专利名称：一种生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法
技术领域：
本发明涉及蛋白组学研究領域中的生物被膜状态下细菌总蛋白的提取方法。
背景技术：
随着众多物种基因组测序的完成，人们的注意力开始转向如何从结构、功能以及生物系统的控制角度来阐述基因组序列中的信息。蛋白质组学和生物信息学的出现为研究复杂生物系统开辟了崭新的途径。在蛋白质组学研究中使用最为广泛同时也是平行实验中较为可靠的技术是双向电泳技术，然后对分离的蛋白进行生物质谱鉴定(Gorg A，WeissW，Dunn Mj.しurrent two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.Proteomics,2004,4 :3665-3685.)。由于各种用于双向电泳的蛋白提取方法，往往因为细菌 的种类和处于的生长状态不同而差别很大，因此高质量的细菌蛋白的提取，成为双向电泳以及后续质谱鉴定工作中最具挑战性的工作之一。细菌生物被膜(biofilm，BF)是指细菌自身产生的外部多糖基质、纤维蛋白质、脂蛋白等包裹着的菌细胞的結果；単一或多种类群细菌为了适应周围环境，吸附于异物或组织表面，繁殖并分泌大量多糖基质、纤维蛋白、月旨蛋白等多糖蛋白复合物，使得细菌相互粘连、聚集、缠绕，形成具有三维立体结构的膜样物，是细菌微菌落聚集体(Hall-Stoodley L,Costerton Jff,Stoodley P. Bacterial biofilms from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol,2004,2 :95-108.)。因此处于生物被膜状态下的菌体通常被大量的多糖蛋白包裹，会影响双向电泳的分离蛋白的效果，进而干扰后期的质谱鉴定工作(Marzban G, Herndl A, MaghulyF, Katinger H, Laimer M. Mapping of fruit allergens by 2Delectrophoresis andimmunodetection. Expert Rev Proteomics,2008, 5 :61-75.)。目前，已有多种提取的方法被应用于细菌浮游态下蛋白组学的研究中(JingHB,Yuan J, Wang J, Yuan Y, Zhu L, Liu XK, Zheng YL, Wei KH, Zhang XM, Geng HR, Duan Q,Feng SZ,Yang RF,Cao WC,Wang HL,Jiang YQ. Proteome analysis of Streptococcus suisserotype 2. Proteomics, 2008,8 :333-349.),并且也获得了理想的双向电泳结果，处于生物被膜状态下的细菌蛋白组学研究目前还较少，特别对于猪链球菌这类革兰氏阳性细菌，主要的困难不仅在于分离细菌与包裹在外的多糖蛋白，而且革兰氏阳性菌细胞壁有大量的肽聚糖层，细胞壁较厚，使得高质量蛋白提取异常困难。目前，分离细菌和包裹在外的多糖蛋白的采用方法为涡旋震荡使其机械分离，该方法存在机械震荡不能完全使得细菌于包裹的胞外基质分离，造成提取蛋白中有多糖等成分的残留，影响实验結果。提取细菌全菌蛋白应用最广泛的是直接超声波破碎后，用三氯こ酸-丙酮沉淀(TCA)细菌蛋白，该方法在防止蛋白降解和去除部分干扰性杂质方面具有很好的效果，但是对于革兰氏阳性等细胞壁较厚的细菌来说存在细胞壁破碎不完全，常常造成部分蛋白的丢失。还有ー种是利用玻璃珠破碎法，该方法利用机械破碎细菌细胞壁来获得全菌蛋白，同样造成破壁不完全，导致部分蛋白丢失，2D图上蛋白有大量拖尾的现象(Svensater G, Welin J, Wilkins JC, Beighton D,Hamilton 丄R. Protein expression by pianktonic and bioiilm cells of Streptococcusmutans. FEMS Microbiol Lett，2001，205 :139-146.)。还有ー种提取方法-酚抽提
法，该方法的基本原理是通过将蛋白质溶解在Tris饱和酚中，然后通过反复抽提除去各种杂质，最后利用醋酸铵饱和的甲醇溶液将酹相中的蛋白质沉淀下来(Carpentier SC,Witters E, Laukens K, Deckers P, Swennen R ana Panis B.Preparation of proteinsextracts from recalcitrant plant tissues An evaluation of different methods fortwo-dimensional gel electroPHoresis analysis. Proteomics,2005, 5 :2497-2507)。在酚抽提法中，利用蛋白质溶于Tris饱和酚的特性，通过加入提取液反复抽提，可以有效地去除不溶于有机溶剂的杂质，并且在抽提过程中，大多数盐离子被留在提取液中，从而起到一定程度的除盐作用(Li XF, Han HP, Wang XC, Fan PX and Li YX. Extraction methodsior two-dimensional electrophoresis analysis of shoot proteins in halophyteSalicornia europaea. Acta Ecologica Sinica, 2006, 26 :1848-1853.),但是在细胞中，多酚类物质会以氢键与蛋白质不可逆结合，导致双向电泳胶图像中出现成片状弥散现象，一 些难溶性碳化合物还会堵塞IPG胶条的胶孔，从而延长聚焦时间，最終导致拖尾和部分蛋白质丢失。另外，处于生物被膜状态的细菌细胞中广泛存在大量的多糖、脂类等物质，同样会造成胶上的弥散现象，因此在制备用于2-DE的蛋白质样品的时候，一定要先最大量的去除包裹细菌形成生物被膜的多糖等杂质，并尽可能的溶解细菌细胞壁，减少总蛋白的丢失。因此，为了更好的研究处于生物被膜状态下猪链球菌蛋白表达差异，深入了解猪链球菌形成生物被膜的原因和致病分子机理，需要一种简单、实用、高效的细菌生物被膜状态下总蛋白的提取方法。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供ー种具有较高提取效率的生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种处于生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法，包括以下步骤(I)对处于生物被膜状态下猪链球菌的处理，将培养皿中上清移除，并用30-70mMTris/HCl PH 7. 5清洗2_3遍后，用细胞刮刀刮下黏附于培养皿的处于生物被膜状态下的细菌菌体；细胞悬液被超声震荡5-10min后，再用30_70mM Tris/HC1(PH 7. 5)清洗2-3遍，每遍以涡旋振荡器涡旋震荡，离心5-15min收集菌体；(2)清洗的菌体细胞以30-50mM Tris-HCl，3_7mM MgCl2和30% -50%的蔗糖缓冲液重悬，每毫升缓冲液中添加500-1000U/ml变溶菌素(Mutanolysin)，以37°C孵育60-90分钟；(3)离心IOmin收集处于原生质体的细胞，以超声缓冲液(5-10M urea, 1-3Mthiourea，3-5% CHAPS和50-75mM DTT)重悬细胞，加入蛋白酶抑制剂，冰浴中超声破碎(最大功率的70-120W，脉冲5s，停IOs)，共60-100个循环；(4)随后在15-32°c孵育10-60!1^11，25で，10，000\8离心301^11，以除去细胞碎片
和没有裂解的细菌；(5)蛋白上清液加入5-15% TCA后冰浴15_60min。用预冷的丙酮洗蛋白2_3次后，离心5-10min收集总蛋白，室温条件下干燥收集到的总蛋白，获得细菌总蛋白。
在上述提取方法中，步骤(I)中处理菌体的总量以不超过5X IO9为最优。Tris/HCl的浓度以50mM为最优，清洗，3遍最优；超声震荡的时间以7分钟最优。步骤⑵中清洗细胞的缓冲液最优化为50mM Tris-HCl, 5mM MgCl2和50%的蔗糖缓冲液，变溶菌素添加量以750U/ml为最优，以Sigma公司的产品最优，孵育时间以90分钟最优。步骤(3)中超声缓冲液的最优化配方为7M urea, 2M thiourea，4 % CHAPS和65mMDTT，超声破碎的最大功率以100W为最优，循环数以90个循环为最优。步骤(4)中孵育的温度以25°C最优，孵育的时间以30分钟为最优。步骤(5)中TCA的浓度以10%为最优，冰浴时间以30分钟最优，预冷的丙酮清洗最优为2次,离心时间以10分钟最优。
步骤(I)到步骤(5)中离心条件以4°C, IOOOOg为最优。本发明的猪链球菌生物被膜状态下细菌总蛋白的提取取方法利用细胞刮刀刮取，超声波和机械震荡的相结合，利用Tris/HCl清洗，有效的解决了包裹于外表面的多糖和细菌的分离。利用变溶菌素对于革兰氏阳性细菌细胞壁的去除作用，有效的溶解了猪链球菌的细胞壁，并利用低温超声破碎，可以最大量的破碎细胞，获得全菌蛋白，减少蛋白的丢失。TCA和丙酮的处理可以有效的沉淀全菌蛋白，有效去除杂质，最終获得高质量的蛋白质。通过双向电泳检测提取效果，结果该方法提取的蛋白聚焦效果好，能够获得更多的蛋白点。本发明的方法为处于生物被膜状态下细菌总蛋白的提取提供了很有价值的參考；可广泛应用于各种处于生物被膜状态下细菌总蛋白的提取，特别是对于细菌生物被膜状态下细菌蛋白组学研究中，应用前景广阔。
图I为用本发明方法提取猪链球菌生物被膜状态下细菌总蛋白的双向电泳检测结果。
具体实施例方式实施例I :本实施例的提取猪链球菌生物被膜状态下细菌总蛋白的方法如下所用到的试剂IPG 干胶条(Ready StripTM IPG Strip, 13cm, PH4-7)和 PH4-7 的 IPG Buffer,矿物油、溴酹蓝、蛋白定量试剂盒(QuickStart Bradford Protein Assay kit)、urea(尿素)、thiourea(硫脲)、CHAPS、碘こ酰胺(IAA)为GE公司产品；ニ硫苏糖醇(DTT)、测序级胰蛋白酶、变溶菌素、β -巯基こ醇等为Sigma公司产品；蛋白酶抑制剂为Roche公司产品；Tris, EDTA,过硫酸铵，ΤΜΕΜ,三氯こ酸,丙酮,鹿糖,氯化钠，甲醇，こ醇,甘油,硫酸铵和こ酸均为化学分析纯，购自鼎国公司(南京)；下述实施例中所用的其它试剂均购自GE公司。双向电泳中所用到得水为超纯水。双向凝胶电泳第一向等电聚焦仪、第二向垂直板电泳仪为GE 公司产品；扫描仪为 Power look 2100XL(U MAX)；具体步骤如下(I)猪链球菌生物被膜的培养将处于对数生长期的猪链球菌母种子液以I : 100转接于含有IOml THB (每升培养基中3g酵母浸出物，20g胰蛋白胨，5g牛肉膏，2gNaCl，2. 5gNa2C03，l. 18g Na2HPO4. 12H20，PH 7.8)液体培养基的100mm的聚苯乙烯细胞培养皿中，37°C静置培养24h ;将培养皿中上清移除，并用50mM Tris/HC1(PH 7. 5)清洗3遍，每次IOml ;用细胞刮刀刮下附于培养皿底部的处于生物被膜状态的细菌菌体，以IOml 50mMTris/HCl(PH7. 5)重悬大约IO9细胞，悬液被超声震荡7min后，再用50mM Tris/HCl (PH7. 5)清洗3遍，每遍IOml以涡旋振荡器涡旋震荡；4°C，lOOOOg，离心IOmin收集菌体；(2)清洗的菌体细胞以2ml 50mM Tris-HCl，5mM MgCljP 50%的蔗糖缓冲液重悬，每毫升缓冲液中添加750U/ml变溶菌素，在37°C的温度下孵育90分钟；(3) 4 V，IOOOOg,离心IOmin收集处于原生质体的细胞，以5ml超声缓冲液(7Murea，2M thiourea，4% CHAPS和65mM DTT)重悬细胞，加入蛋白酶抑制剂，冰浴中超声破碎(最大功率的100W，脉冲5s，停10s)，共90个循环；(4)随后在25°C的温度下孵育30min，25°C，10，OOOXg离心30min，以除去细胞碎
片和没有裂解的细菌；(5)蛋白上清液加入10% TCA，每管2ml分为3管后冰浴30min，用预冷的丙酮洗蛋白2次后，每次2ml，离心IOmin收集总蛋白，共获得3管，室温干燥蛋白，获得细菌总蛋白；(6)干燥的蛋白以 0. 5ml 溶解缓冲液(7M urea, 2M thiourea, 4 % CHAPS 和65mMDTT) 25°C溶解30min，每隔IOmin震荡一次，以4°C，10, 000 X g离心20min收集总蛋白。以蛋白定量试剂盒检测大约为400微克细菌总蛋白。实施例2将实施例I提取到的细菌总蛋白进行测试，步骤及结果如下(I)实施例I提到到的细菌总蛋白样品以Quick Start Bradford ProteinAssay kit定量，用等电聚焦缓冲液悬浮尿素(8M尿素，2% CHAPS，50mM 二硫苏糖醇，0. 2%Bio-Lyte4-7两性电解质，0. 001%溴酚兰公司)溶解分装成200 μ g小份，直接上样；采用13cm, PH 4-7的IPG干胶条，放于其中泡胀，蛋白溶解于等电聚焦缓冲液中，上面履盖矿物油；第一相固相等电聚焦程序按照GE操作手册进行，即20°C主动水化12h后，500v线性4h，IOOOv 快速 lh, 2000v 线性 lh, 4000v 线性 lh, 8000v 线性 2. 5h, 8000v 快速 0. 5h ；(2)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)先将胶条进行两次平衡，第一次平衡将胶条浸于3mL平衡缓冲液I (75mMTris-HCl、6M尿素、2% SDS、29. 3%甘油、1%二硫苏糖醇)中15min ;第二次平衡将胶条浸于3mL平衡缓冲液2(75mM Tris_HCl、6M尿素、2 % SDS、29. 3 %甘油、2. 5 %碘乙酰胺)中15min，两步平衡后，采用12. 5%的SDS-PAGE 二向垂直板电泳，并用1%琼脂糖封口 ；先按15mA/gel电泳30min,之后按30mA/gel电泳到溴酹蓝指示剂到胶底部；电泳结束后，用考马斯亮蓝G250染色；脱色后用扫描仪扫描采集图像，运用roQuestTM2D 7. 4. O软件进行分析。利用本法提取到处于生物被膜状态的细菌总蛋白在2-DE胶上，背景非常干净，几乎见不到拖尾和弥散现象，可以检测到得蛋白点也较多，蛋白点形状为圆形或椭圆形，说明聚焦充分，可用于蛋白组学相关应用。
权利要求
1.ー种生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法，其特征在于包括以下步骤 (1)对处于生物被膜状态下猪链球菌的处理，将上清移除，并用30-70mMTris/HClPH7. 5清洗2-3遍后，刮下黏附于培养皿的处于生物被膜状态下的细菌菌体；细胞悬液被超声震荡5-10min后，再用30-70mM Tris/HCl PH 7· 5清洗2-3遍，并离心5_15min收集菌体； (2)步骤(I)得到的清洗的菌体细胞以缓冲液重悬，每毫升缓冲液中添加500-1000U/ml变溶菌素，在36. 5-37. 5°C的温度下孵育60-90分钟； (3)离心8-15min收集处于原生质体的细胞，以超声缓冲液重悬细胞，加入蛋白酶抑制齐U，冰浴中超声破碎共60-100个循环； (4)随后在15-32°C的温度下孵育10-6011^11，25で，10，000\8离心301^11，除去细胞碎片和没有裂解的细菌； (5)蛋白上清液加入5-15%TCA后冰浴15-60min。用预冷的丙酮洗蛋白2_3次后，离心5-10min收集总蛋白，室温条件下干燥收集到的总蛋白，获得细菌总蛋白。
2.根据权利要求I所述的生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法，其特征在于步骤(I)中处理菌体的总量以不超过5X109。
3.根据权利要求I所述的生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法，其特征在于步骤(I)中Tris/HCl的浓度优选50mM，清洗3遍；超声震荡的时间以7分钟。
4.根据权利要求I所述的生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法，其特征在于步骤(2)中清洗细胞的蔗糖缓冲液的组成为30-50mM Tris-HCl，3_7mM MgCl2和30% -50%蔗糖。
5.根据权利要求4所述的生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法，其特征在于步骤(2)中清洗细胞的蔗糖缓冲液的组成为50mM Tris-HCl, 5mM MgCl2和50%的蔗糖缓冲液，变溶菌素添加量优选750U/ml。
6.根据权利要求I所述的生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法，其特征在于步骤(3)中超声缓冲液的组成为 5-10M urea，l-3M thiourea，3-5% CHAPS 和 50_75mMDTT。
7.根据权利要求I所述的生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法，其特征在于步骤⑶中超声缓冲液的优选组成为7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS和65mM DTT。
8.根据权利要求I所述的生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法，其特征在于步骤(3)超声破碎的最大功率的100W，脉冲5s，停10s。
9.根据权利要求I所述的生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法，其特征在于步骤(4)中孵育的温度优选25°C，孵育的时间优选30分钟。
10.根据权利要求I所述的生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法，其特征在于步骤(5)中TCA的浓度优选10%，冰浴时间优选30分钟，预冷的丙酮清洗为2次，离心时间为10分钟。
11.根据权利要求I所述的生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法，其特征在于步骤(I)到步骤(5)中离心条件优选为4°C，10000g。
全文摘要
本发明涉及一种生物被膜状态下猪链球菌总蛋白的提取方法，包括以下步骤(1)对处于生物被膜状态下猪链球菌的处理；(2)步骤(1)得到的清洗的菌体细胞以蔗糖缓冲液重悬，每毫升缓冲液中添加变溶菌素，在36.5—37.5℃的温度下孵育；(3)离心8—15min收集处于原生质体的细胞，以超声缓冲液重悬细胞，加入蛋白酶抑制剂,冰浴中超声破碎共60-100个循环；(4)随后在15-32℃的温度下孵育10-60min；(5)蛋白上清液加入5-15%TCA后冰浴；用预冷的丙酮洗蛋白，离心收集总蛋白，室温条件下干燥收集到的总蛋白，即获得所述细菌总蛋白。本发明的方法可广泛应用于各种处于生物被膜状态下细菌总蛋白的提取，特别是对于细菌生物被膜状态下细菌蛋白组学研究中，应用前景广阔。
文档编号C07K1/14GK102690319SQ20111040660
公开日2012年9月26日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者刘一尘, 张炜, 易力, 李小康, 汪洋, 王臣, 程相朝 申请人:河南科技大学