序列采用 PSSM-8 型多肽自动合成仪，用FOMC法合成多肽。采用戊二醛偶联法，以BSA作为载体蛋白合成NPG-12-BSA 完全抗原。抗原合成完毕后，置于-70°C冰箱中备用。实施例2Anti-NPG_12抗体的制备(1)动物免疫将制备的抗原与完全或不完全弗氏佐剂一起免疫雄性新西兰大白兔(清洁级，体重2. 5 3kg)，制备Anti-NPG-12抗体。设置免疫组和假性免疫组，免疫组初次免疫每只兔取抗原500 μ g，后继免疫每只兔取抗原250 μ g，均加等体积弗氏佐剂，初次免疫用完全弗氏佐剂，以后用不完全弗氏佐剂，充分乳化后，于兔子背部、后腿皮下多点注射。每两周加强免疫一次，共5次。假性免疫组用生理盐水加弗氏佐剂假性免疫，剂量与方法同免疫组。(2)血清标本的留取从初次免疫开始，每次免疫前从兔耳缘静脉抽血1ml，动态观察血清抗体效价，第 9周处死，留取血清制备抗体。(3)抗体的制备提纯抗体先用饱和硫酸铵法初步提纯，再用亲合层析法进一步提纯，提纯完毕后分装， 并用BCA法测蛋白浓度，测得Anti-NBG-12抗体浓度为2. 83mg/ml，置于_20°C冰箱中备用。实施例3表达hfgl2凝血酶原酶细胞模型的建立用20ng/ml IFN- γ刺激人急性单核细胞白血病细胞株ΤΗΡ-1细胞(购自美国标准生物品收藏中心)12小时，细胞可表达hfgl2凝血酶原酶。实施例4ELISA检测Anti-NBG-12抗体效价以未接受过免疫的健康新西兰大白兔血清为阴性对照，将不同时段兔血清进行检测。将合成的多肽，以每孔ι μ g包被于酶联板，方阵滴定法先后加入制备的一抗及HRP标记的羊抗兔IgG，ΤΜΒ/Η202显色，稀终止反应。在酶标仪450mm波长处测吸收度OD值，以 (待测孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)彡2. 1为阳性，< 2. 1为阴性。每次试验均设3个复孔阴性对照。取1份阳性样品，进行同一板内及不同板间的
重复试验。ELISA检测发现在0周抗体滴度为0;2周留取的血清抗体滴度为，1 3200 ； 第4周留取的血清抗体滴度为1 25600，效价有明显飞跃；第6周留取的血清抗体滴度为1 51200，表明随着免疫时间及免疫次数的增加，抗体的滴度在上升；第8周抗体滴度达1 51200，说明抗体滴度已达到相对稳定较高水平；第9周抗体滴度稍下降也有 1 40000(见图 2)。实施例5人急性单核细胞白血病THP-I细胞株的培养THP-I细胞株复苏后，在RPMI1640培养基(含10%胎牛血清)中培养，培养条件为371、5%0)2培养箱，静置。细胞处于生长期、状态好时抱团成串生长。细胞传代时，轻轻吹打，使细胞成为单细胞悬液，细胞以1000转/分，5分钟，弃上清，重悬细胞沉淀以传代。实施例6Anti-NPG_12抗体与hfgl2凝血酶原酶特异性结合免疫荧光组织化学法观察Anti-NBG-12抗体与表达于THP-I细胞膜的hfgl2凝血酶原酶的结合。L-赖氨酸浓度(分子量为70000 15000) 100 μ g/ml预包被1小时，随后吸除多聚赖氨酸溶液，于超净台下干燥培养器皿。将处于生长期、状态良好的THP-I细胞吹打成单细胞悬液，以5X 105/ml密度接种在激光共聚焦玻璃培养皿上。约48小时可见大部分细胞由悬浮状态变为贴壁状态，细胞形态规则，呈圆形或椭圆形。固定前12小时，实验组加IFN- y 20ng/ml刺激细胞表达hfgl2凝血酶原酶，对照组加等体积的PBS。用4%多聚甲醛溶液于4°C固定30min，PBS摇洗3次，每次IOmin ； 10 %羊血清和1 %牛血清白蛋白湿盒封闭2小时；滴加用封闭液稀释的一抗在4°C冰箱过夜，PBS摇洗3次，每次IOmin ；加FITC标记的1 100羊抗兔IgG室温孵育2小时，PBS摇洗3次，每次IOmin ；滴加DAPI，室温孵育 5min，摇洗3次，每次5min ；激光共聚焦显微镜下观察并照相记录。结果显示，Anti-NPG_12 抗体特异性地结合表达于受20ng/ml IFN- γ刺激THP-I细胞膜的hfgl2凝血酶原酶，而 Anti-NPG-12抗体与未受刺激THP-I细胞膜蛋白不结合(见图3A、B和C)。免疫印迹法观察抗体与表达于THP-I细胞膜的hfgl2凝血酶原酶的结合。当细胞生长进入平台期，细胞由抱团成串生长变成散在单个成长时，吹打细胞使其成单细胞悬液， 实验组加入IFN- y 20ng/ml刺激THP-I细胞12小时，对照组加等体积的PBS。细胞膜蛋白的提取参考Barry DM等的方法，Cocktail为蛋白酶抑制剂，提取的蛋白用BCA法测浓度。 每孔取35 μ g蛋白上样与9%聚丙烯胺凝胶进行电泳，电泳后转移样品蛋白至硝酸纤维素膜上；将膜置于含5%脱脂奶粉的TBST中室温摇动封闭2. 5小时，加一抗1 500(5. 66yg/ ml)4°C孵育过夜；用TBST洗膜3次，每次15min ；加入1 10000HRP标记羊抗兔二抗室温孵育2小时，TBST洗膜3次，每次15min ；暗室浸入增强化学发光剂，条带显色后用胶片压片，显影、定影、洗片和烘干。结果表明，Anti-NPG-12抗体能特异性结合表达于受20ng/ml IFN- γ刺激THP-I细胞膜上65Kd的hfgl2凝血酶原酶。而Anti-NPG-12抗体与未受刺激 THP-I细胞蛋白不结合(见图3D)。实施例7Anti-NPG_12抗体对hfgl2凝血酶原酶促凝活性影响采用单相凝集试验检测Anti-NPG-12抗体对THP-I表达hfgl2凝血酶原酶促凝活性的抑制作用。用促凝血酶原激酶倍比稀释成不同活性单位，检测其促凝活性，绘制标准曲线；准备THP-1，分别收集静息状态和经20ng/ml IFN- γ刺激12小时的ΤΗΡ-1，吹打成单细胞悬液，用PBS反复洗涤细胞，使细胞计数达1 X 106/ml ；将细胞悬液用冻存管保存于-80°C，临测前经液氮反复冻融3次，混勻，以获得最大细胞总促凝活性，观察抗体对 hfgl2凝血酶原酶促凝活性的抑制作用。数据以均数士标准误表示，采用SPSSl 1. O统计软件包，进行t检验和单因素方差分析，P < 0. 05具有统计学意义。单相凝集试验显示，未受刺激THP-I无或低促凝活性(0. 586士0. 035U/ml)；受 20ng/mlIFN- γ刺激的THP-I促凝活性明显增高(2. 970士0. 053U/ml)，与未受刺激组相比P < 0. 05差异有统计学意义；不同抗体浓度3 113. 2 μ g/ml)干预受20ng/ml IFN- γ 刺激的ΤΗΡ-1，其促凝活性与未受干预刺激细胞组相比明显下降，Ρ < 0. 05差异有统计学意义(见图4)。实施例8Anti-NPG_12抗体对健康人血浆PT和APTT的影响从肘静脉用枸橼酸钠抗凝管抽取健康志愿者全血20ml，3000转/分，于4°C离心 30min，吸取上清即为乏血小板血浆。往血浆中加入不同浓度的抗体，室温孵育2小时，速送检验科检测，观察抗体对PT和APTT的影响。通过检测健康青年PT、APTT显示，Anti-NPG_12 抗体对健康人内源性与外源性凝血途径均无影响，各组间相比P > 0. 05，差异无统计学意义(见图5，6)。
权利要求
1.一种人源性纤维蛋白原样蛋白2免疫原性肽段，该肽段由人源性纤维蛋白原样蛋白 2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近富含谷氨酸的连续的12个氨基酸构成。其特征在于所述肽段的氨基酸序列为=Glu-Glu-Val-Phe-Lys-Glu-Val-Gln-Asn-Leu-Lys-Glu，应用该肽段作为抗原决定簇/半抗原制备针对该肽段的抗体。
2.一种针对权利要求1所述肽段的抗体，其特征在于该抗体可作为人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶的特异性抑制剂，用于对人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶功能的药学应用。
全文摘要
本发明提供一种人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶免疫原性肽段及其用途。所述肽段由人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近富含谷氨酸连续12个氨基酸构成，肽段氨基酸序列为Glu-Glu-Val-Phe-Lys-Glu-Val-Gln-Asn-Leu-Lys-Glu。通过免疫学方法制备针对上述肽段的抗体可以作为人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶新的、特异性抑制剂，该抗体可用于调节人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶促凝功能的研究。基于上述肽段制备的单克隆抗体将有助于微循环障碍疾病的临床干预。
文档编号C07K16/40GK102358751SQ20111030720
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者刘坤, 李文珠, 王敏, 王朝晖, 王珏, 苏冠华, 陈宇 申请人:华中科技大学同济医学院附属协和医院