专利名称：一条具有靶向卵巢癌特性的多肽的制作方法
技术领域：
本发明属于蛋白多肽技术领域，涉及利用噬菌体展示肽库技术于卵巢癌肿瘤模型体内筛选得到的一条具有靶向卵巢癌特性的多肽，包括多肽的氨基酸序列及相应的核苷酸序列。
背景技术：
卵巢癌是一种常见的妇科肿瘤，发病率继乳腺癌和子宫体癌位居第三，且恶性程度高，致死率仅次于乳腺癌，严重威胁着妇女的生命。统计数据显示，2011年全世界大约有225，500名妇女被诊断出患有卵巢癌，140，200名妇女死于此种疾病。长期以来，切除手术、放疗和化疗的长足进步并未提高卵巢癌病人的存活率，因此急需发展更多的新技术解决这一难题。其中，药物靶向传递理念的引入因可在最大化药物抗癌效用的同时最小化对正常·器官的不良反应，而成为最具价值和希望的肿瘤治疗方法。而多肽因分子量小，组织穿透性好，无免疫原性且对细胞表面受体具有较高亲和力而成为靶向传递研究中的理想配体。然而已知的天然受体-配体对是非常有限的。噬菌体展示肽库技术的发展则为发现和表征新的配体及对应受体提供了有力的工具，不仅有望实现临床应用于肿瘤的靶向治疗，也有助于解释疾病发生机制的理论研究。嗤囷体展不技术通过将特定片段插入嗤囷体DNA中而将相应的多妝表达在P III衣壳蛋白上，从而在噬菌体的DNA和衣壳蛋白之间搭建桥梁，使得各种靶分子的多肽配体可通过体外或体内筛选得以快速鉴定。发展至今，应用此技术已成功筛选得到针对肝癌、前列腺癌、乳腺癌等多种人类肿瘤的靶向多肽，但是对于筛选卵巢癌靶向配体的相关报道则很少。目前仅有Renata Pasqualini和Wadih Arap小组应用此技术针对病人腹水(Oncogene, 2004
(23)=8859-8867)和卵巢癌细胞(Cancer Res, 2006 (I) :34-40)体外筛选得到了可靶向结合卵巢癌的多肽，但是以上研究均侧重体外细胞或蛋白层面上的研究，并未评价得到多肽的体内靶向特性和作为配体应用于传递药物的能力。因此，本发明利用噬菌体展示肽库技术于卵巢癌肿瘤模型体内筛选得到一条可靶向卵巢癌的十二肽，并对此多肽的体内和体外靶向特性进行了鉴定，以考察其作为靶向配体用于传递药物至卵巢肿瘤部位的可行性。
发明内容
本发明的目的是提供一条利用噬菌体展示肽库技术于卵巢癌肿瘤模型体内筛选得到的具有靶向卵巢癌特性的多肽。本发明的目的通过下述技术方案予以实现
首先，将噬菌体展示随机十二肽库注射入卵巢癌肿瘤模型体内循环15分钟，心脏灌流后回收肿瘤组织中的噬菌体进行滴度测定和扩增，扩增后的噬菌体投入下一轮的筛选。上述的三轮体内筛选后，分别于第二轮和第三轮筛选结果中随机挑取单克隆进行DNA的提取和测序。应用生物信息学工具分析筛选得到的多肽序列，同时酶联免疫吸附实验用于分析候选噬菌体单克隆对细胞的结合能力。挑选富集度高且对细胞选择性结合力强的噬菌体克隆进一步进行体外直接的细胞结合内化实验以及体内回输实验。进一步利用免疫荧光术考察合成多肽与不同细胞的结合情况。本发明筛选得到的多肽经鉴定具有以下特性及优点
(O多肽的氨基酸序列为WSGPGVWGASVK，未发现与此多肽序列完全一致的已知蛋白质，是一条全新的多肽；
(2)多肽在注入卵巢癌肿瘤模型后可指导其噬菌体载体有选择性地富集于卵巢癌肿瘤区域，并显著减少在肝脏和脾脏的富集，表现出针对卵巢癌具有良好的体内靶向特性，具备靶向传递药物或基因至卵巢癌病灶区域的能力；
(3)多肽可有效地识别并特异性结合卵巢癌细胞系SK0V-3、A2780而对正常细胞系3T3、HUVEC，及其他肿瘤细胞A549、Hela, MG63的结合能力弱，表现出针对卵巢癌精准的识别和结合能力；
(4)多肽能通过结合的细胞表面受体介导有效地进入细胞，有助于对药物及基因于细胞内的传递。(5)具有多肽分子量小，组织穿透性好，无免疫原性且对细胞表面受体具有较高亲和力的普遍特点，结合该多肽对卵巢癌体内体外良好的靶向能力，是一种卵巢癌的靶向传递系统。
图I是7个噬菌体单克隆与细胞亲和力的ELISA鉴定(噬菌体的相对结合力=OD
待测!《菌体克隆/OD空白对照I 菌体)；
图2是噬菌体克隆的肿瘤模型体内回输靶向鉴定(噬菌体的相对结合力=TUit3psw^g
/TU空白对照I 菌体)；
图3是体内回输中噬菌体克隆在组织中的分布；
图4是噬菌体克隆与人组织切片结合能力鉴定；
图5是噬菌体克隆对不同细胞的体外靶向能力鉴定(噬菌体的相对结合力=TUit3pswfei
隆/TU空白对照I 菌体)；
图6是多肽的免疫荧光检测。
具体实施例方式本发明通过以下实施例作进一步说明，但不作为本发明的限制。实施例
(I)噬菌体展示随机十二肽库的体内筛选及噬菌体单克隆DNA的测序及分析选用4-6周龄的BALB/c裸鼠，于其右前肢腋下接种人卵巢上皮癌细胞SK0V-3以建立人卵巢癌肿瘤模型。选用New England Biolabs公司的Ph. D_12 肽库,PBS稀释后注入肿瘤模型体内循环15分钟。心脏灌流后回收肿瘤组织进行匀浆、称重并裂解细胞回收其中的曬菌体，扩增后投入下一轮体内筛选。同时用New England Biolabs公司实验指南中所述方法测定每轮筛选中回收的噬菌体的滴度，提取于第二、三轮筛选结果中随机挑取且扩增的噬菌体单克隆DNA，送予上海生物生工公司进行DNA测序。测得的序列用DNAMAN软件进行翻译，进一步利用比对工具BLAST将多肽序列与数据库中已知的蛋白质氨基酸序列进行同源性分析。结果I
经过三轮的体内筛选，噬菌体在第三轮于肿瘤中的富集显著增加，是第一轮富集量的45倍。
随机挑选第二、三轮噬菌体单克隆进行DNA测序分析衣壳蛋白上所展示的多肽序列。其中，展示有WSGPGVWGASVK多肽序列的噬菌体单克隆PC2-1在第二轮中出现频率为
9.7%，而展示有同一多肽的PC3-1在第三轮的出现频率上升至90. 7%，可见此噬菌体多肽经过第三轮筛选在卵巢癌部位得到了有效富集，也反映了展示有WSGPGVWGASVK多肽的噬菌体单克隆(PC3-1/PC2-1)对卵巢癌表现有很强的亲和力。BLAST比对分析结果显示在已知数据库中并未有与WSGPGVWGASVK多肽序列完全一致的蛋白质，说明此12肽是全新的序列。(2)噬菌体单克隆的体内回输靶向鉴定
将扩增后的噬菌体单克隆PC3-l、PC3-2和M13KE空白噬菌体用PBS稀释后注入卵巢癌肿瘤模型中循环15分钟，心脏灌流后回收肿瘤组织及其正常器官组织，将其一部分通过匀浆、称重并裂解回收其中的噬菌体进行滴度测定；另一部分通过固定、切片后利用HRP/抗M13噬菌体抗体进行免疫组化检测。结果2
经过体内回输后，PC3-1相较于空白噬菌体在卵巢癌肿瘤部位获得了 39倍的富集，同时在肝脏和脾脏的富集相较于空白噬菌体分别减少了 76%和81%，这两方面均反映了噬菌体克隆PC3-1在血液循环中对肿瘤组织的靶向能力(见附图2)。而对照PC3-2则未显现此种靶向能力。组织经切片并免疫组化后，可见PC3-1于卵巢癌肿瘤切片上阳性染色明显，而仅有少量的空白噬菌体得到免疫染色(见附图3)。
(3)噬菌体单克隆的体外靶向鉴定
细胞酶联免疫吸附方法(cell-based ELISA)用于鉴定表I中出现频率较高的6个噬菌体克隆对卵巢癌细胞的特异性结合能力，M13KE空白噬菌体用作对照。将噬菌体单克隆(PC3-1/ PC3-2/ PC3-3/ PC3-4/ PC3-5/ PC2-3)与固定、封闭后的细胞(SK0V-3/A2780/HUVEC/3T3)共育2小时后，用HRP/抗M13噬菌体抗体对结合的噬菌体进行检测，TMB显色后用酶标仪进行读数。New England Biolabs公司实验指南中所述的体外筛选方法用于鉴定3个曬菌体单克隆与不同细胞的结合能力，M13KE空白噬菌体用作对照。选取图3中对SK0V-3细胞亲和力较强的噬菌体单克隆(PC3-1/ PC3-2/ PC2-3)与不同细胞(SK0V-3/A2780/A549/Hela/MG63/HUVEC/3T3)共育2小时，严格洗涤后用酸洗溶液洗脱结合于细胞噬菌体进行滴度测定。在进入噬菌体单克隆孵育步骤前加入相应多肽(WSGPGVWGASVK; TLSGAFELSRDK; CON: ARPLEHGSDKAT )与细胞孵育，后续处理与前一致进行多肽-噬菌体多肽的竞争结合测定。New England Biolabs公司实验指南中所述的体外筛选方法用于鉴定2个曬菌体单克隆内化进入卵巢癌细胞的能力。选取噬菌体单克隆(PC3-1/ PC3-2)与不同卵巢癌细胞(SK0V-3/A2780)共育16小时，严格洗涤后用酸洗溶液洗脱结合于细胞噬菌体，裂解细胞后回收内化的噬菌体进行滴度测定。加入噬菌体的同时加入相应多肽(WSGPGVWGASVK; TLSGAFELSRDK;CON:ARPLEHGSDKAT)进行多肽-噬菌体多肽竞争内化实验。免疫组化方法用于检测噬菌体克隆与人组织切片的结合能力。选取噬菌体克隆(PC3-1/ PC3-2)分别与人卵巢癌和正常卵巢组织切片于4°C共育过夜，空白噬菌体用作对照，然后利用抗噬菌体抗体进行免疫检测。结果3
ELISA检测显示在6个噬菌体克隆中，PC3-1对卵巢癌细胞SK0V-3和A2780细胞系均表现有最强的结合能力，而针对正常细胞的结合力弱(见附图I)。这个结果与噬菌体直接结合实验的结果一致，说明PC3-1可识别并靶向结合于卵巢癌细胞系，同时对正常细胞和其他肿瘤细胞的结合少(见附图5)。此外，竞争实验中，低浓度WSGPGVWGASVK和TLSGAFELSRDK多肽的引入即可抑制73%的PC3-1结合，对照肽则未表现此种抑制作用。另一方面，WSGPGVWGASVK多肽可抑制 95%的PC3-1被SK0V-3内化，相同浓度的TLSGAFELSRDK和对照肽分别表现部分抑制和无抑制作用。WSGPGVWGASVK多肽的竞争抑制效果表明PC3-1对细胞的结合并进入细胞的行为是来源于WSGPGVWGASVK多肽的作用，而不是其载体噬菌体颗粒的作用。人组织切片免疫组化结果(见附图4)显示PC3-1在人肿瘤组织切片上可观察到明显的免疫染色，而PC3-2或空白噬菌体结合而引起的免疫染色弱或无，同时PC3-1对正常卵巢组织切片无免疫反应，说明PC3-1可以特异性地识别人卵巢癌的相关靶点并选择性地进行结合。(4)卵巢癌靶向肽的免疫荧光鉴定
将化学合成的生物素标记的特异多肽(biotin- WSGPGVWGASVK; biotin-TLSGAFELSRDK; CONibiotin- ARP)与接种于玻底皿上的细胞共育30min，细胞固定且封闭2小时后应用连接有亲和素的FITC 二抗检测结合于细胞的多肽，共聚焦荧光显微镜上进行观察。结果4
多肽WSGPGVWGASVK与SK0V-3作用均表现有较强的荧光染色，且表现为进入胞浆，部分结合于细胞核，同时对正常细胞HUVEC的染色弱。使用多肽TLSGAFELSRDK有类似的荧光染色现象。而使用对照多肽或未加多肽时染色为阴性，结合PC3-1对WSGPGVWGASVK免疫染色的竞争抑制作用，排除了荧光二抗可能带来的非特异性染色(见附图6)。
权利要求
1.一条具有靶向卵巢癌特性的多肽，其特征在于 (1)所述的多肽是利用噬菌体展示随机12肽库于裸鼠卵巢癌肿瘤模型体内筛选得到，其氨基酸序列为WSGPGVWGASVK ； (2)所述的多肽片段可在卵巢癌肿瘤模型体内循环中靶向富集于肿瘤组织； (3)所述的多肽能够特异性结合卵巢癌细胞系SK0V-3、A2780而对正常细胞系3T3、HUVEC，及其他肿瘤细胞A549、Hela、MG63的结合能力弱； (4)所述的多肽能通过结合的细胞表面受体介导进入细胞，有助于对药物及基因的传 递。
全文摘要
一条具有靶向卵巢癌特性的多肽，利用噬菌体展示肽库技术于卵巢癌肿瘤模型体内筛选得到，其氨基酸序列为WSGPGVWGASVK。经鉴定此多肽不仅可区分卵巢癌细胞和正常细胞及卵巢癌细胞和其他癌症细胞进而与卵巢癌细胞特异性结合，并且可有效地被卵巢癌细胞内化，作为药物载体可提高药物的吸收率。此多肽在静脉注射入肿瘤模型体内后可有效地特异地富集于卵巢癌肿瘤区域，是一条全新的已证实其体内靶向能力的多肽，可作为一种构建靶向载体以传递抗癌药物的理想配体。
文档编号C07K7/08GK102887942SQ20111045831
公开日2013年1月23日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者尹光福, 马楚颖, 魏延 申请人:四川大学