专利名称：乙酰化过低和过高的脑膜炎球菌荚膜糖的制作方法
技术领域：
本发明涉及脑膜炎球 菌荚膜糖及其偶联衍生物的领域。
背景技术：
多糖是重要的生物分子，它们广泛地应用于预防和治疗疾病的制药工业。例如，荚膜多糖在抗带荚膜的细菌，如脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis))、肺炎球菌(肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))和Hib (B型流感嗜血菌(Haemophilus infiuenzae))的疫苗中使用多年。为增强荚膜多糖，特别是在儿童中的免疫原性，开发了偶联疫苗。这些疫苗含有与载体蛋白偶联的荚膜糖[例如，参考文献1-3]。偶联将不依赖于T的抗原转变为依赖于T的抗原。脑膜炎奈瑟球菌血清群W135( "Menff 135")的荚膜糖含有唾液酸-半乳糖二糖单位的聚合物— 4)_D_Neup5Ac(7/90Ac)- a -(2 — 6)-D-Gal- a -(I —其中“Neu”指通常称为唾液酸的神经氨酸。类似地，脑膜炎奈瑟球菌血清群Y (MenY)的荚膜糖含有唾液酸-葡萄糖二糖单位的聚合物— 4)_D_Neup5Ac(7/90Ac)- a -(2 — 6)-D-Glc- a -(I —实质上，这些荚膜糖在一些唾液酸残基的一些7和9位发现是0-乙酰化的。W135糖的0-乙酰化在参考文献4中“首次报道”，该文献报道了在0-7和0-9位的0-乙酰化。虽然作者注意到以前的工作表明0-乙酰化在0-7、0/ -3或0' -4位发生，但血清群Y糖的0-7和0-9位也观察到乙酰化。参考文献5报道了糖的0-乙酰基含量的进一步研究。参考文献5报道就血清群W135而言，“有越来越多的证据显示0-乙酰化在引发保护性抗体应答中不重要”。相反，参考文献6报道“有证据表明0-乙酰化影响多糖疫苗的免疫原性”。假定“CPS[荚膜多糖]的0-乙酰化在引发保护性免疫力中不重要”，然而参考文献5的作者研究了血清群W135和Y的乙酰化。他们的研究结果表明这两种血清群于室温在碱性条件下保存9天后0-乙酰化无变化。参考文献7报道于四价多糖疫苗中的“W135和Y菌株的0-乙酰化状态”以前“未报道”。作者在参考文献8中继续报道“关于血清群W135和Y的0-乙酰化状态知之甚少”，并且他们说进一步的工作“可增进对最优化疫苗制剂的了解”，然而这种进一步工作的本质和可能的了解并未详细描述。参考文献9报道血清群W135的“0-乙酰化与疫苗开发的关联性尚未确定”。参考文献6同意“0-乙酰化对血清群W-135或Y多糖的免疫原性的影响尚未获得”的论据(2004年I月)。
对血清群W135和Y的这种误解和信息的缺乏与当前用作糖疫苗的两种其它血清群完全不同。脑膜炎奈瑟球菌血清群C荚膜多糖的0-乙酰化差异已广泛报道[10、11]，但似乎对免疫原性无任何负面影响，因为Men jugate 和NeisVac-C 产品均是有效的。相反，血清群A多糖的脱-0-乙酰化与“免疫原性的显著降低”有关[12]。本发明的目标是提供用于生产免疫原性组合物，特别是当偶联于载体蛋白和脑膜炎血清群W135和Y时的荚膜糖衍生物。
发明内容
尽管0-乙酰化在脑膜炎球菌血清群W135和Y疫苗中的作用不确定，本发明人发现0-乙酰化实际上是有关的，特别是在制备偶联疫苗期间。本发明是基于以下发现来源于MenW135和MenY并改变唾液酸残基7和9位的0-乙酰化水平的修饰荚膜糖可用于制造免疫原性组合物。相对于未修饰的天然糖，本发明的衍生物在与载体蛋白偶联期间择优选择。此外，与天然多糖相比，这些衍生物的偶联物显示提高了免疫原性。修饰的糖因此，本发明提供修饰的血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖，其中(a)糖中<的唾液酸残基在7位是0-乙酰化的；和/或(b)糖中> y%的唾液酸残基在9位是0-乙酰化的。类似地，本发明提供修饰的血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖，其中(a)糖中的唾液酸残基在7-位是0-乙酰化的；和/或(b)糖中> 7%或< 2%的唾液酸残基在9位是
0-乙酰化的。X的值取决于血清群就血清群W135而言，X是29或更少(例如，28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0. 5 或 0);就血清群Y而言，X是9或更少(例如，8、7、6、5、4、3、2、1、0. 5或0)。y的值也取决于血清群就血清群W135而言，y是26或更多(例如，27、28、29、30、
31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、
56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、
81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100);就血清群 Y 而言，y 是 29 或更多(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、
98,99或 100)。z 值是 27 或更少(例如，26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0. 5 或 0)。优选X >m，其中选自0、0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10。优选z > p，其中 p 选自0,0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10。本发明的糖更具体地说，本发明提供任选与载体蛋白偶联的修饰的脑膜炎球菌荚膜糖，其中该糖含有n个或更多个二糖重复单元{[唾液酸]-[己糖]}，其中己糖是半乳糖或葡萄糖，n是1-100的整数，并且其中(a)在所述n个或更多个重复单元中< x%的唾液酸残基在7、位是O-乙酰化的；和/或 (b)当己糖是半乳糖时，在所述n个或更多个重复单元中> y%的唾液酸残基在9位是0-乙酰化的，并且当己糖是葡萄糖时，在所述n个或更多个重复单元中彡或彡z %的唾液酸残基在9位是0-乙酰化的。X值取决于己糖当己糖是半乳糖时，X是29或更少(例如，28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0. 5 或 0);当己糖是葡萄糖时，X是9或更少(例如，8、7、6、5、4、3、2、1、0. 5或0)。y的值取决于己糖当己糖是半乳糖时，y是26或更多(例如，27、28、29、30、31、
32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、
57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、
82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100)；当己糖是葡萄糖时，y 是 29 或更多(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、
98,99或 100)。z 值是 27 或更少(例如，26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、
10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0. 5 或 0)。如上定义的，优选x>m。如上定义的，优选z >p。唾液酸残基优选是N-乙酰神经氨酸。当己糖是半乳糖时，{[唾液酸]-[己糖]} 二糖单元优选是— 4)_D_Neup5Ac(7/90Ac)- a -(2 — 6)-D-Gal- a - (I —当己糖是葡萄糖时，{[唾液酸]-[己糖]} 二糖单元优选是— 4)_D_Neup5Ac(7/90Ac)- a -(2 — 6)-D-Glc- a -(I —修饰的脑膜炎球菌荚膜糖优选与载体蛋白偶联。在这种偶联物中(i)优选2-9%之间、更优选4-8%之间、还要优选5-7%之间、再优选约6%的唾液酸残基在7位0-乙酰化；(ii)优选35-55%之间、更优选40-50%之间、还要优选42-46%之间、再优选约43%(当己糖是Gal)或约45% (当己糖是Glc)的唾液酸残基在9位0-乙酰化。本发明也提供包含a分子个血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖的组合物，其中每个荚膜糖分子的唾液酸残基的平均数目是b，并且其中(a)组合物中< x%的a *b个血清群W135唾液酸残基在7位0-乙酰化；和/或(b)组合物中> y%的a *b个血清群W135唾液酸残基在9位0-乙酰化，并且其中x、y和z如上定义。本发明也提供包含a分子个血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖的组合物，其中每个荚膜糖分子的唾液酸残基的平均数目是b，并且其中(a)组合物中彡x%的a *b个血清群Y唾液酸残基在7位0-乙酰化；和/或(b)组合物中彡y%或彡z %的a *b个血清群Y唾液酸残基在9位0-乙酰化,并且其中x、y和z如上定义。所述种群中的糖可偶联于蛋白质运载体和/或游离于溶液中。本发明的糖或偶联物优选是纯化的形式，例如基本上在没有天然多糖的情况下。结构表示 本发明提供一种任选偶联于载体蛋白的糖，该糖含有n个或更多个以下二糖重复单元
权利要求
1.一种修饰的血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖，其中(a)所述糖中< 29%的唾液酸残基在7位是O-こ酰化的；和/或(b)所述糖中彡26%的唾液酸残基在9位是O-こ酰化的。
2.一种修饰的血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖，其中(a)所述糖中<9%的唾液酸残基在7位是O-こ酰化的；和/或(b)所述糖中彡29%或彡27%的唾液酸残基在9位是O-こ酰化的。
3.如权利要求I或2所述的修饰的脑膜炎球菌荚膜糖，其特征在于，所述糖中>O %的唾液酸残基在7位是O-こ酰化的。
4.如权利要求I或2所述的修饰的脑膜炎球菌荚膜糖，其特征在于，所述糖中>O %的唾液酸残基在9位是O-こ酰化的。
5.一种任选偶联于载体蛋白的修饰的脑膜炎球菌荚膜糖，其中所述糖含有η个或更多个ニ糖重复单元 {[唾液酸]-[己糖]}， 其中的己糖是半乳糖或葡萄糖，η是1-100的整数，并且其中 (a)在所述η个或更多个重复单元中<χ%的唾液酸残基在7位是O-こ酰化的；和/或 (b)当己糖是半乳糖时，在所述η个或更多个重复単元中>的唾液酸残基在9位是O-こ酰化的，并且当己糖是葡萄糖时，在所述η个或更多个重复单元中> 7%或< ζ%的唾液酸残基在9位是O-こ酰化的， 其中当己糖是半乳糖时，X是29且y是26 ;当己糖是匍萄糖时，x是9、y是29且z是27。
6.如权利要求5所述的糖，其特征在于，所述己糖是半乳糖，在所述η个或更多个重复单元中约6%的唾液酸残基在7位是O-こ酰化的，并且在所述η个或更多个重复单元中约43%的唾液酸残基在9位是O-こ酰化的。
7.如权利要求5所述的糖，其特征在于，所述己糖是葡萄糖，在所述η个或更多个重复单元中约6%的唾液酸残基在7位是O-こ酰化的，并且在所述η个或更多个重复单元中约45%的唾液酸残基在9位是O-こ酰化的。
8.ー种含有血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖分子的组合物，其中每个荚膜糖分子的唾液酸残基平均数目是b，并且其中(a)组合物中彡29%的a *b个血清群Wl 35唾液酸残基在7位O-こ酰化；和/或(b)组合物中彡26%的a · b个血清群W135唾液酸残基在9位O-こ酸化。
9.ー种含有血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖分子的组合物，其中每个荚膜糖分子的唾液酸残基平均数目是b，并且其中(a)组合物中< 9%的a · b个血清群Y唾液酸残基在7位O-こ酰化；和/或(b)组合物中彡29 %或彡27 %的a · b个血清群Y唾液酸残基在9位O-こ酸化。
10.如权利要求8或9所述的组合物，其特征在于，所述荚膜糖偶联于蛋白质运载体。
11.ー种含有η个或更多个以下ニ糖重复单元的糖
12.如以上任一项权利要求所述的糖，其特征在于，所述糖具有低于30的平均聚合度。
13.(i)以上任一项权利要求所述的糖和(ii)选自白喉类毒素、破伤风类毒素、流感嗜血菌蛋白D和CRM197的载体蛋白的偶联产物。
14.ー种免疫原性组合物，所述组合物含有(a)以上任一项权利要求所述的修饰的荚膜糖或偶联物，和(b)药学上可接受的运载体。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述组合物呈含水形式。
16.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述组合物呈冻干形式。
17.如权利要求14-16中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有来自血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖抗原。
18.如权利要求14-17中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有来自血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖抗原。
19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述血清群A抗原。
20.如权利要求14-19中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的抗原。
21.如权利要求14-20中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有来自B型流感嗜血菌的糖抗原。
22.如权利要求14-21中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有来自肺炎链球菌的抗原。
23.如权利要求14-22中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有ー种或多种以下抗原甲肝病毒的抗原；こ肝病毒的抗原；百日咳博德特菌的抗原；白喉类毒素；破伤风类毒素和/或脊髄灰质炎病毒抗原。
24.如权利要求14-23中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物用作药物。
25.ー种用于产生哺乳动物的抗体应答的方法，所述方法包括将权利要求14-23中任一项所述的组合物给予哺乳动物。
26.如权利要求1-13中任一项所述的修饰的血清群W135脑膜炎球菌荚膜糖和/或修饰的血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖在生产抗脑膜炎球菌性脑膜炎的药物中的应用。
27.一种制备免疫原性偶联物的方法，所述方法包括以下步骤(1)提供起始血清群W135或血清群Y脑膜炎球菌荚膜糖和载体蛋白，其中一个或两个均是任选修饰的以赋予它/它们与另ー个的反应性；(2)在糖和载体蛋白之间形成共价键；和(3)纯化得到的糖偶联物，其中，在步骤(I)和(3)之间，起始糖中唾液酸残基9位的O-こ酰化程度増加。
全文摘要
乙酰化过低和过高的脑膜炎球菌荚膜糖。来自脑膜炎奈瑟球菌的血清群W135和Y的荚膜糖改变了它们的唾液酸残基的7和9位的O-乙酰化水平，并且可用于产生免疫原性组合物。相对于未修饰的天然糖，本发明的衍生物在与载体蛋白偶联期间择优选择，并且与天然多糖相比，这些衍生物的偶联物显示提高了免疫原性。
文档编号C07H13/06GK102633893SQ201110359118
公开日2012年8月15日 申请日期2004年10月4日 优先权日2003年10月2日
发明者F·贝蒂, P·科斯坦蒂诺 申请人:诺华疫苗和诊断有限公司