专利名称：一种利用葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法
技术领域：
本发明涉及一种葡糖杆菌(Gluconobacter sp. ) CGMCC No. 5146产生二羟基丙酮的方法。
背景技术：
二羟基丙酮，又称1，3-二羟基丙酮，简称DHA，英文名为1，3-dihydroxyacetone。 DHA是最简单的酮糖，表观分子式为C3H6O3，分子量为90. 07。DHA外观为白色粉末，有甜味，水溶性> 250g/L(20°C )，在pH 6. O时稳定，熔点为 70 80°C (单体和二聚体的混合物)，易溶于水、乙醇、丙酮及乙醚等溶剂。一般状态下， DHA是以二聚体(l，4-DioXane)形式存在的结晶，但是，经溶解或加热后则变为单体。二羟基丙酮(DHA)是一种天然存在的酮糖，具有生物可降解性，可食用且对人体和环境无毒害。DHA分子中含有3个官能团O个羟基，1个羰基)，化学性质活泼，广泛参与诸如聚合、缩合等各种化学反应，是一个重要的化学合成中间体，也是一个重要的多功能试剂，如在工业应用上，能有效地还原丁二烯-苯乙烯复合物。以DHA为主要成分的保鲜剂可用于果蔬、水产品、肉制品的防腐保鲜。DHA不仅是一种重要药物，也是一种重要的医药中间体，如作为药物已经应用在低血糖与糖尿病的治疗及某些病毒性皮肤病的治疗上。DHA 被广泛应用于化妆品中，与皮肤表层自由氨基结合形成细密的薄膜，起到很好的保湿及防晒作用。DHA的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。目前，国内外DHA的生产主要采用微生物转化甘油的方法。微生物转化甘油生产DHA的原理就是利用微生物代谢产生的甘油脱氢酶，使甘油分子结构中2位C上的羟基进行反应，生成DHA。 因此，理论上凡是能够利用甘油，并且具有相应的甘油脱氢酶系的微生物，都可具有反应条件温和、底物利用率高、副产物少、工艺简单易于控制等优点，以转化甘油生产 DHA。自1898年Bertrand发现利用细菌可以将甘油转化成DHA后，各国科研人员对微生物发酵甘油生产DHA进行了多方面研究，目前用于以甘油为底物生产DHA的菌种主要以弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter Suboxydans)禾口氧化葡H杆菌(Gluconobacter oxydans) 为主，两者都为革兰氏阴性棒状杆菌，属于醋酸杆菌属，且拥有相似的代谢机制。此外，粗状假丝酵母(Candida valida)、粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、 膜璞毕赤酵母(Pichia membranifaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)等也有报道能够将甘油转化为DHA。目前生物法生产DHA中存在底物和产物对生产菌株的抑制效应，从而导致甘油浓度提高时转化率降低，生产周期延长等问题，以及发酵法生产DHA后续分离提取产品工艺中存在的工序复杂、分离能力小、分离成本高及产品收得率低等问题，因此，DHA在国内还未实现工业化生产。本发明针对目前该技术存在的缺陷，通过紫外线和烷化剂EMS复合诱变处理氧化葡糖杆菌出发菌株Gluconobacter oxydans (G. oxydans)，然后经筛选培养基培养后，得到高产诱变菌株葡糖杆菌(GluconcAacter sp.)CGMCC No. 5146。所述诱变菌株具有高甘油脱氢酶活性、产物耐受性和底物耐受性高等特点。另外还选择稳定高效的发酵工艺以提高甘油转化效率，降低生产成本，实现工业化发酵生产DHA。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、节能、操作简单的二羟基丙酮发酵生产新工艺。本发明提供的一种利用葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法，其特征是，所述的葡糖杆菌为葡糖杆菌 Gluconobacter sp.，CGMCC No. 5146。优选的是，所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法中，包括以下步骤步骤一、利用山梨醇为底物的培养基进行初期发酵培养，直到葡糖杆菌 Gluconobacter sp.，CGMCC No. 5146的菌体生长至稳定期，即菌体浓度不再增加；步骤二、将通过步骤一得到的含菌体和产物二羟基丙酮的溶液放置在膜生物反应器中，利用以甘油为底物的培养基进行连续发酵，即在发酵过程中，持续通过膜生物反应器上的膜组件，过滤出不含菌体细胞的澄清的发酵液，同时不断向膜生物反应器中补充新鲜的所述以甘油为底物的培养基。优选的是，所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法中，在步骤二之后还包括步骤三然后分离发酵液中的二羟基丙酮，并进行提纯。优选的是，所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法中，所述膜生物反应器为利用中空纤维超滤内压膜的膜生物反应器。优选的是，所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法中，山梨醇为底物的培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为酵母膏2. O 3.0，蛋白胨1.5 2. 5，山梨醇25. O 35.0， (NH4)2SO4 1. 5 2. 5，MgSO4 · 7Η20 0. 5 1. 5，K2HPO4 · 3H202. O 3. 0，MnSO4 · IH2O 0. 4 0. 6，CaCO3 2. O 3. 0，CaCl2 1. 0 1. 5，ρΗ 5. 0 6. 5，以溶剂水配置。优选的是，所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法中，山梨醇为底物的培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为酵母膏2. 5，蛋白胨2.0，山梨醇30.0，(NH4)2SO4 2.0， MgSO4 · 7H20 1.0，K2HPO4 · 3H20 2. 62，MnSO4 · IH2O 0. 56，CaCO3 2. 5，CaCl2 1· 25，ρΗ6· 0，以溶剂水配置。优选的是，所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法中，所述以甘油为底物的培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为酵母膏2.0 3.0，蛋白胨1.5 2. 5，甘油50.0 70.0， (NH4)2SO4 1. 5 2. 5，MgS04 ·7Η20 0· 5 1· 5，K2HPO4 · 3Η20 2· 0 3· 0，MnSO4 · IH2O 0· 4 0. 6，CaCO3 2. 0 3. 0，CaCl2 1. 0 1. 5，ρΗ 5. 0 6. 5，以溶剂水配置。优选的是，所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法中，所述以甘油为底物的培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为酵母膏2.5，蛋白胨2.0，甘油60.0，(NH4)2SO4 2.0，MgSO4 · 7H20 1.0，K2HPO4 · 3H20 2. 62，MnSO4 · IH2OO. 56，CaCO3 2. 5，CaCl2 1· 25，pH 6· 0，以
溶剂水配置。优选的是，所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法中，所述葡糖杆菌 Gluconobacter sp.，CGMCC No. 5146为通过紫外线和烷化剂EMS复合诱变处理醋酸杆菌属的氧化葡糖杆菌而得到的。优选的是，所述的氧化葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法中，所述连续发酵时间超过400小时。优选的是，所述的氧化葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法中，二羟基丙酮的提纯步骤包括经过所述离子交换处理后的二羟基丙酮滤液于40°C下真空蒸发直至近干，得到浓缩物，然后向浓缩物中边搅拌边加入3倍体积的无水乙醇，得到二羟基丙酮乙醇溶液，再将所述二羟基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸发至近干，重复上述步骤至有晶体出现，此时得到饱和二羟基丙酮乙醇溶液，将所述二羟基丙酮乙醇溶液置于5°C低温恒温槽中搅拌，直至出现大量晶体，然后将晶体过滤出并在低于40°C的真空干燥箱内干燥，得到二羟基丙酮固体；将上述步骤所得二羟基丙酮固体溶于水中，得到二羟基丙酮水溶液，然后40°C下将二羟基丙酮水溶液真空蒸发直至近干，得到浓缩物，向浓缩物中边搅拌边加入3倍体积的无水乙醇，得到二羟基丙酮乙醇溶液，再将所述二羟基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸发至近干，重复上述步骤至有晶体出现，此时得到饱和二羟基丙酮乙醇溶液，将所述二羟基丙酮乙醇溶液置于5°C低温恒温槽中搅拌，直至出现大量晶体，然后将晶体过滤出并在低于 40°C的真空干燥箱内干燥，即得到纯化的二羟基丙酮晶体。本发明提供的一种利用葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法包括以下步骤1)利用山梨醇为底物的培养基进行初期发酵培养，山梨醇初始浓度为30g/ L，发酵温度观°〇，pH6.0，溶氧值控制在1.8mg/L，稀释率控制在0. 151Γ1，直到葡糖杆菌 Gluconobacter sp.，CGMCC No. 5146的菌体生长至稳定期，即菌体浓度不再增加。2)将通过步骤一得到的含菌体和产物二羟基丙酮的溶液放置在中空纤维超滤内压膜的膜生物反应器中，利用以甘油为底物的培养基进行连续发酵，即在发酵过程中，持续通过膜生物反应器上的膜组件，过滤出不含菌体细胞的澄清的发酵液，同时不断向膜生物反应器中补充新鲜的所述以甘油为底物的培养基，溶氧值控制在1.8mg/L，稀释率控制在 .巧一，发酵温度观！，？朋^，发酵培养产生含有二羟基丙酮(DHA)的发酵液。3)取上述含二羟基丙酮的发酵液以6 7mL/min的速度分别流过阳离子(001X7 型强酸性)和阴离子(302凝胶型弱碱性苯乙烯系)交换树脂柱，收集滤液，然后再用去离子水淋洗阳、阴离子交换树脂，收集滤液直至流出液中无DHA检出。4)经过上述离子交换处理后的二羟基丙酮滤液于40°C下真空蒸发直至近干，得到浓缩物，然后向浓缩物中边搅拌边加入3倍体积的无水乙醇，得到二羟基丙酮乙醇溶液， 再将所述二羟基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸发至近干，重复上述步骤至有晶体出现，此时得到饱和二羟基丙酮乙醇溶液，将所述二羟基丙酮乙醇溶液置于5°C低温恒温槽中搅拌， 直至出现大量晶体，然后将晶体过滤出并在低于40°C的真空干燥箱内干燥，得到二羟基丙酮固体。
5)将上述步骤所得二羟基丙酮固体溶于水中，得到二羟基丙酮水溶液，然后40°C 下将二羟基丙酮水溶液真空蒸发直至近干，得到浓缩物，向浓缩物中边搅拌边加入3倍体积的无水乙醇，得到二羟基丙酮乙醇溶液，再将所述二羟基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸发至近干，重复上述步骤至有晶体出现，此时得到饱和二羟基丙酮乙醇溶液，将所述二羟基丙酮乙醇溶液置于5°C低温恒温槽中搅拌，直至出现大量晶体，然后将晶体过滤出并在低于 40°C的真空干燥箱内干燥，即得到纯化的DHA晶体。本发明提供的一种利用葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法具有以下突出特点1)通过紫外线和烷化剂EMS复合诱变处理氧化葡糖杆菌出发菌株Gluconobacter oxydans(G. oxydans)，然后经筛选培养基培养后，得到高产诱变菌株葡糖杆菌 (Gluconobacter sp.) CGMCC No. 5146。该菌株在甘油浓度达到150g/L时仍有高活性，相对于现有菌株当甘油浓度达到或超过80 120g/L时，菌体就会裂解、失活的情况，更适合于工业化大生产；2)膜生物反应器连续生产DHA，可分别创造适合微生物细胞生长及产物生产的良好环境，避免了高浓度底物、高浓度DHA对细胞生长及甘油到DHA转化过程的抑制作用，实现了细胞的充分增殖和与产物的生产；3)采用超滤和阳离子交换吸附技术分离纯化DHA。在连续发酵过程中利用膜的选择性滤过作用，即时引出DHA，使反应和分离同时进行，简化了工艺过程，缩短了工艺时间， 提高了产品收率，降低了溶剂消耗和环境污染；本发明以紫外、EMS诱变出的高产菌株为出发菌株，在膜反应器中制取DHA，并采用超滤和离子交换吸附技术提纯DHA，具有操作简单方便、节能、生产效率高等特点，适合于工业化大规模生产。
图1为该发明氧化葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法的工艺流程图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。葡糖杆菌(GluconcAacter sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏号CGMCC No. 5146，保藏日期2011年08月16日。实施例1将葡糖杆菌(GluconcAacter sp.) CGMCC No. 5146利用山梨醇为底物的培养基进行初期发酵培养，山梨醇初始浓度为30g/L，发酵温度观1，？!1 6.0。菌体开始生长缓慢，在连续发酵达到稳定期后，在中空纤维超滤内压膜的膜生物反应器内以甘油为底物的培养基进行连续发酵，连续发酵过程中膜生物反应器不断引出不含菌体的产物DHA同时补加新鲜培养基，减少了发酵罐中高浓度底物积累对发酵过程的抑制，使得DHA的积累在较长的时间内进行。同时整个发酵过程中菌体未引出，但DHA产物依然得到稳定积累，这证实了葡糖杆菌在菌体细胞减缓生长或，完全停止生长时，仍可氧化甘油生成DHA。连续发酵反应温度控制在，用5%的NaOH调节pH，维持在6. 0，分别测定发酵液中DHA与菌体浓度。取IL膜反应后的发酵液以6-7mL/min的速度分别流过阳离子(001 X 7型强酸性) 和阴离子(302凝胶型弱碱性苯乙烯系)交换树脂柱(阳、阴离子交换树脂的体积为400mL， 高径比为20 1)，收集滤液，然后用去离子水淋洗阳、阴离子交换树脂，收集滤液直至流出液中无DHA检出。经过离子交换处理后的二羟基丙酮滤液于40°C下真空蒸发直至近干，得到浓缩物，然后向浓缩物中边搅拌边加入3倍体积的无水乙醇，得到二羟基丙酮乙醇溶液，再将所述二羟基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸发至近干，重复上述步骤至有晶体出现，此时得到饱和二羟基丙酮乙醇溶液，将所述二羟基丙酮乙醇溶液置于5°C低温恒温槽中搅拌，直至出现大量晶体，然后将晶体过滤出并在低于40°C的真空干燥箱内干燥，得到二羟基丙酮固体。将上述步骤所得二羟基丙酮固体溶于水中，得到二羟基丙酮水溶液，然后40°C下将二羟基丙酮水溶液真空蒸发直至近干，得到浓缩物，向浓缩物中边搅拌边加入1倍体积的无水乙醇，得到二羟基丙酮乙醇溶液，再将所述二羟基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸发至近干，重复上述步骤至有晶体出现，此时得到饱和二羟基丙酮乙醇溶液，将所述二羟基丙酮乙醇溶液置于5°C低温恒温槽中搅拌，直至出现大量晶体，然后将晶体过滤出并在低于 40°C的真空干燥箱内干燥，即得到纯化的DHA晶体。甘油转化率达到90%以上，收率达到 80%以上。实施例2将葡糖杆菌(GluconcAacter sp.) CGMCC No. 5146利用山梨醇为底物的培养基进行初期发酵培养，山梨醇初始浓度为30g/L，发酵温度观1，？!1 6.0。菌体开始生长缓慢，在连续发酵达到稳定期后，在中空纤维超滤内压膜的膜生物反应器内以甘油为底物的培养基进行连续发酵，连续发酵过程中膜生物反应器不断引出不含菌体的产物DHA同时补加新鲜培养基，减少了发酵罐中高浓度底物积累对发酵过程的抑制，使得DHA的积累在较长的时间内进行。同时整个发酵过程中菌体未引出，但DHA产物依然得到稳定积累，这证实了葡糖杆菌在菌体细胞减缓生长或，完全停止生长时，仍可氧化甘油生成DHA。连续发酵反应温度控制在，用5%的NaOH调节pH，维持在6. 0，分别测定发酵液中DHA与菌体浓度。取IL膜反应后的发酵液以6-7mL/min的速度分别流过阳离子(001 X 7型强酸性) 和阴离子(302凝胶型弱碱性苯乙烯系)交换树脂柱(阳、阴离子交换树脂的体积为400mL， 高径比为20 1)，收集滤液，然后用去离子水淋洗阳、阴离子交换树脂，收集滤液直至流出液中无DHA检出。经过离子交换处理后的二羟基丙酮滤液于40°C下真空蒸发直至近干，得到浓缩物，然后向浓缩物中边搅拌边加入3倍体积的无水乙醇，得到二羟基丙酮乙醇溶液，再将所述二羟基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸发至近干，重复上述步骤至有晶体出现，此时得到饱和二羟基丙酮乙醇溶液，将所述二羟基丙酮乙醇溶液置于5°C低温恒温槽中搅拌，直至出现大量晶体，然后将晶体过滤出并在低于40°C的真空干燥箱内干燥，得到二羟基丙酮固体将上述步骤所得二羟基丙酮固体溶于水中，得到二羟基丙酮水溶液，然后40°C下将二羟基丙酮水溶液真空蒸发直至近干，得到浓缩物，向浓缩物中边搅拌边加入2倍体积的无水乙醇，得到二羟基丙酮乙醇溶液，再将所述二羟基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸发至近干，重复上述步骤至有晶体出现，此时得到饱和二羟基丙酮乙醇溶液，将所述二羟基丙酮乙醇溶液置于5°C低温恒温槽中搅拌，直至出现大量晶体，然后将晶体过滤出并在低于 400C的真空干燥箱内干燥，即得到纯化的DHA晶体。甘油转化率达到90%以上，收率达到 80%以上。实施例3其他步骤和条件相同，DHA的纯化过程中加入3倍的无水乙醇去除杂质。甘油转化率达到90%以上，收率达到80%以上。实施例4其他步骤和条件相同，DHA的纯化过程中加入4倍的无水乙醇去除杂质。甘油转化率达到90%以上，收率达到80%以上。实施例5其他步骤和条件相同，DHA的纯化过程中加入5倍的无水乙醇去除杂质。甘油转化率达到90%以上，收率达到80%以上。实施例6将葡糖杆菌(GluconcAacter sp.) CGMCC No. 5146利用山梨醇为底物的培养基进行初期发酵培养，所述培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为酵母膏2.0，蛋白胨1.5，山梨醇 25. 0，(NH4)2SO4 1. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，K2HPO4 · 3Η202· 0，MnSO4 · IH2O 0. 4，CaCO3 2. 0， CaCl2 1. 0，以溶剂水配置，山梨醇初始浓度为30g/L，发酵温度^°C，pH5. 0，菌体开始生长缓慢，在连续发酵达到稳定期后，在中空纤维超滤内压膜的膜生物反应器内以甘油为底物的培养基进行连续发酵，甘油为底物的培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为酵母膏2.0， 蛋白胨 1. 5，甘油 50. 0，(NH4)2SO4 1. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，K2HPO4 · 3Η202· 0，MnSO4 · IH2O 0. 4， CaCO3 2.0, CaCl2 1.0, ρΗ 5. 0，以溶剂水配置，连续发酵过程中膜生物反应器不断引出不含菌体的产物DHA同时补加新鲜培养基，减少了发酵罐中高浓度底物积累对发酵过程的抑制，使得DHA的积累在较长的时间内进行。同时整个发酵过程中菌体未引出，但DHA产物依然得到稳定积累，这证实了葡糖杆菌在菌体细胞减缓生长或，完全停止生长时，仍可氧化甘油生成DHA。连续发酵反应温度控制在^°C，用5%的NaOH调节pH，维持在6.0，分别测定发酵液中DHA与菌体浓度。取IL膜反应后的发酵液以6-7mL/min的速度分别流过阳离子(001 X 7型强酸性) 和阴离子(302凝胶型弱碱性苯乙烯系)交换树脂柱(阳、阴离子交换树脂的体积为400mL， 高径比为20 1)，收集滤液，然后用去离子水淋洗阳、阴离子交换树脂，收集滤液直至流出液中无DHA检出。经过离子交换处理后的二羟基丙酮滤液于40°C下真空蒸发直至近干，得到浓缩物，然后向浓缩物中边搅拌边加入3倍体积的无水乙醇，得到二羟基丙酮乙醇溶液，再将所述二羟基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸发至近干，重复上述步骤至有晶体出现，此时得到饱和二羟基丙酮乙醇溶液，将所述二羟基丙酮乙醇溶液置于5°C低温恒温槽中搅拌，直至出现大量晶体，然后将晶体过滤出并在低于40°C的真空干燥箱内干燥，得到二羟基丙酮固体将上述步骤所得二羟基丙酮固体溶于水中，得到二羟基丙酮水溶液，然后40°C下将二羟基丙酮水溶液真空蒸发直至近干，得到浓缩物，向浓缩物中边搅拌边加入3倍体积的无水乙醇，得到二羟基丙酮乙醇溶液，再将所述二羟基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸发至近干，重复上述步骤至有晶体出现，此时得到饱和二羟基丙酮乙醇溶液，将所述二羟基丙酮乙醇溶液置于5°C低温恒温槽中搅拌，直至出现大量晶体，然后将晶体过滤出并在低于 400C的真空干燥箱内干燥，即得到纯化的DHA晶体。甘油转化率达到90%以上，收率达到 80%以上。实施例7山梨醇为底物的培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为酵母膏2. 5，蛋白胨2.0， 山梨醇 30，(NH4)2SO4 2. 0，MgSO4 · 7H20 1.0，K2HPO4 · 3H20 2. 5，MnSO4 · IH2O 0. 5，CaCO3 2. 5， CaCl2 1. 2，以溶剂水配置，pH 6. 0，以溶剂水配置。甘油为底物的培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为酵母膏2.5，蛋白胨2.0，甘油 60，(NH4)2SO4 2. 0，MgS04 ·7Η20 L 0，K2HPO4 ·3Η20 2. 5，MnSO4 · IH2O 0. 5, CaCO3 2. 5, CaCl2 1.2，ρΗ6. 0，以溶剂水配置。其余条件同实施例6，甘油转化率达到90%以上，收率达到80%以上。实施例8山梨醇为底物的培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为酵母膏3.0，蛋白胨2. 5， 山梨醇 35. 0，(NH4)2SO4 2. 5，MgSO4 · 7H20 1. 5，K2HPO4 · 3H20 3. 0，MnSO4 · IH2O 0. 6，CaCO3 3. 0，CaCl2 1. 5，以溶剂水配置，pH 6. 5，以溶剂水配置。甘油为底物的培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为酵母膏3.0，蛋白胨2.5，甘油 70. 0，(NH4)2SO4 2. 5，MgSO4 · 7H20 1. 5，K2HPO4 · 3H20 3. 0，MnSO4 · IH2O 0. 6，CaCO3 3. 0， CaCl2 1. 5，pH6. 5，以溶剂水配置。其余条件同实施例6，甘油转化率达到90%以上，收率达到80%以上。实施例9通过紫外线诱变处理葡糖杆菌出发菌株Gluconobacter oxydans (G. oxydans)后经筛选培养基培养后，再用烷化剂EMS进行二次诱变处理，筛选得到高产诱变菌株葡糖杆菌(Gluconobacter sp.)CGMCC No. 5146。其中紫外线诱变是指将葡糖杆菌出发菌株在PDA斜面培养基上30°C，培养2-3d。 PDA斜面培养基组成，质量(g)体积(L)比葡萄糖100.0，酵母膏10.0，CaCO3 20.0，琼脂 18.0，以溶剂水配置，pH 6.8。配置好的固体筛选培养基于121°C杀菌25min后使用。用接种环接种在种子培养基中过夜培养，使之处于对数生长期。收集菌种细胞，用生理盐水洗涤两次后，菌种细胞悬浮于生理盐水中，调整菌种细胞浓度为IO8个/mL左右，将平板放置在距30W紫外灯光源30cm的地方照射50s。紫外线照射后，将菌种细胞涂布于固体筛选培养基平板上，30°C培养2d，固体筛选培养基，其组成为酵母膏lg，葡萄糖5g，碳酸钙0. 39，甘油5g溶于IOOmL 1.8%营养琼脂中。实验菌在平板上分离接种，培养3_4d后在平板上倒入裴林氏剂O^hling)溶液。裴林氏溶液A液=CuSO4 · 5H20 34. 66g用500mL蒸馏水溶解。B 液酒石酸钾钠(KNaC4H4O6 · 4H20) 173g、氢氧化钠50g溶于500mL蒸馏水中。A液和B液分别贮存于4°C冰箱中，用前按1 1混合。池后，检查生长物周围是否出现红色晕圈。挑选正突变单菌落进行摇瓶发酵性能试验，筛选出发酵单位高的正突变菌落。EMS诱变是指为用0. lmol/L EMS诱变剂与经紫外诱变挑选出的正突变菌落制成的单孢子悬液混合处理30min，诱变完成后稀释终止反应。挑选正突变单菌落进行摇瓶发酵性能试验，筛选出发酵单位高的正突变菌落。经EMS诱变筛选出来的即发酵单位高的菌株即为高产诱变菌株葡糖杆菌(Gluconobacter sp.)CGMCC No· 5146。 最后需要强调的是以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种利用葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法，其特征是，所述的葡糖杆菌为葡糖杆菌 Gluconobacter sp.，CGMCC No. 5146。
2.如权利要求1所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法，其特征是，包括以下步骤步骤一、利用山梨醇为底物的培养基进行初期发酵培养，直到葡糖杆菌Gluconobactersp.，CGMCC No. 5146的菌体生长至稳定期，即菌体浓度不再增加；步骤二、将通过步骤一得到的含菌体和产物二羟基丙酮的溶液放置在膜生物反应器中，利用以甘油为底物的培养基进行连续发酵，即在发酵过程中，持续通过膜生物反应器上的膜组件，过滤出不含菌体细胞的澄清的发酵液，同时不断向膜生物反应器中补充新鲜的所述以甘油为底物的培养基。
3.如权利要求1所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法，其特征是，在步骤二之后还包括步骤三然后分离发酵液中的二羟基丙酮，并进行提纯。
4.如权利要求2或3所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法，其中，所述膜生物反应器为利用中空纤维超滤内压膜的膜生物反应器。
5.如权利要求4所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法，其中，山梨醇为底物的培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为酵母膏2. O 3.0，蛋白胨1.5 2. 5，山梨醇25. O 35. 0，(NH4)2SO4 1. 5 2. 5，MgSO4 · 7Η20 0. 5 1. 5，K2HPO4 · 3Η20 2. O 3. 0，MnSO4 · IH2O 0. 4 0. 6，CaCO3 2. 0 3. 0，CaCl2L 0 1. 5，pH 5. 0 6. 5，以溶剂水配置。
6.如权利要求5所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法，其中，山梨醇为底物的培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为酵母膏2. 5，蛋白胨2.0，山梨醇30.0，(NH7)2SO4 2.0， MgSO4 · 7H20 1. 0，K2HPO4 · 3H20 2. 62，MnSO4 · IH2OO. 56，CaCO3 2. 5，CaCl2 1. 25，ρΗ6· 0，以溶剂水配置。
7.如权利要求5或6所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法，其中，所述以甘油为底物的培养基组成，重量(g) /体积(L)比，为酵母膏2. 0 3. 0，蛋白胨1. 5 2. 5，甘油50. 0 70. 0，(NH4)2SO4 1. 5 2. 5，MgSO4 · 7Η200· 5 1. 5，K2HPO4 · 3Η20 2. 0 3. 0，MnSO4 · IH2O 0. 4 0. 6，CaCO3 2. 0 3. 0，CaCl2 1. 0 1. 5，pH 5. 0 6. 5，以溶剂水配置。
8.如权利要求7所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法，其中，所述以甘油为底物的培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为酵母膏2. 5，蛋白胨2.0，甘油60.0，(NH4)2SO4 2.0， MgSO4 · 7H20 1.0，K2HPO4 · 3H20 2. 62，MnSO4 · IH2OO. 56，CaCO3 2. 5，CaCl2 1· 25，pH 6· 0，以溶剂水配置。
9.如权利要求4所述的葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法，其中，所述葡糖杆菌 Gluconobacter sp.，CGMCC No. 5146为通过紫外线和烷化剂EMS复合诱变处理醋酸杆菌属的氧化葡糖杆菌而得到的。
10.如权利要求4所述的氧化葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法，其中，所述连续发酵时间超过400小时。
11.如权利要求3所述的氧化葡糖杆菌产生二羟基丙酮的方法，其中，二羟基丙酮的提纯步骤包括经过所述离子交换处理后的二羟基丙酮滤液于40°C下真空蒸发直至近干，得到浓缩物，然后向浓缩物中边搅拌边加入3倍体积的无水乙醇，得到二羟基丙酮乙醇溶液，再将所述二羟基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸发至近干，重复上述步骤至有晶体出现，此时得到饱和二羟基丙酮乙醇溶液，将所述二羟基丙酮乙醇溶液置于5°C低温恒温槽中搅拌，直至出现大量晶体，然后将晶体过滤出并在低于40°C的真空干燥箱内干燥，得到二羟基丙酮固体；将上述步骤所得二羟基丙酮固体溶于水中，得到二羟基丙酮水溶液，然后40°C下将二羟基丙酮水溶液真空蒸发直至近干，得到浓缩物，向浓缩物中边搅拌边加入3倍体积的无水乙醇，得到二羟基丙酮乙醇溶液，再将所述二羟基丙酮乙醇溶液于40°C下真空蒸发至近干，重复上述步骤至有晶体出现，此时得到饱和二羟基丙酮乙醇溶液，将所述二羟基丙酮乙醇溶液置于5°C低温恒温槽中搅拌，直至出现大量晶体，然后将晶体过滤出并在低于40°C 的真空干燥箱内干燥，即得到纯化的二羟基丙酮晶体。
全文摘要
本发明提供了一种利用葡糖杆菌(Gluconobacter sp.)CGMCC No.5146生产二羟基丙酮的方法，其中，包括以下步骤利用山梨醇为底物的培养基进行初期发酵培养，直到葡糖杆菌的菌体生长至稳定期，将所得到的含菌体和产物二羟基丙酮的溶液放置在膜生物反应器中，利用以甘油为底物的培养基进行连续发酵，持续通过膜生物反应器过滤出不含菌体的发酵液，同时不断向膜生物反应器中补充新鲜的以甘油为底物的培养基，分离发酵液中的二羟基丙酮，并进行提纯。底物甘油浓度60g/L时，DHA浓度56.75g/L，体积产率9.02g/(L.h)，甘油转化率达到90％以上，收率达到80％以上，突破了微生物发酵法制取二羟基丙酮产率低、成本高的技术瓶颈。本发明具有操作简单方便、节能、生产效率高等特点，适合于工业化大规模生产。
文档编号C07H1/06GK102382868SQ201110356248
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者张桐, 徐莉, 王福清 申请人:中科医药行业生产力促进中心有限公司