专利名称：诊断癌症的试剂及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于医学领域；更具体地，本发明涉及诊断癌症的试剂及试剂盒。
背景技术：
DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰，在哺乳动物中DNA甲基化主要是指胞嘧啶(C) 5位上的碳被甲基化修饰成5-甲基胞嘧啶(5mC)。CpG 二核苷酸是发生DNA甲基化主要的位点，它在基因组中呈不均匀分布。在一些区域，主要是基因的启动子和第一外显子区域，CpG高于正常概率，这些区段因此而被称为CpG岛。整个基因组范围内，约有60%以上基因的启动子区含有CpG岛。总体来说，在哺乳动物中5mC约占C总量的2-7%，因此而有了“第五种碱基”之称。DNA甲基化在正常和异常的生理活动中起着重要的作用。它可以抑制基因的表达，参与对染色体的结构维持，调节X染色体失活、基因印记、和转座子沉默等重要细胞功能。TET1,全名 Ten-Eleven Translocation I。Tetl 是一个 2-0G,Fe++依赖性的 5mC加氧酶，可以将5mC转变为5-轻甲基胞卩密唳(5-HydroxymethyICytosine) (hmc)。同时,在大脑细胞中也发现了 hmc的存在。TETl的生物学功能仍不知道，由于Tetl是从急性骨髓状白血病患者的十号衍生染色体中克隆出来的，而且易位至十一号染色体上，估计它与癌症发生发展有关，但Tetl在癌症中的作用仍不知道。hmc是1952年在噬菌体中发现的。1972年发现hmc也存在于哺乳动物中，它存在于小鼠和青蛙的脑DNA中，也存在于大鼠的脑和肝脏中，在脑中hmc大约占总胞嘧啶的20%，在肝脏组织里占总胞嘧啶的6% (40)。目前现有技术中，还没有发现hmc与癌症的相关性。
发明内容
本发明的目的在于提供诊断癌症的试剂及试剂盒。在本发明的第一方面，提供一种5-羟甲基胞嘧啶用作检测癌症的标志物的用途。在一个优选例中，所述的癌症包括(但不限于):脑癌(如胶质瘤)、鳞状上皮癌(如食管癌、皮肤癌、头颈癌等)、乳腺癌、胃癌、肠癌(如结肠癌、直肠癌)、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、子宫癌、胰腺癌、胸腺癌、精原细胞癌、肌肉瘤。在本发明的另一方面，提供一种5-羟甲基胞嘧啶(hmc)的用途，用于制备检测癌症的试剂。在另一优选例中，所述的检测癌症包括:确定癌症的严重程度或进行癌症的分型。在另一优选例中，所述的5-羟甲基胞嘧啶与载体蛋白连接，用于制备检测癌症的试剂。在另一优选例中，所述的载体蛋白选自:牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(0VA)、血蓝蛋白(KLH)。
在本发明的另一方面，提供一种抗原，所述抗原包含载体蛋白(优选没有免疫原性的)，以及连接于载体蛋白上的一个或多个(如1-100个；更特别地如5、10、12、13、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90 个)5_ 羟甲基胞嘧啶。在另一优选例中，所述的载体蛋白选自:牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(0VA)、血蓝蛋白(KLH)。在本发明的另一方面，提供所述的抗原的用途，用于制备检测癌症的试剂。在本发明的另一方面，提供一种特异性识别5-羟甲基胞嘧啶(hmc)的试剂的用途，用于制备检测癌症的试剂盒。在另一优选例中，所述的试剂是特异性识别5-羟甲基胞嘧啶的抗体(包括多克隆抗体或单克隆抗体)。在本发明的另一方面，提供一种多克隆抗体，其特异性地识别5-羟甲基胞嘧啶。在另一优选例中，所述的多克隆抗体的制备方法为:用所述的抗原免疫兔子，获取免疫血清，纯化后获得所述的多克隆抗体。在另一优选例中，所述的多克隆抗体的制备方法为:将所述的抗原与弗氏佐剂混合(较佳地1:1混合)后，注射到家兔，免疫量0.5±0.2mg，每隔1.5-3周(较佳地2周)免疫I次，免疫2-4次(较佳地3次)，从兔血清中分离多克隆抗体。在本发明的另一方面，提供一种单克隆抗体，其特异性识别5-羟甲基胞嘧啶，其由保藏号为CCTCC No:C201191的杂交瘤细胞株产生。在本发明的另一方面，提供一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为 CCTCC No:C201191o在本发明的另一方面，提供一种用于检测癌症的试剂盒，其中包括特异性识别
5-羟甲基胞嘧啶的试剂。在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有:显色剂等免疫组化试剂。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、MALD1-T0F 4800质谱检测未偶联对照组BSA (下图)和偶联后产物hmc-BSA(上图)的分子量。图2、SDS-PAGE分离偶联后产物(conju)、未偶联对照组BSA(Control，Ctrl)和未经过反应的BSA对照。图3、MALD1-T0F 4800质谱检测未偶联对照组OVA (control)和偶联后各种产物的分子量。U-OVA、5mU-0VA、A-OVA, G-OVA, hmc-OVA分别是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、和5-羟甲基胞嘧啶偶联到OVA上。图4、紫外分光光度分析游离的KLH、hmc、KLH和hmc偶联反应后产物的吸收峰，以判断偶联反应是否成功。图5、免疫印迹检测hmc兔多克隆抗体HMC-PA01的特异性。5mC或hmc (初始量分别为125纳克)以2倍递减量固定到膜上，与hmc兔多克隆抗体HMC-PA01 (上图)或5mC抗体(33 D3, Calbiochem, San Diego, CA)(中图)反应后，经过二抗和显色后显不:hmc的兔多克隆抗体HMC-PAOl只识别hmc，基本不识别5-甲基胞嘧啶(5mC)(上图)。而5mC抗体只认识5mC,不识别hmc (中图)。Ponceau-S显示各点含有稀释物质(下图)。图6、免疫荧光染色检测hmc兔多克隆抗体HMC-PAOl的特异性。编码Tetl和GFP的质粒(mTETl-1res-GFP)被转入细胞中，用DAPI染每个细胞的细胞核(左上图)、hmc兔多克隆抗体HMC-PAOl染hmc (右上图)、5mC抗体染5mC(左下图)、绿色显示mTETl-1res-GFP转入的细胞(中下图)，Merge是四个图像重叠。图7、hmc兔多克隆抗体可以被用于免疫共沉淀。小鼠46C ES细胞(左图)、293T(control)(中图)、或转入Tetl的293T细胞(Tetl)分别用5mC抗体(5mC)或hmc抗体(hmc)进行免疫共沉淀,沉淀的DNA经Agarose胶分离后,用溴化乙锭染色。Input是用于沉淀的十分之一的DNA用量，IgG是抗体对照。图8、免疫印迹检测hmc鼠单克隆抗体MA7的特异性。5mC或hmc (初始浓度分别为5纳克)以10倍递减量固定到膜上，与hmc鼠单克隆抗体MA7(上图)、同时含有5mC抗体(33 D3, Calbiochem, San Diego, CA)和hmc鼠单克隆抗体MA7 (中图)反应后，经过二抗和显色后显示:hmc的鼠单克隆抗体只识别hmc，不识别5mC (上图)。而5mC抗体认识5mC (中图)。Ponceau-S显示各点含有稀释物质(下图)。图9、免疫荧光染色检测hmc鼠单克隆抗体MA7的特异性。编码Tetl和GFP的质粒(Tetl-1res-GFP)被转入细胞中，用DAPI染每个细胞的细胞核(左上图)、hmc鼠单克隆抗体MA7免疫染色(右上图)、hmc兔多克隆抗体免疫染色(左下图)、绿色显示mTETl-1res-GFP转入的细胞(中下图)，Merge是四个图像重叠。图10、hmc鼠单克隆抗体可以被用于免疫共沉淀。293T(control)(左图)和转入Tetl的293T细胞(Tetl)分别用5mC抗体(5mC)或hmc抗体(hmc)进行免疫共沉淀,沉淀的DNA经Agarose胶分离后,用溴化乙锭染色。Input是用于沉淀的十分之一的DNA用量，IgG是抗体对照。图11、hmc鼠单克隆抗体可以被用于免疫共沉淀。小鼠46C ES细胞(左图)、和脑组织(右图)分别用5mC抗体(5mC)或hmc抗体(hmc)进行免疫共沉淀,沉淀的DNA经Agarose胶分离后,用溴化乙锭染色。Input是用于沉淀的十分之一的DNA用量，IgG是抗体对照。图12、病理号200401486肾癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌组织和癌旁组织的肾癌组织切片用hmc抗体(左图)或5mC抗体(右图)进行免疫组化染色，癌旁组织有高水平的hmc (左图右上角)，但癌组织基本检测不到5-hmc (左图右下角)。相反地，癌组织(右图右上角)和其癌旁组织(右图右下角)有相似的5mC水平。图13、病理号200309294肾癌病人的组织经免疫组化染色发现:癌旁组织(a)有高强度的hmc染色，但癌组织基本检测不到hmc (b)。相反地，癌组织(c)和其癌旁组织(d)有相似强度的hmc染色。图14、肾癌组织中hmc水平明显下降。根据表一的定量积分方法，将着色强度和广度乘积作为组织的hmc染色程度。每个圆圈代表一个癌组织，每个三角代表一个癌旁组织，两条横线分别是癌组织和癌旁组织hmc染色程度的平均值，癌旁组织有高水平的hmc，而癌组织中hmc水平明显下降。图15、hmc免疫组化染色病理号201003780和201004888的正常尿路上皮，hmc染色阳性。图16、举例说明膀胱癌病人组织hmc染色程度。hmc免疫组化染色病理号200216104(上图)、200300702(中图)、和200309678(下图)膀胱癌病人的组织，它们的hmc染色程度分别为I分(阴性)、6分(弱阳性)、和9分(阳性)。图17、膀胱癌组织中hmc水平与膀胱癌的严重程度相关联。参照前述，将着色强度和广度乘积作为染色程度，以显示不同恶化程度膀胱癌的积分。横线分别是不同恶化程度膀胱癌癌组织hmc染色程度的平均值，随着恶化程度的加深，hmc水平不断减少。LN1:低级别非浸润性尿路上皮癌，Low:低级别尿路上皮癌，High:闻级别尿路上皮癌，H1:闻级别浸润性尿路上皮癌。图18、hmc免疫组化染色正常脑组织，DAPI染细胞核、NeuN染神经细胞，神经细胞hmc染色阳性。图19、hmc免疫组化染色正常脑组织，DAPI染细胞核、GFAP染胶质细胞，胶质细胞hmc染色阳性。图20、举例说明胶质瘤组织hmc染色程度。hmc免疫组化染色胶质瘤病人的组织，它们的hmc染色程度分别为O分(A，0x0)、I分(B, 1x1)、4分(C，2x2)和9分(D，3x3)。图21、胶质瘤组织hmc免疫组化染色程度与胶质瘤的癌症严重程度相关联。根据病理诊断级别把胶质瘤分成4级:1、I1、III和IV级。参照所述积分方法，对胶质瘤组织hmc染色结果进行定量积分分析，以着色强度和广度乘积作为染色程度，以显示不同恶化程度膀胱癌的积分。横线分别是不同恶化程度胶质瘤癌组织hmc染色程度的平均值，随着恶化程度的加深，hmc水平不断减少。A，第一组55例病人样品，B，第二组103例病人样品。图22、胶质瘤癌组织中hmc水平可以判断胶质瘤癌症病人的存活时间。根据胶质瘤癌组织hmc染色结果把病人分成分成阴性(2分及以下)、弱阳性(3-4分)、阳性(6分及以上)，然后绘制每一类病人的Kaplan-Meier生存时间曲线。A，第一组55例病人样品，B，第二组103例病人样品。图23、病理诊断严重程度相同的癌症病人可以通过hmc水平进一步分型。第一组55例病人和第二组103例病人样品合在一起，Kaplan-Meier生存时间曲线分别分析病理诊断为II级癌症样品㈧或III级癌症样品⑶。图24、乳腺癌组织hmc免疫组化染色。两例包含有癌旁组织(左边图)和癌组织(右边图)的乳腺癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，癌旁组织中正常乳腺导管细胞hmc染色呈阳性，但其相邻的癌组织hmc染色呈阴性。图25、乳腺癌组织hmc免疫组化染色。4例乳腺癌组织免疫组化染色发现乳腺癌组织中hmc水平有不同程度的下降。图26、前列腺癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(左边图)和癌组织(右边图)的前列腺癌组织切片用hmc抗体(上图)或5mC抗体(下图)进行免疫组化染色，癌旁组织有高水平的hmc (左上图)，但癌组织基本检测不到hmc (右上图)。相反地，癌组织(右下图)和其癌旁组织(左下图)有相似的5mC水平。图27、前列腺癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(左图)和癌组织(右图)的前列腺癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，癌旁组织有高水平的hmc (左图)，尽管癌组织基本检测不到hmc，但仍有一些细胞含有低水平的hmc (右图)。
图28、结肠癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(右边图)和癌组织(左边图)的结肠癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，部分正常结肠腺体细胞hmc染色呈阳性，但癌组织基本检测不到hmc。图29、两例结肠癌组织的hmc免疫组化染色，癌组织丧失了 hmc。图30、胃癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(左边图)和癌组织(右边图)的胃癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，正常胃腺体细胞hmc染色呈阳性，但癌组织基本检测不到hmc。图31、直肠癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(左边图)和癌组织(右边图)的直肠癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，正常腺体细胞有一定的hmc染色，但癌组织基本检测不到hmc。图32、子宫癌组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(左边图)和癌组织(右边图)的子宫癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，癌旁组织中正常平滑肌细胞hmc染色呈阳性，但来源于同一病人的癌组织hmc染色呈阴性(上图)。在另一例中，癌旁组织中正常子宫鳞状上皮和间质细胞有一定的hmc染色，但来源于同一病人的子宫鳞癌组织hmc染色呈阴性。图33、平滑肌肉瘤组织的hmc免疫组化染色。包含有癌旁组织(左边图)和癌组织(右边图)的平滑肌肉瘤组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，癌旁组织中正常平滑肌细胞有一定的hmc染色，但来源于同一病人的癌组织hmc染色呈阴性(上图)。图34、肺癌组织的hmc免疫组化染色。肺癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，大部分癌组织hmc染色呈阴性。图35、肝癌组织的hmc免疫组化染色。肝癌组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色发现，癌组织hmc染色呈阴性。图36、白血病组织的hmc免疫组化染色。白血病细胞用hmc抗体进行免疫组化染色，M2型非淋巴性白血病hmc染色呈阳性或弱阳性，但M4型非淋巴性白血病hmc染色呈阴性。图37、淋巴瘤组织的hmc免疫组化染色。淋巴瘤组织切片用hmc抗体进行免疫组化染色，癌组织hmc染色呈阴性。
具体实施例方式本发明人经过广泛的研究，首次揭示5-羟甲基胞嘧啶(hmc)在组织中的存在情况与癌症的发生和发展密切相关，组织中hmc水平明显下降提示癌症的发生或发展；并且hmc水平的高低还能指示癌症的严重程度。因此，检测hmc的试剂可良好地应用于癌症的诊断、预后或分型，具有很高的临床应用价值。如本文所用，所述的“癌症”是指多种癌症，只要其癌组织中hmc的水平明显下降(如明显低于癌旁组织)。较佳地，所述的癌症包括(但不限于):脑癌(如胶质瘤)、鳞状上皮癌(如食管癌、皮肤癌、头颈癌等)、乳腺癌、胃癌、肠癌(如结肠癌、直肠癌)、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、子宫癌、胰腺癌、胸腺癌、精原细胞癌、肌肉瘤。如本文所用，所述的“诊断癌症”包括:确定癌症的发生、确定癌症的发展、确定癌症的严重程度、对癌症进行预后、进行癌症的易感性分析，进行癌症的分型等。Hmc及其用途5_轻甲基胞卩密唳(5-HydroxymethyI Cytosine,hmc)为一种小分子化合物。它以共价形式连接于DNA链的胞嘧啶上，前人研究发现其存在于哺乳动物的脑和肝脏中，并存在于胚胎干细胞中。本发明人第一次揭示hmc在组织中的存在情况与癌症的发生和发展密切相关，组织中hmc水平明显下降提示癌症的发生或发展；并且hmc水平的高低还能指示癌症的严重程度，hmc水平越低预示着癌症越严重。基于本发明人的新发现，可以利用hmc:(i)进行癌症的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；( )评估相关人群的癌症治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群癌症患病风险，早期监测早期预防等。在得知了 hmc与癌症的相关性后，可方便地基于此来诊断癌症。任何可鉴定出组织中hmc表达情况的方法都包含在本发明中。这些鉴定方法是本领域技术人员所熟知的，较为经典的例如是免疫组化方法或免疫共沉淀方法。免疫组化(Immunohistochemistry)是本领域技术人员所熟知的技术，即应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量。免疫组化方法一般是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测。免疫共沉淀(Co-1mmunoprecipitation)也是本领域技术人员所熟知的技术,其是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础 的用于研究蛋白质相互作用或蛋白质与DNA相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质或蛋白质与DNA在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。识别Hmc的试剂及其用途所述的hmc可用于制备诊断癌症的试剂。由于hmc为小分子化合物，具有较弱的免疫原性，因此，优选地将hmc作为半抗原连接(偶联或附着)到载体蛋白上，制备具有免疫原性的抗原。所述的载体蛋白是本身没有或具有较低的免疫原性的一类生物大分子，例如所述的载体蛋白选自:牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(0VA)、血蓝蛋白(KLH)。所述的抗原免疫动物可获得特异性识别hmc的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的抗原可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生，所述的动物如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见 Kohler 等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Eur.J.Tmmunol.6:511,1976 ；Kohler 等人，Eur.J.Tmmunol.6:292,1976 ； Hammer I ing 等人，InMonoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y., 1981)。作为本发明的优选方式,所述的单克隆抗体由保藏号为CCTCC No:C201191的杂交瘤细胞株产生，经测其识别抗原的特异性良好。所述的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本中的hmc水平，从而用于诊断癌症。作为本发明的优选方式，提供了一种多克隆抗体，该抗体的制备方法如下^fhmc偶联牛血清白蛋白(BSA)，获得免疫抗原，将所述免疫抗原与弗氏佐剂混合后，注射到家兔，免疫量0.5±0.2mg，每隔2周免疫I次，免疫3次，从兔血清中分离多克隆抗体。该抗体特异性好，检测灵敏度高，准确性高，可良好地应用于免疫组织化学检测。试剂盒本发明还提供了用于诊断癌症的试剂盒，该试剂盒包括:特异性识别5-羟甲基胞嘧啶的试剂。所述的试剂例如是:单克隆抗体或多克隆抗体。此外，所述的试剂盒中还可含有:用于免疫组织化学分析的试剂，所述的试剂例如:染色剂、显色剂等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。本发明的主要优点在于:(I)首次揭示hmc可以作为诊断癌症的标志物，其可广谱地用于多种癌症的诊断，且可指示癌症的严重程度；对于一些癌症还能作为分型的依据。(2)首次制备出了特异性识别hmc的试剂，所述试剂特异性好，检测灵敏度高，准确性高，具有良好的临床应用价值。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人,分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1、5_轻甲基胞喃唳(hmc)抗原的制备5-羟甲基胞嘧啶(hmc)是小分子化合物，直接注射入兔子、大鼠、小鼠或其它免疫动物的体内不足以引起抗原抗体免疫反应。因此，本发明人把hmc作为半抗原偶联到BSA (牛血清白蛋白)、OVA (卵清白蛋白)、KLH(血蓝蛋白)等载体蛋白上，然后再将其注射入兔子、小鼠等免疫动物体内制备识别hmc的多抗，并通过与克隆细胞的融合和筛选，制备识别hmc的单抗。1.牛血清白蛋白BSA与5-羟甲基胞嘧啶hmc偶联的方法和产物检测(I)称取 IOmg hmc (PY7596, Berry & Associates, Inc.USA)，放入 1.5ml 的 Ep 管中；(2)加入500 μ I 0.1M的NaIO4,与hmc室温下暗处反应20min ；(3)加入30 μ I IM的乙二醇，室温下反应5min，以反应掉多余的NaIO4 ；(4)将上述反应混合液加入到Iml 28mg/ml的BSA溶液中(称取28mg BSA粉末(北京鼎盛，lot:15310450),用Iml双蒸水(Mill1-Q级别的水也可)溶解，再用5% (w/v)的K2CO3调节PH至9.1-9.5，现用现配)，边搅动边调节PH，确保PH保持在9.1-9.5，室温下反应45min ；(5)加入 Iml 15mg/ml 的 NaBH4,室温下反应 18h ；(6)加入500 μ I IM的甲醇，室温下反应lh，以反应掉多余的NaBH4 ；
(7)加入 350-450 μ I IM 的氨水，调节 PH 至 8.5 ;(8)反应液在流动的水中透析IOh ；(9)质谱或者SDS-PAGE检测确定hmc成功地被偶联到BSA上。MALD1-T0F 4800质谱检测发现未偶联的对照组BSA分子量是66809，但偶联后产物的分子量变成了 69022(图1)。由于偶联后一个hmc分子量是(274-18)，因此，平均一个BSA 分子上偶联的 hmc 数目为:(69022-66809) / (274-18) = 8.3 个。通过SDS-PAGE把未偶联对照组BSA和偶联后产物分离开来,用Coomassic染色发现:反应后BSA比未偶联对照组BSA移动慢,说明反应后hmc已经被成功地偶联到BSA上(图 2)。2.卵清白蛋白OVA与5-羟甲基胞嘧啶hmc偶联的方法(I)称取 5mg hmc,放入 1.5ml 的 Ep 管中；(2)加入500 μ I 0.1M的NaIO4,与hmc室温下暗处反应20min ；(3)加入30μ1 IM的乙二醇，室温下反应5min，以反应掉多余的NaIO4;(4)将上述反应混合液加入到Iml 28mg/ml的OVA溶液中(称取28mg OVA粉末(Sigma，A5503-lG)，用Iml双蒸水(Mill1-Q级别的水也可)溶解，再用5%的K2CO3调节PH至9.1-9.5，现用现配)，边搅动边调节PH，确保PH保持在9.1-9.5，室温下反应45min ；(5)加入 Iml 15mg/ml 的 NaBH4,室温下反应 18h ；(6)加入500 μ I IM的甲醇，室温下反应lh，以反应掉多余的NaBH4 ；⑵加入350_450μ I IM的氨水，调节PH至8.5 ;(8)反应液在流动的水中透析IOh ；(9)质谱检测确定hmC成功地被偶联到OVA上(图3)。同样方法，通过调整摩尔比例，可以把不同的碱基偶联到OVA上(表I)。表1、不同碱基偶联到OVA上所使用的摩尔比例
权利要求
1.一种5-羟甲基胞嘧啶用作检测癌症的标志物的用途。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的癌症包括:脑癌、鳞状上皮癌、乳腺癌、胃癌、肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、子宫癌、胰腺癌、胸腺癌、精原细胞癌、肌肉瘤。
3.一种5-羟甲基胞嘧啶的用途，用于制备检测癌症的试剂。
4.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的检测癌症包括:确定癌症的严重程度或进行癌症的分型。
5.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的5-羟甲基胞嘧啶与载体蛋白连接，用于制备检测癌症的试剂。
6.按权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的载体蛋白选自:牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血监蛋白。
7.一种抗原，其特征在于，所述抗原包含载体蛋白，以及连接于载体蛋白上的一个或多个5-羟甲基胞嘧啶。
8.按权利要求7所述地抗原，其特征在于，所述的载体蛋白选自:牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血监蛋白。
9.权利要求7或8所述的抗原的用途，用于制备检测癌症的试剂。
10.一种特异性识别5-羟甲基胞嘧啶的试剂的用途，用于制备检测癌症的试剂盒。
11.按权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的试剂是特异性识别5-羟甲基胞嘧啶的抗体。
12.一种多克隆抗体，其特异性地识别5-羟甲基胞嘧啶。
13.按权利要求12所述的多克隆抗体，其特征在于，其制备方法为:用权利要求5所述的抗原免疫兔子，获取免疫血清，纯化后获得所述的多克隆抗体。
14.一种单克隆抗体，其特异性识别5-羟甲基胞嘧啶，其由保藏号为CCTCC No:C201191的杂交瘤细胞株产生。
15.一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCNo:C201191。
16.一种用于检测癌症的试剂盒，其中包括特异性识别5-羟甲基胞嘧啶的试剂。
全文摘要
本发明涉及诊断癌症的试剂及试剂盒。本发明首次揭示5-羟甲基胞嘧啶(hmc)在组织中的存在情况与癌症的发生和发展密切相关，组织中hmc水平明显下降提示癌症的发生或发展；并且hmc水平的高低还能指示癌症的严重程度。因此，检测hmc的试剂可良好地应用于癌症的诊断、预后或分型，具有很高的临床应用价值。
文档编号C07K14/795GK103091492SQ20111034658
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者陈德桂, 张丰, 刘一帆 申请人:中国科学院上海生命科学研究院