专利名称：一种具有三螺旋结构的活性胶原的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有三螺旋结构的活性胶原的制备方法，属于蛋白质工程领域， 该产品为保持三螺旋结构的活性胶原，具有低免疫原性、高生物相容性，可生物降解，适用于医疗用途。
背景技术：
胶原是脊椎动物体内含量最丰富、分布最广泛的一组硬蛋白，分子量约为300000， 均可在细胞外形成超分子聚集物，大量存在于骨、软骨、肌腱及皮肤中，占人体或其他动物体总蛋白含量的25%-33%。同一组织中常含有几种类型的胶原，常以某种为主。I型胶原遍布于肌体的各部分，主要为皮肤、肌腱及韧带中，具有很强的抗张能力。II型胶原主要存在于透明软骨、玻璃体中，具有较强的抗压能力。III型胶原广泛分布于伸展性大的组织中，如疏松结缔组织等，具有伸展性及应变性。其中，I型胶原占生物体总胶原量的90%，因此，I型胶原在生物材料中的使用也最广泛。胶原在分子水平结构相同，由3条a链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型。3条左手螺旋链又相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺旋结构为胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定。3条链富含甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸，缺乏半胱氨酸和色氨酸，酪氨酸含量也很低，但含独特的羟化氨基酸(羟脯氨酸和羟赖氨酸)。由于原纤维的方向性和成束直径及密度的不同，不同组织的胶原存在结构差异，并具有各自的功能和结构特征。在结缔组织中，胶原除了机械支撑外，还是细胞粘附和移动的重要物质基础，因此，胶原被认为是胚胎发育和组织再生中重要的形态发生因素，在组织工程中得到广泛应用。能被称为胶原的，必须是其三螺旋结构没有改变的那类蛋白质，还保留有完全生物活性。而胶原蛋白是胶原的水解产物，胶原的三螺旋结构彻底松开，成为3条自由的肽链，且降解成多分散的肽段，其中包括小肽。因此胶原蛋白是多肽混合物，相对分子量从几千到几万，分子量分布很宽，没有生物活性，能溶于冷水，而且能被蛋白酶利用。CNl 110284中公开了一种胶原的制备方法，以酸提取，盐沉淀，膜过滤，最后冻干， 其提取效率和纯度都较低。CN101250218公开了一种以鳕鱼皮为原料制备胶原蛋白的方法， 其制备方法会破坏胶原的三螺旋结构。现有技术公开的方法在胶原的提取制备过程中往往破坏胶原的三螺旋结构，或者提取效率较低，无法实现既能够保留活性胶原的三螺旋结构， 又同时提高提取效率和纯度。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的是提供一种具有三螺旋结构的活性胶原的制备方法。本发明使用酸酶结合处理加渐进式超声波处理的制备方法，不仅能够保持胶原的三螺旋结构，同时显著的提高了胶原的提取效率。本发明使用H2A溶液处理加酸溶盐析纯化加透析纯化有效的提高了胶原产品的纯度。—种具有三螺旋结构的活性胶原的制备方法，包括如下步骤原料预处理、除脂、酸酶结合处理、超声波处理、H2A溶液处理、酸溶盐析纯化、透析纯化、干燥。所述的原料为选自新鲜猪皮、牛皮、牛跟腱中的一种。所述的酸酶结合处理为经过预处理的原料浸入0. 6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌25 30小时左右。所述的超声波处理优选采用渐进式超声波处理，先使用100 200W超声处理30 分钟，再使用200 300W超声处理30分钟，最后使用300 400W超声处理1小时。所述的一种具有三螺旋结构的活性胶原的制备方法，具体步骤如下(1)取新鲜猪皮，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将猪皮破碎成小颗粒状，按照固液比1 30 1 40的比例，加入0.01 0.03mol/L的氢氧化钠水溶液，于 6 8°C浸泡1 2小时，过滤，备用；( 在上述预处理后的猪皮中加入质量为猪皮质量6 8倍的无水乙醚或者丙酮， 于35 40°C回流5-8小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用；(3)将上述猪皮浸入0. 6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌25 30小时左右；(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用100 200W超声处理30分钟， 再使用200 300W超声处理30分钟，最后使用300 400W超声处理1小时；(5)加入2 3%的H202溶液，混合静置2 4小时，调节pH至5. 0，离心；(6)取上清液，加入NaCl，搅拌20-30小时，离心，沉淀物加入0. 6-0. 7moL/L冰醋酸溶解，离心，取上清液，调节PH至7. 5，加入NaCl，搅拌20-30小时，离心；(7)将步骤(6)得到的沉淀物溶解于0. 6 0. 7moL/L冰醋酸，先以0. 6 0. 7moL/ L的冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析5 7次，每次4 小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液体；(8)将上述液体冷冻干燥，得到具有三螺旋结构活性的胶原。所述的具有三螺旋结构活性胶原的大小一般为20000 30000道尔顿。酸酶结合处理本发明所述的酸酶结合处理是指经过预处理的原料浸入0. 6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌25 30小时左右。该方法结合了酸法和酶法提取制备胶原的特点，防止了对活性胶原三螺旋结构的破坏，有效的提高了提取效率。超声波处理本发明所述的酸酶结合处理是指采用渐进式超声波处理，先使用 100 200W超声处理30分钟，再使用200 300W超声处理30分钟，最后使用300 400W 超声处理1小时。本发明采用超声波处理结合酸酶法提取制备胶原蛋白，经过实验研究发现，采用超声波处理能够有效的提高提取效率。采用渐进式超声波处理与采用固定功率超声处理相比，能够更好的防止胶原的三螺旋结构的破坏，并且有效的降低超声波处理阶段的生产能耗。本发明的有益效果本发明使用酸酶结合处理加渐进式超声波处理的制备方法， 最大程度上减少了对胶原结构的破坏，保持活性胶原的三螺旋结构，同时显著的提高了胶原的提取效率，降低了生产成本。同时，渐进式超声波处理也在超声波处理环节一定程度上降低了能耗。本发明使用H2O2溶液处理加酸溶盐析纯化加透析纯化有效的提高了胶原产品的纯度。本发明的方法直接制得的胶原产品具有低免疫原性和高生物相容性，已经通过工业化生产，并广泛应用于医疗产品，如皮肤代用品、骨骼代用品、胶原蛋白敷料、生物工程膜等。
具体实施例方式下面结合实施例，进一步阐述本发明实施例1(1)取新鲜牛皮，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将牛皮破碎成小颗粒状，按照固液比1 30的比例，加入0.03mol/L的氢氧化钠水溶液，于6 8°C浸泡2小时， 过滤，备用；(2)在上述预处理后的牛皮中加入质量为牛皮质量8倍的无水乙醚或者丙酮，于 35°C回流8小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用；(3)将上述牛皮浸入0. 6mol/L冰醋酸和700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌 25小时左右；(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用100W超声处理30分钟，再使用 300W超声处理30分钟，最后使用400W超声处理1小时；(5)加入2%的H2A溶液，混合静置4小时，调节pH至5. 0，离心；(6)取上清液，加入NaCl，搅拌20小时，离心，沉淀物加入0. 7moL/L冰醋酸溶解， 离心，取上清液，调节pH至7. 5，加入NaCl，搅拌20小时，离心；(7)将步骤(6)得到的沉淀物溶解于0. 7moL/L冰醋酸，先以0. 7moL/L的冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析5次，每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液体；(8)将上述液体冷冻干燥，得到具有三螺旋结构活性的胶原。实施例2(1)取新鲜牛跟腱，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将牛跟腱破碎成小颗粒状，按照固液比1 40的比例，加入0. 01mol/L的氢氧化钠水溶液，于6 8°C浸泡1 小时，过滤，备用；(2)在上述预处理后的牛跟腱中加入质量为牛跟腱质量6倍的无水乙醚或者丙酮，于40°C回流5小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用；(3)将上述牛跟腱浸入0. 7mol/L冰醋酸和600mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌30小时左右；(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用100W超声处理30分钟，再使用 200W超声处理30分钟，最后使用300W超声处理1小时；(5)加入3%的H2A溶液，混合静置2小时，调节pH至5. 0，离心；(6)取上清液，加入NaCl，搅拌30小时，离心，沉淀物加入0. 6moL/L冰醋酸溶解， 离心，取上清液，调节pH至7. 5，加入NaCl，搅拌30小时，离心；(7)将步骤(6)得到的沉淀物溶解于0. 6moL/L冰醋酸，先以0. 6moL/L的冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析7次，每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液体；(8)将上述液体冷冻干燥，得到具有三螺旋结构活性的胶原。
实施例3(1)取新鲜猪皮，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将猪皮破碎成小颗粒状，按照固液比1 35的比例，加入0. 02mol/L的氢氧化钠水溶液，于6 8°C浸泡1. 5小时，过滤，备用；(2)在上述预处理后的猪皮中加入质量为猪皮质量7倍的无水乙醚或者丙酮，于 37°C回流6小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用；C3)将上述猪皮浸入0.65mol/L冰醋酸和650mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌 28小时左右；(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用150W超声处理30分钟，再使用 250W超声处理30分钟，最后使用350W超声处理1小时；(5)加入2. 5%的H2A溶液，混合静置3小时，调节pH至5. 0，离心；(6)取上清液，加入NaCl，搅拌25小时，离心，沉淀物加入0. 65moL/L冰醋酸溶解， 离心，取上清液，调节PH至7. 5，加入NaCl，搅拌25小时，离心；(7)将步骤(6)得到的沉淀物溶解于0. 65moL/L冰醋酸，先以0. 65moL/L的冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析6次，每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液体；(8)将上述液体冷冻干燥，得到具有三螺旋结构活性的胶原。
权利要求
1.一种具有三螺旋结构的活性胶原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤原料预处理、除脂、酸酶结合处理、超声波处理、H2A溶液处理、酸溶盐析纯化、透析纯化、干燥。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的原料为选自新鲜猪皮、牛皮、 牛跟腱中的一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酸酶结合处理为经过预处理的原料浸入0. 6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌25 30小时左右。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的超声波处理优选采用渐进式超声波处理，先使用100 200W超声处理30分钟，再使用200 300W超声处理30分钟， 最后使用300 400W超声处理1小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下(1)取新鲜猪皮，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将猪皮破碎成小颗粒状， 按照固液比1 30 1 40的比例，加入0. 01 0. 03mol/L的氢氧化钠水溶液，于6 8°C浸泡1 2小时，过滤，备用。(2)在上述预处理后的猪皮中加入质量为猪皮质量6 8倍的无水乙醚或者丙酮，于 35 40°C回流5-8小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用。(3)将上述猪皮浸入0.6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中， 持续搅拌25 30小时左右。(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用100 200W超声处理30分钟，再使用200 300W超声处理30分钟，最后使用300 400W超声处理1小时。(5)加入2 3%的H2A溶液，混合静置2 4小时，调节pH至5.0，离心。(6)取上清液，加入NaCl，搅拌20-30小时，离心，沉淀物加入0.6-0. 7moL/L冰醋酸溶解，离心，取上清液，调节PH至7. 5，加入NaCl，搅拌20-30小时，离心。(7)将步骤(6)得到的沉淀物溶解于0.6 0. 7moL/L冰醋酸，先以0. 6 0. 7moL/L的冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析5 7次，每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液体。(8)将上述液体冷冻干燥，得到具有三螺旋结构活性的胶原。
全文摘要
本发明涉及一种胶原的制备方法，以新鲜猪皮为原料，经预处理，去除脂肪，经酸酶法处理后，使用超声波处理，进一步提高提取效率，最后纯化制得高纯度的胶原产品。本发明胶原的制备方法提取效率高，产品纯度达到98％以上。该产品为保持三螺旋结构的活性胶原，具有低免疫原性、高生物相容性，可生物降解，适用于医疗用途。
文档编号C07K14/78GK102391374SQ20111036103
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者任伟业 申请人:无锡贝迪生物工程有限公司