专利名称：Plac1抗肿瘤ctl表位肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学领域中的多肽技术领域，具体涉及一种PLACl来源的抗肿瘤CTL 表位肽及其在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。
背景技术：
PLACl (Placenta-specific 1)属于肿瘤-睾丸抗原(Cancer-Testis Antigen, CTA)家族，在成人的正常组织中仅在睾丸和胎盘有明显表达，在乳腺癌、结肠癌、肝癌及肺癌等多种肿瘤组织中表达。PLACl在原发性乳腺癌组织中的表达率高达82%，而在正常乳腺组织不表达PLACl与肿瘤尤其是乳腺癌密切相关，是一个非常理想的乳腺癌免疫治疗靶抗原。随着现代免疫学的发展，细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)在肿瘤中发挥的重要作用越来越受到重视。如何有效地激发CTL介导的特异性细胞免疫应答，发挥抗肿瘤效能，已经成为当今肿瘤治疗性多肽疫苗研制领域的一个重要课题。既往研究发现，引起CTL免疫应答反应的，并非完整的肿瘤抗原分子，而是抗原来源的特异性CTL 表位(Epitope)。抗原递呈细胞摄取肿瘤抗原后，通过蛋白水解作用将其加工成为8-10个氨基酸长度的多肽片段，即CTL表位，进而与内质网腔中的主要组织相容性复合体I(MHCI) 类分子结合形成多肽-MHC复合物(ρ印tide-MHC complex, pMHC)，并最终将pMHC递呈到细胞表面供CD8+T细胞表面的T细胞受体(T cell rec印tor，TCR)识别，从而活化CTL细胞， 引发CTL免疫应答。但是，免疫原性弱和免疫耐受的存在是CTL表位作为肿瘤治疗性多肽疫苗应用的两大障碍。因此，如何提高CTL表位的免疫原性以及打破机体对CTL表位的免疫耐受成为肿瘤治疗性多肽疫苗发展的关键。目前，在众多肿瘤治疗性多肽疫苗的增强策略中，对CTL表位进行分子改造被认为是最有前景的方法之一。CTL表位的改造，可以通过改造表位MHC结合位点，从而改善表位与MHC的亲和力和pMHC的稳定性，以达到增强免疫原性的目的；也可以通过改造表位 TCR结合位点，从而改善pMHC与TCR结合的稳定性，以达到提高CTL活性并克服CTL耐受的目的。近期研究表明，基于表位MHC结合位点改造的多肽疫苗虽然可以一定程度上提高疫苗的免疫原性，但在肿瘤免疫治疗中达不到理想的抑瘤效果；而基于表位TCR结合位点改造的多肽疫苗，有望通过增强对低亲和力T细胞的刺激能力或者招募一群新的具有交叉反应性的T细胞打破肿瘤免疫耐受而达到理想的抑瘤效果。HLA-A2. 1分子主要与九肽结合，其二位和九位为MHC主要锚定位点。Jorg Ruppert (Prominent role of secondary anchor residues in peptide binding to HLA-A2. 1 molecules. Cell. 1993，74(5):拟9_37.)在研究主要锚定位点的优势氨基酸中发现二位为L或M，九位为L、V或I，能将表位与MHC结合的能力提高10 100倍；而对与次要锚定位点的改造，最常用且最有效的一种方法就是将一位的氨基酸使用酪氨酸(Tyr)替换。Tourdot(A general strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2. 1-associated peptides: implication in the identification of cryptic tumor epitopes. Eur J Immunol. 2000，30(12) : 3411-21.)指出一位Tyr 的引入主要依靠其侧链苯环的疏水作用以及酚羟基的氢键作用增强表位肽与HLA分子的相互作用。本申请主要是采用理论和实验相结合的方法，修饰并初步鉴定出与MHC分子结合能力高的PLACl来源的候选CTL表位肽及其类似物。我们通过对CT datekise的筛选，发现了一种新认定的在乳腺癌中高表达的癌睾抗原CT96 (即PLAC1)，它在乳腺癌中的阳性表达率超过了 80%，是CT抗原中非常理想的一个乳腺癌免疫治疗靶抗原，而目前关于它们的表位鉴定还没有文章报道。根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，运用SYFPEITHI、 BIMAS和Net CTL 1. 2数据库对抗原PLACl的HLA-A2. 1限制性CTL表位进行了预测分析。
发明内容
本发明目的在于用人工合成的方法提供一种具有抗肿瘤作用的PLACl抗肿瘤CTL 表位肽。本发明另一目的在于提供该PLACl抗肿瘤CTL表位肽在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
PLACl抗肿瘤CTL表位肽，为九肽，其序列为a-Leu-Cys-Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-b或 c-d-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val ；其中，a 为 Val 或 Tyr，b 为 Met 或 Val ；c 为 Ser 或 Tyr, d 为 Ile 或 Leu0当 a 为 Val，b 为 Met 时，序列为 Val-Leu-Cys4er-Ile-Asp-Trp-Phe-Met (即 VLCSIDWFM，记为 M8)，分子量为 1113.4。当a 为 Tyr，b 为 Val 时，序列为 Tyr-Leu-Cys-Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-Val (即 YLCSIDWFV，记为 P^_1Y9V)，分子量为 1145. 4。当 c 为 Ser, d 为 Ile 时，序列为 Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val (即 SIDWFMVTV，记为 P31)，分子量为 1097. 3。当 c 为 Tyr，d 为 Leu 时，序列为 Tyr-Leu-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val (艮口 YLDWFMVTV，记为 P31-1Y2L)，分子量为 1173. 2。所述PLACl抗肿瘤CTL表位肽的制备方法，可以采用固相合成法合成CTL表位肽。基本流程如下首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体 Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接到固相载体上了 ；其次将氨基被Fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度， 最后切割得到目的肽。经HPLC纯化后，其纯度大于90%，质谱分析并证实其分子量符合理论值。(参见①黄惟德、陈常庆著，多肽合成，科学出版社，1985年。②.N.休厄德、H.D.贾库布克著，刘克良等译，肽化学与生物学，科学出版社，2005年。)
所述PLACl抗肿瘤CTL表位肽在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。本发明优点利用在乳腺癌中高表达而在人体正常组织中不表达的抗原PLAC1，筛选出具有抗肿瘤活性的表位肽，鉴定的九肽均未见文献报道，为研制基于抗原PLACl的肿瘤治疗性多肽疫苗提供理论基础，并为后续多价的抗原肽疫苗构建奠定基础。
图1是本发明表位肽P^的质谱分析图谱； 图2是本发明表位肽P28-1Y9V的质谱分析图谱； 图3是本发明表位肽P31的质谱分析图谱；
图4是本发明表位肽P31-1Y2L的质谱分析图谱；
图5是本发明表位肽诱导的特异性CTL对肿瘤细胞MCF-7杀伤效应的检测结果； 图6是本发明表位肽在转基因小鼠体内诱导的特异性CTL对肿瘤细胞MCF-7杀伤效应的检测结果。实验仪器名称与型号
电喷雾-离子阱多级质谱仪BRU KER Esquire-3000 德国布鲁克道尔顿仪器公司流式细胞仪Calibur美国BD公司。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。实施例1 抗肿瘤 CTL 表位肽 P28 (Val-Leu-Cys-Ser-IIe-Asp-Trp-Phe-Met)的制备
采用Fmoc固相合成法，从C端一N端逐个延长。用芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护氨基酸的 α-氨基，各种Fmoc保护氨基酸的侧链保护基分别为1Trp (Boc),Asp (OtBu), Ser (tBu)、 Cys (trt) (Boc代表叔丁氧羰基、OtBu代表叔丁脂、tBu代表叔丁基、trt代表三苯甲基)。 先将α -氨基保护的C端第一个氨基酸，即Fmoc-Met-OH用Ν、Ν’ - 二异丙基碳二亚胺(DIC) 作缩合剂，并加入N-羟基苯胼三氮唑(HOBt)，将Fmoc-Met-OH连接到wang树脂上。依次用 DMF、无水甲醇、二氯甲烷、DMF洗涤。用哌啶-DMF混合液(VR g =Vdmf =1:4)除去Fmoc保护基，依次用DMF、无水甲醇、二氯甲烷、DMF洗涤。再与C端第二个氨基酸即Fmoc-Phe-OH用 DIC作缩合剂，并加HOBtJf Fmoc-Phe-OH连接到Met的氨基上，用哌啶-DMF混合液(VR g Vdmf =1:4)脱去Fmoc保护基，依次用DMF、无水甲醇、二氯甲烷、DMF洗涤。得Phe-Met-Wang 树脂。再与Fmoc-Trp (Boc)-OH连接，重复上述步骤，依次连接上Asp、lie , Ser, Cys、 Leu、Val，使肽链按序列从C端一N端逐步延长，用哌啶-DMF混合液(V ,_ =Vdmf =1:4)脱去 Fmoc保护基，用切割试剂(V
三氟i酸V苯甲硫醚V水V苯酚^1，2-己二硫醇=82. 5 5 5 5 2. P28 从Wang树脂上切下，并脱去Boc、OtBu、tBu、trt保护基，得到抗肿瘤CTL表位肽P^粗品。HPLC 分离纯化用 Cw 制备性 HPLC 柱(Partisil 10 0DS-39. 4X 250mm, Whatman 公司)分离纯化。取上述M8粗品30mg溶于3ml含三氟乙酸(TFA)、乙腈(CAN)的水溶液a (TFA体积含量为0. 1%，CAN体积含量为30%)中，用a进行等梯度洗脱，流速5ml/min，收集主峰，冷冻干燥得精肽。将产物进行质谱分析见图1，结果证实分子量为1113. 4，与理论值相符合。实施例2 抗肿瘤 CTL 表位肽 P^_1Y9V (Tyr-Leu-Cys-Ser-I Ie-Asp-Trp-Phe-Va 1)的制备采用与实施例1同样的合成方法，不同之处仅在于用Val替代Met，Tyr替代Val。
将产物进行质谱分析见图2，结果证实分子量为1145. 4，与理论值相符合。实施例3 抗肿瘤 CTL 表位肽 P31 (Ser-Ile-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val)的制备
采用Fmoc固相合成法，从C端一N端逐个延长。用芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护氨基酸的 α-氨基，各种Fmoc保护氨基酸的侧链保护基分别为kr (tBu)、Asp (OtBu), Trp (Boc), Thr (tBu) (tBu代表叔丁基、OtBu代表叔丁脂、Boc代表叔丁氧羰基)。先将α -氨基保护的C端第一个氨基酸，即Fmoc-Val-OH用Ν、Ν’ - 二异丙基碳二亚胺(DIC)作缩合剂，并加入 N-羟基苯胼三氮唑(HOBt)，将Fmoc- Val-OH连接到wang树脂上。依次用DMF、无水甲醇、 二氯甲烷、DMF洗涤。用哌啶-DMF混合液(V ,_ =Vdmf =1 4)除去Fmoc保护基，依次用DMF、无水甲醇、二氯甲烷、DMF洗涤。再与C端第二个氨基酸即Fmoc-Thr (tBu)-OH用DIC作缩合齐[J，并加HOBtJf Fmoc-Ilir (tBu)-OH连接到Val的氨基上，用哌啶-DMF混合液(Ve =Vdmf =1:4)脱去Fmoc保护基，依次用DMF、无水甲醇、二氯甲烷、DMF洗涤。得Thr(tBu)-Val_Wang 树脂。再与Fmoc-Val-OH连接，重复上述步骤，依次连接上Met、Phe、Trp、Asp、lie、Ser,使肽链按序列从C端一N端逐步延长，用哌啶-DMF混合液(=Vdmf =1 4)脱去Fmoc保护基， 用切割试剂(V
三氟乙酸V苯甲硫醚V水V苯酚Vi，2-乙二硫醇=82. 5 5 5 5 2. P31 Wang 月旨上切下，并脱去tBu、OtBu, Boc保护基，得到抗肿瘤CTL表位肽P31粗品。HPLC 分离纯化用 Cw 制备性 HPLC 柱(Whatman Partisil 10 0DS-39. 4X 250mm) 分离纯化，取上述P31粗品30mg溶于3ml含三氟乙酸(TFA)、乙腈(CAN)的水溶液a(TFA体积含量为0. 1%，CAN体积含量为30%)中，用a进行等梯度洗脱，流速5ml/min，收集主峰，冷冻干燥得精肽，将产物进行质谱分析见图3，结果证实分子量为1097. 3，与理论值相符合。实施例4 抗肿瘤 CTL 表位肽 P31-1Y2L (Tyr-Leu-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Va 1)的制备采用与实施例3同样的合成方法，不同之处仅在于Leu替代lie，Tyr替代kr。将产物进行质谱分析见图4，结果证实分子量为1173. 2，与理论值相符合。上述制备的CTL表位肽，可用于制备肿瘤治疗性多肽疫苗，其应用实验如下 1、表位肽与HLA-A2. 1分子结合力试验
(1) 800rpm离心收集HLA-A2. 1表达阳性且内源性抗原加工处理能力缺失的T2细胞 (ATCC公司)，PH7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，无血清RPMI 1640培养基(Gibico公司)重悬至细胞密度为1 X106/mL，接种于M孔板中。(2)每孔加入50 Pg表位肽和0. 5yg人02微球蛋白(Sigma公司)，37 °C共孵育 18h ；
(3)用4°C的PBA(将2g牛血清白蛋白，0. 2g叠氮化钠溶解于IOOml PH7. 4的PBS中即得PBA)洗涤3次，加100 μ 1用PH 7. 4的PBS 100倍稀释后的鼠抗人HLA-A2. 1分子的单克隆抗体ΒΒ7. 2 (Sigma公司)，4 ！避光孵育40min ；
(4)用4°C的PBA洗涤3次，加入50μ 1用PH 7. 4的PBS 50倍稀释后的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG (北京博奥森生物技术有限公司)，4 ！避光孵育30min;
(5)PBA洗涤后于流式细胞仪检测。结果用荧光系数FI表示，详见表1。结果显示，4条表位肽均显示出中等结合力，且改造肽P28-1Y9V和P31-1Y2L均高于母体肽M8和P31。、表位肽/HLA-A 2. 1分子复合物稳定性分析(1)800 rpm离心收集T2A2细胞，PH7. 2的PBS洗涤3次，无血清RPMI 1640培养基重悬至细胞密度为1 X IOVmL,接种于M孔板中；
(2)每孔加入50μ g表位肽和Ojyg人β2微球蛋白，37 °C共孵育18小时；
(3)4°C PH7. 2的PBS洗涤4次以除去未结合的肽；
(4)每孔加入10 yg BrefeldinA (BFA, Sigma 公司)孵育 1 h，PBS 洗涤；
(5)37°C、5%C02 分别孵育 Oh、2h、4h、6h ；
(6)孵育结束后，用4°C的PBA洗涤3次，加100μ 1用PH 7. 4的PBS 100倍稀释后的鼠抗人HLA-A2. 1分子的单克隆抗体ΒΒ7. 2 (一抗)，4 °C反应30 min ；
(7)4°C的PBA洗涤3次，加50 μ 1用PH 7. 4的PBS 50倍稀释后的FITC标记的羊抗鼠 IgG, 4 °C 反应 30 min ；
(8)4°C的PBA洗涤后于流式细胞仪检测。结果用表位肽/HLA-A 2. 1分子复合物的半衰期DC5tl表示，详见表1。
表1表位肱与HLA-A2.1结合力及稳定性试验结果
表位龍FIDCsoAP280.752—4P28-1Y9VOi 894—6P311.014 6P31-1Y2L1.064~6
注FI=(表位肽平均荧光强度一背景平均荧光强度)/W景平均荧光强度 FI > 1.5表位肽与HLA-A2.1具有强结合力； 0.5 < FK 1.5中等结合力；FK 0.5弱结合力； DC^3S 50%表位肽/HLA-A2.1分子复合物解离所需的时由表1可知，四条表位肽的半衰期均大于池，其中改造肽P28-1Y9V和P31-1Y2L优于母体肽M8和P31。、人外周血单核细胞(PBMCs)的分离与诱导及LDH检测
抽取健康供者的外周血经密度梯度离心分离，获得PBMCs，添加白细胞介素2 (IL-2， Peprotech公司)和人β 2微球蛋白诱导分化CTL细胞。方法如下
(1)以40mlPBS (PH 7. 2)稀释抗凝处理后的外周血40ml ；
(2)离心管中力口入4mlLymphoprep分离液(Axis—Shield公司)；
(3)加8ml步骤(1)中稀释后的外周血于Lymphoprep分离液液面上；
(4)20°C离心(2000rmpX20min)；
(5)离心后，分为四层，弃去最上层，用玻璃吸管吸取第二层即白膜层(富含PBMCs)；
(6)吸出的白膜层用PBS(PH 7. 2)离心洗涤两次；
(7)用24孔板铺板，细胞的浓度为1X106/ml，每孔Iml ；
(8)第二天每孔加入10PgAi^2微球蛋白和10 μ g表位肽，同时设立PBS组(以PBS 替代表位肽)作为阴性对照组；
(9)第三天每孔加入50uIL-2 ；
每2 3天换液，于七天后进行第二轮荷肽(即每孔补加50u IL-2U0 μ g人β 2微球蛋白和10 μ g表位肽/PBS)，十四天后进行第三轮荷肽。第三轮荷肽后3天，得到效应细胞CTL，然后进行LDH试验检测细胞毒活性。LDH检测使用 CytoiTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(细胞毒性检测试剂盒，Promega公司)进行LDH试验检测细胞毒活性。步骤如下(详见试剂盒说明书)
1)设立检测板(100μ 1/孔)
(1)设立实验组以肿瘤细胞MCF-7 (ATCC公司)作为靶细胞(最优靶细胞数5000)按不同效靶比10:1、20:1、40:1加入上述效应细胞CTL (2)设立效应细胞自发释放组
(3)设立靶细胞自发释放组
(4)设立靶细胞最大释放组
(5)设立体积校正对照组
(6)设立背景对照组
2)细胞裂解及收获上清
(1)37 °C、5%C02 孵育检测板(5h )
(2)靶细胞最大释放组和体积校正对照组中加入裂解液，每100μ 1培养基中加入 10 μ 1裂解液(10 X )，收获上清前45min加入裂解液
(3)250g离心％iin，收获上清
3)LDH检测
(1)转移50μ 1上清至另一孔板
(2)50 μ 1/孔迅速添加稀释的底物混合液，室温避光孵育30min
(3)添加50μ 1终止溶液
(4)将孔中含有的气泡去除，一小时内检测490nm吸收值0D。细胞杀伤率计算公式如下
(%) = [ (0D实验组_0D效应细胞自发释放组—ODm细胞自发释放组)/( OD ^细胞最大释放组—OD^细胞自发释放组)]X 100%
(注所有实验组、效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组的吸收值均应减去背景平均吸收值；靶细胞最大释放组吸收值应减去体积校正对照组的平均吸收值)
结果见图5，由图5可知，四条表位肽诱导的特异性CTL对肿瘤细胞MCF-7均显示出一定的杀伤率。由此，可知PLACl抗肿瘤CTL表位肽能够用于制备肿瘤治疗性多肽疫苗。、转基因小鼠体内试验 4. 1 CTL体内诱导
免疫方案随机选取8 12周龄HLA-A2. Ι/Kb转基因小鼠(第二军医大曹雪涛教授惠赠)，雌雄随机，每组4只小鼠。将IOOyg表位肽、140 μ g Th表位肽(I-Ab乙肝病毒核心抗原来源的Th细胞表位，TPPAYRPPNAPIL)、50y 1弗氏不完全佐剂(IFA，sigma公司)和50 μ 1 ΡΗ7. 2的PBS混合乳化获得的免疫制剂于小鼠尾根部皮下注射，剂量为100 μ 1/只，分别于第1天、第6天、第11天进行注射，共注射3次，第12天取小鼠脾脏细胞。设置PBS组(即不加入表位肽和Th表位肽)和PBS+Th组(即不加入表位肽)做阴性对照。4. 2 效应 CTL 制备
(1)将上述注射三次的小鼠于第12天脱颈致死，酒精浸泡2 ;3min消毒后，于超净台中无菌取出小鼠脾脏；(2)200目钢网研磨，PBS (PH7. 2)冲洗，得脾细胞悬液;
(3)800rpm离心，弃上清；
(4)加入5ml红细胞裂解液(北京鼎国公司)，重悬细胞，4°C孵育5min；
(5)800rpm离心，收集细胞，PBS (PH7. 2)洗涤3次；
(6)细胞重悬于IOml含10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI1640培养基 (Gibico公司)中得细胞悬液，然后将其于6孔板中培养，每孔5ml ；
(7)次日每孔加入250U Recombinant mouse IL-2 (PR0SPEC 公司)，50 μ g 表位肽；
(8)体外培养6天后收获效应细胞CTL，进行LDH检测(方法同上，其中实验组是以肿瘤细胞MCF-7作为靶细胞，按不同效靶比20:1、40:1、80:1加入上述效应细胞CTL )。
结果见图6，由图6可知，四条表位肽诱导的特异性CTL对肿瘤细胞MCF-7均显示出一定的杀伤率。由此，进一步证明PLACl抗肿瘤CTL表位肽能够用于制备肿瘤治疗性多肽疫苗。
权利要求
1.PLACl抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于，所述抗肿瘤CTL表位肽为九肽，其序列为 c-d-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val ；其中，当 c 为 Tyr，d 为 Leu 时,序列为 Tyr-Leu-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val。
2.权利要求1所述PLACl抗肿瘤CTL表位肽的制备方法，其特征在于，采用固相合成法制备CTL表位肽。
3.权利要求1所述PLACl抗肿瘤CTL表位肽在制备乳腺癌治疗性多肽疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种PLAC1来源的抗肿瘤CTL表位肽，为九肽，其序列为c-d-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val；其中，当c为Tyr，d为Leu时，序列为Tyr-Leu-Asp-Trp-Phe-Met-Val-Thr-Val。本发明所述抗肿瘤CTL表位肽在体外和体内所诱导的特异性CTL对肿瘤细胞MCF-7均显示出一定的杀伤率，可用于制备肿瘤治疗性多肽疫苗。
文档编号C07K7/06GK102492023SQ20111042334
公开日2012年6月13日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者刘伟, 吕虹, 吴亚红, 吴宗胤, 李璐, 祁元明, 高艳锋 申请人:郑州大学