专利名称：因子viii融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及经修饰的凝血因子。特别是，本发明涉及与非同源多肽融合的因子VIII分子，所述多肽为例如抗体结合多肽，例如Fe受体或Fe结构域。本发明还涉及所述分子的用途以及所述分子的生产方法。
背景技术：
A型血友病是由凝血因子VIII (FVIII)活性缺乏或功能障碍所致的一种遗传性出血性疾病。临床表现不在于最初的止血，即血块的形成正常发生，但血块因缺乏相继的凝血酶形成而不稳定。该病通过静脉内注射从血液中分离的或重组产生的凝血因子FVIII而得以治疗。目前的治疗推荐由传统的按需治疗向预防转变。与冯维勒布兰德因子(von Willebrandt Factor)结合的内源FVIII的循环半衰期是12-14小时，因此预防性治疗应ー周进行数次，以使患者获得几乎无症状的生活。IV给予对于许多人，尤其是儿童和年轻人而言伴随明显的不便和/或痛苦。在具有显著延长的循环半衰期的因子VIII变体的开发中已经采用多种方法。很多这类方法都涉及到将因子VIII与亲水性聚合物例如PEG (聚こニ醇)缀合在一起。因此本领域需要具有因子VIII活性的新的因子VIII产品，其包括ー种或多种以下特征优选在结构上是同源的，优选为安全的，优选为生物可降解的，并优选具有显著延长的循环半衰期，以减少每周给予因子VIII的次数。本领域同样需要用于提供这类分子的相对简单的方法。发明概述
本发明涉及重组因子VIII分子，其中所述因子VIII分子是融合蛋白。本发明还涉及所述分子的制备方法以及所述分子的用途。所述分子优选具有改良的循环半衰期。发明描述 定义
融合蛋白融合蛋白/嵌合蛋白，是通过原本编码分开的蛋白质的两种以上基因结合而产生的蛋白质。该融合基因经翻译而得到具有来源于每个原有蛋白质的功能特性的单个多肽。可将本发明的因子VIII分子与另ー多肽融合。优选地，因子VIII融合蛋白将具有比非融合因子VIII分子更长的循环半衰期。可将很多种融合配偶体与FVIII部分结合起来。这些融合配偶体可通过不同机制改变融合蛋白相对于野生型FVIII的性能。推定多种融合配偶体通过与新生儿Fe受体(FcRn)相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过与FcRn相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是免疫球蛋白Fe结构域、人血清白蛋白(hSA)和转铁蛋白或这些蛋白的组成部分。由与推定通过与FcRn相互作用而延迟FVIII的多肽结合的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表2。尽管因为IgG抗体的相对长的循环半衰期而通常优选IgG Fe结构域，但“Fe融合衍生物”或“Fe融合蛋白”在本文中意指包括与可来源于任何抗体同种型的Fe结构域融合的本发明FVIII变体。Fe结构域还可经修饰以调节某些效应子功能，例如补体结合和/或与某些Fe受体结合。FVIII与具有与FcRn受体结合的能力的Fe结构域的融合，通常将会导致融合蛋白的循环半衰期延长(与wt FVIII的半衰期相比)。在IgG Fe结构域中234、235和237位的突变通常将会导致与Fe y RI受体的结合减少，还可能导致与Fe Y RIIa和Fe Y RIII受体的结合减少。这些突变不改变与FcRn受体的结合，其通过内吞再循环途径而促进了长循环半衰期。优选地，本发明的融合蛋白经修饰的IgG Fe结构域包含一个或多个以下突变，所述突变将会分别导致对某些Fe受体的亲和力下降(L234A、L235E和G237A)以及Clq-介导的补体结合降低(A330S和P331S)。然而，本发明也包含这样的FVIII变体其与例如与新生儿Fe受体的结合特性发生改变的Fe结构域融合。如果例如Fe结构域变体具有增加的与例如新生儿Fe受体的亲和力，可能融合蛋白的体内循环半衰期将得到进一步延长。据信调节Fe结构域与新生儿Fe受体的亲和力的人IgG中氨基酸置换的实例是T250Q、M252Y、S254T、T256E、P257I、T307A、Q311I和M428L (残基编号按照EU索引)。推定其它融合配偶体通过与免疫球蛋白相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定 通过与免疫球蛋白相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是Fe受体，例如FcyRI (⑶64)或FcRn或这些蛋白的组成部分。由与推定通过与免疫球蛋白相互作用而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表3。推定某些融合配偶体通过减少与清除受体的相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过减少与清除受体的相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是低密度脂蛋白受体家族Fe受体成员，例如低密度脂蛋白受体相关蛋白或这些蛋白的组成部分，例如重复簇5 (CR5)、6 (CR6)和/或7 (CR7)。由与推定通过减少与清除受体的相互作用而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表4。推定其它融合配偶体通过与血小板相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过与血小板相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是与血小板表面上的蛋白质例如GPIIIa结合的单链(SC)抗体。在SC抗体中，源自免疫球蛋白重链的多肽序列可位于源自免疫球蛋白轻链的多肽序列的N-端。该顺序称为HC-LC。源自免疫球蛋白重链的多肽序列也可位于源自免疫球蛋白轻链的多肽序列的C-端。这后一种顺序称为LC-HC。由与推定通过与血小板相互作用而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表5。推定一些融合配偶体通过与血清白蛋白相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过与血清白蛋白相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是单链抗血清白蛋白抗体(SC抗HSA)和白蛋白结合多肽例如ABD035多肽。白蛋白结合多肽可重复若干次，例如4次重复，正如在4XABD035融合配偶体中所示。由与推定通过与血清白蛋白相互作用而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表6。推定其它融合配偶体通过保护(shielding)而延迟FVIII的体内清除。推定通过保护而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是具有非疏水性氨基酸段例如序列A(seq A)的多肽或充满弹性蛋白样多肽(ELP)例如ELP60的多肽。由与推定通过保护而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表7。推定某些融合配偶体通过调节与vWF的亲和力而延迟FVIII的体内清除。推定通过调节与vWF的亲和カ而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是FVIII的a3区(野生型人FVIII的氨基酸1649-1689)或a3区的部分，因此给FVIII添加ー个或多个额外的a3区。由与推定通过调节与vWF的亲和カ而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表8。推定某些融合配偶体通过尚待确定的机制而延迟FVIII的体内清除。推定通过尚待确定的机制而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是生长激素结合蛋白(GHBP)、凝血因子IX (FIX)部分、vWF部分、vWF结合蛋白、绒毛膜促性腺激素部分和凝血因子X (FX)部分。源自FIX的融合配偶体的非限制性实例是人FIX的氨基酸298-342 (FIX298-342)和人FIX的氨基酸47-125 (FIX47-125)。源自vWF的融合配偶体的非限制性实例是人vWF的氨基酸 1-272 (vffFl-272)、人 vWF 的氨基酸 1-1390 (vWFl-1390)和人 vWF 的氨基酸 497-716(VWF497-716)。源自绒毛膜促性腺激素的融合配偶体的非限制性实例是人绒毛膜促性腺激素@ -链的C-端28个氨基酸(hCG C-端)。源自FX的融合配偶体的非限制性实例是人FX活化肽(FlOAP)。由与推定通过尚待确定的机制而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分 组成的融合蛋白的非限制性实例见表9。推定某些融合配偶体通过调节与脂质的亲和力而延迟FVIII的体内清除。推定通过调节与脂质的亲和力而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是FVIII的C2结构域，因此给FVIII添加一个或多个额外C2结构域。由与推定通过调节与脂质的亲和力而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表10。Fe受体Fc受体是识别和结合抗体的Fe部分的细胞表面受体。根据其结构、细胞分布和与IgG的亲和力，将Fe受体分为3类Fe Y RI (CD64)、FcyRII (CD32)和FC Y RIII(CD16)。依据本发明，与因子VIII分子融合的Fe受体可以是全长或部分长度的Fe受体、及其任何变体(变体包括氨基酸取代、缺失和添加)。如果它们是部分长度的，则应保留与抗体结合的能力。冯维勒布兰德因子(vWF) vffF是存在于血浆中并在内皮(在怀布尔-帕拉德体中)、巨核细胞(血小板a-颗粒)和内皮下结缔组织中组成性地产生的ー种大的单聚/多聚糖蛋白。其主要功能是与其它蛋白、尤其是与因子VIII结合，并且它在血细胞粘附于受伤部位中是重要的。因子VIII与vWF结合的同时在循环中失活；因子VIII当未与vWF结合时快速降解或被清除。因此由此断定，迄今已认为降低或消除FVIII的vWF结合能力在获取具有延长循环半衰期的因子FVIII变体中是非常不希望的途径。术语“与vWF的结合能力降低”在本文中意指包括因子VIII变体，其中与vWF的结合能力降低至少50%，优选至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、和最优选约100%。FVIII与vWF的结合可通过ELISA样测定来检测或使用表面等离振子共振来测定为与固定化vWF的直接结合。在因子VIII中负责与vWF结合的区域是跨越残基1670-1684的区域，其公开于EP0319315。设想涉及该区域的因子VIII点突变和/或缺失突变(deltion mutatant)将会改变与vWF结合的能力。本发明特别优选的点突变的实例包括包含ー个或多个以下点突变的变体Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。因子VIII分子FVIII/因子VIII是主要由肝细胞产生的一种大而复杂糖蛋白。FVIII由2351个氨基酸组成，包括信号肽，并含有由同源性限定的若干不同结构域。有3个A结构域、I个独特的B结构域和2个C结构域。结构域的顺序可列为NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。FVIII在血浆内以在B-A3边界分开的2条链而循环。这两条链通过二价金属离子结合而连接。A1-A2-B链称为重链(HC)，而A3-C1-C2称为轻链(LC)。内源因子VIII分子在体内作为具有不同大小的B结构域的分子库而循环。在体内可能发生的是对B结构域的逐步酶切除，产生具有不同大小的B结构域的分子库。通常认为在740位的切割(B结构域的最后部分正是因此而被切除)的发生与凝血酶激活相关。然而，这并不能排除因子VIII变体(其中例如在740位的切割位点已经受损)可具有活性。本文所用的“因子VIII”或“FVIII”是指作为内 源性凝血途径的成员并对凝血而言至关重要的人血浆糖蛋白。“天然FVIII”是如SEQ ID NO. I (氨基酸1-2332)所示的全长人FVIII分子。B结构域跨越SEQ ID NO I中的氨基酸741-1648
SEQID N01:
ATRRYYlGAVELSWDYMQSDiGELPVDARFPFRVPKSFPFMISVVYKKlLFVEFTDHLFNlAKPRPPWyGLLGPTlQAE VYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSOREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKEW6PMASDPLCLTYSYLSHVDLVKOLNSGUGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFlLLf AVFDEGKSWHSETKNSLyQORDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSlFLEGHlFLVRNHRQASLElSPITFLmQTLLMOLGQFLLf CHISSHOHOGMEAWKVDSCPeEPQLRMKNNEEAEDYDODLTDSEMDWRfODDNSPSf IQiRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWOYAPLVlAPDDRSVKSQYLNNGPQRIGRK.YKKVRFfyiAYTDETfKTREAiQHESGlLGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKOFPiLPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSOPRCLTRYYSSFVNMERDLASGUGPILICYKE.SVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLFNPAGVQLEDPEFQASNIMHSIWGYVFDSLQLSVCmEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMWEDTLJLFPFSGETVFMSME^PGLWILGCHNSDFRNRGMWLLKVSSCOKNTGOYYEDSYEDtSAYLLSKNNAIEPRSFSQNS-RHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSOLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDFSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDyVFTPESStQL
RLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTBMNLISTIPSDWLAAGfDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTT
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VKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLR1HPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY本发明的因子VIII分子可以是B结构域截短的因子FVIII分子，其中剩余结构域基本对应于SEQ ID NO I中氨基酸编号1-740和1649-2332所示序列，尽管在残基1670-1684之间的vWF结合区内可能也有例如一个或多个改变。然而，本发明的B结构域截短的分子可与SEQ ID NO I所示序列具有微小差异，意即剩余结构域(即3个A结构域和2个C结构域)与SEQ ID NO I所示氨基酸序列(氨基酸1-740和1649-2332)可具有微小差异，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异或约1%、2%、3%、4%或5%差异，这是因为可引入突变以降低例如vWF结合能力这一事实。此外，可能在分子的其它位置导入氨基酸修饰(取代、缺失等)，以改变因子VIII与多种其它组分(例如LRP、多种受体、其它凝血因子、细胞表面)的结合能力，引入和/或消除糖基化位点等。本发明的因子VIII分子具有因子VIII活性，意即以下能力在凝血级联中以与FVIII功能类似或等同的方式起作用，通过与被激活的血小板上的FIXa相互作用而诱导FXa的形成，并支持血块的形成。该活性可通过本领域熟知的技术在体外评估，所述技术为例如凝血分析、内源凝血酶潜在性分析等。本发明的因子VIII分子具有FVIII活性，其为天然人FVIII活性的至少约10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、和100%或甚至超过100%。
B结构域闵子VIII中的B结构域跨越SEQ ID NO I的氨基酸741-1648。B结构域在若干不同位点被切割，在循环血浆FVIII分子中产生大的异质性。高度糖基化的B结构域的准确功能尚未知晓。已经知道的是该结构域对于凝血级联中的FVIII活性而言并非必要。这种明显的功能缺乏得到以下事实支持B结构域缺失的/截短的FVIII看来具有与在全长天然FVIII中所见的相同的体内性能。话虽如此，据显示B结构域可减少与细胞膜的缔合，至少在无血清条件下是如此。B结构域截短的/缺失的因子VIII分子将内源全长FVIII合成为单链前体分子。分泌之前，将前体切割成重链和轻链。可由2种不同策略产生重组B结构域缺失的FVIII。将无B结构域的重链以及轻链分别合成为两种不同多肽链(两链策略) 或者将B结构域缺失的FVIII合成为单条前体多肽链(单链策略)，其按照与全长FVIII前体相同的方式切割为重链和轻链。在B结构域缺失的FVIII前体多肽中，重链和轻链部分通常被接头间隔开来。为了尽量减小在B结构域缺失的FVIII中引入免疫原性表位的风险，接头序列优选源自FVIIIB结构域。至少，接头必须包含蛋白酶识别位点，所述酶将B结构域缺失的FVIII前体多肽分离为重链和轻链。在全长FVIII的B结构域中，氨基酸1644-1648构成该识别位点。在B结构域缺失的FVIII激活时导致接头去除的凝血酶位点位于重链上。因此，接头的大小和氨基酸序列不大可能影响其经由凝血酶激活而从剩余FVIII分子上切除。B结构域的缺失对于FVIII的产生是有利的。然而，B结构域的部分可包括在接头中而不降低产率。B结构域对产率的负面效应并不归因于B结构域的任何特定尺寸或序列。截短的B结构域可含有若干0-糖基化位点。然而，依据一个优选的实施方案，所述分子在截短的B结构域中包含仅I个、备选2、3或4个0联寡糖。依据一个优选的实施方案，截短的B结构域包含仅I个可能的0-糖基化位点并且侧链例如PEG或白蛋白结合剂与该0-糖基化位点共价缀合。可将在本发明的B结构域截短的分子中的0联寡糖连接到0-糖基化位点，所述位点通过重组方式和/或通过经由B结构域截短而将“隐藏的” 0-糖基化位点暴露而人工产生。在这两种情况下，可通过设计B结构域截短的因子VIII的氨基酸序列并随后对所述氨基酸序列进行计算机(in si I i co)分析,预测截短的B结构域中0-糖基化位点的概率,从而制备所述分子。可在合适宿主细胞中合成有相对高概率具有所述糖基化位点的分子，然后分析糖基化模式并随后选择在截短的B结构域中具有0联糖基化的分子。所述因子VIII分子也含有大量N联寡糖并且它们每个都可同样作为用于连接疏水性侧基的锚。用于产生本发明的重组因子VIII融合蛋白的合适宿主细胞优选是哺乳动物来源的，以确保所述分子被糖基化。在实施本发明时，所述细胞是哺乳动物细胞，更优选已确立的哺乳动物细胞系，包括但不限于CH0、C0S-1、幼仓鼠肾(BHK)和HEK293细胞系。其它合适的细胞系包括但不限于大鼠H印I、大鼠H印II、TCMK、人肺、DUKX细胞(CH0细胞系)。还可使用的是3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其它细胞的融合物。在某些实施方案中，所述细胞可以是突变的或重组的细胞，例如与其所来源的细胞类型相比表达在质量或数量上不同的酶谱的细胞，所述酶催化蛋白质的翻译后修饰(例如糖基化酶例如糖基转移酶和/或糖苷酶，或加工酶例如前肽)。DUKX细胞(CH0细胞系)是特别优选的。
目前优选的细胞是HEK293、COS、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)和骨髓瘤细胞，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在wt FVIII分子中B结构域的长度为约908个氨基酸。在本发明分子中截短的B结构域的长度可在约10-约800个氨基酸的范围内变化，例如约10个氨基酸-约700个氨基酸，例如约12-500个氨基酸、12-400个氨基酸、12-300个氨基酸、12-200个氨基酸、15-100个氨基酸、15-75个氨基酸、15-50个氨基酸、15-45个氨基酸、20-45个氨基酸、20-40个氨基酸、或20-30个氨基酸。所述截短的B结构域可包含重链和/或轻链的片段和/或wt FVIII分子中不存在的人工导入序列。术语“B结构域截短的”和“B结构域缺失的”在本文中可互换使用。改良的循环半衰期与野生型因子VIII分子相比，本发明的分子具有改变的循环半衰期，优选增加的循环半衰期。循环半衰期优选增加至少10%，优选至少15%，优选至少20%，优选至少25%，优选至少30%，优选至少35%，优选至少40%，优选至少45%，优选至 少50%，优选至少55%，优选至少60%，优选至少65%，优选至少70%，优选至少75%，优选至少80%，优选至少85%，优选至少90%，优选至少95%，优选至少100%，更优选至少125%，更优选至少150%，更优选至少175%，更优选至少200%，和最优选至少250%或300%。甚至更优选地，所述分子具有的循环半衰期增加至少400%，500%，600%，或甚至700%。亲水性聚合物本发明的侧基优选是非天然存在的亲水性聚合物，其包含至少一个非天然存在的聚合部分。在另一实例中，非天然存在的修饰基团是经修饰的碳水化合物。示例性的本发明亲水性聚合物包括水溶性聚合物，其可以是直链或支链并且可包含一个或多个独立选择的聚合部分，例如聚(亚烷基二醇)及其衍生物。本发明的聚合修饰基团可包括水溶性聚合物，例如聚(乙二醇)及其衍生物(PEG，m-PEG)、聚(丙二醇)及其衍生物(PPG, m-PPG)等。本发明水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)(即PEG)。本发明相关的术语PEG包括任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、双功能PEG、多臂PEG、分叉PEG、分支PEG、垂悬PEG (即具有挂在聚合物主链上的一个或多个官能团的PEG或相关聚合物)、或其中具有可降解键的PEG。聚合物主链可以是直链或支链的。支链聚合物主链是本领域公知的。通常，支链聚合物具有中央分支核心部分和与该中央分支核心连接的多个直链聚合物链。常使用支链形式的PEG，其可通过将氧化乙烯加成到不同多元醇例如甘油、季戊四醇和山梨醇中而制备。中央分支部分也可源自若干氨基酸，例如赖氨酸或半胱氨酸。在一个实例中，支链聚(乙二醇)可以通式表示为R(_PEG-0H)m，其中R代表核心部分，例如甘油或季戊四醇，m代表臂的数目。多臂PEG分子，例如美国专利号5，932，462 (其通过引用全部结合到本文中)中描述的那些，也可用作聚合物主链。许多其它聚合物也适合本发明。非肽和水溶性的聚合物主链特别可用于本发明。合适聚合物的实例包括但不限于其它聚(亚烷基二醇)、例如聚(丙二醇)("PPG")、乙二醇和丙二醇等的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇(olefmic alcohol))、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚([ ]-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)(例如美国专利号5，629，384 (其通过引用全部结合到本文中)中描述的)，及其共聚物、三元共聚物和混合物。
尽管所述聚合物主链每条链的分子量可变化，但典型的范围为约100 Da-约160, 000 Da，例如约5，000 Da-约100，000 Da。更具体地讲，每种本发明缀合的亲水性聚合物的大小可在以下范围内变化约500 Da-约80，000 Da，例如约1000 Da-约80，000 Da;约 2000 Da-约 70，000 Da ;约 5000-约 70，000 Da ;约 5000-约 60，000 Da ;约 10，000-约70，000 Da ;约 20，000-约 60，000 Da ;约 30，000-约 60，000 Da ;约 30，000-约 50，000 Da ；或约30，000-约40，000 Da。应当知道，这些大小代表估计值，而并非准确测量值。依据一个优选的实施方案，将本发明的分子与亲水性聚合物的异质群体缀合，所述聚合物为例如大小如下的 PEG :例如 10，000,40, 000 或 80，000 Da +/-约 5000、约 4000、约 3000、约 2000或约 1000 Da。侧链/侧基也可将本发明的因子VIII分子与并非亲水性聚合物的侧基缀合。本发明的侧链可以例如选自以下列出的一种或多种脂肪酸及其衍生物(有时也称为“白蛋白结合剂”)、肽等。本发明的疏水性侧基优选是生物可降解的。此外，可有不止一个疏水性侧基与单个因子VIII分子缀合，例如有2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个。此外由此得出还可将本发明的因子VIII分子与一个或多个疏水性侧基以及一个或多个疏水性侧基、肽 侧基等缀合。因此，单个本发明的因子VIII分子可包含侧基，例如亲水性和疏水性/肽类侧基。然而，将该分子与不同类型侧基缀合伴随着另外的努力，因此这种解决方案可变得在实践中相对不实用。本发明的分子因此优选仅包含I种侧链(例如亲水性侧链/疏水性侧链)。然而，迄今为止，并不认为因子VIII同疏水性侧基的缀合是同亲水性基团的缀合的具有吸引力的备选。一种解释可能是预期到需要采用使用有机溶剂的费力和/或苛刻的化学方法。另一种解释可能是预期通常相对小的疏水性分子不能有效地将缀合的(大)因子VIII分子与例如白蛋白结合并因此可能保护分子免于清除。白蛋白结合剂缀合物
已知可通过使用白蛋白结合侧链来改善这种蛋白质的体内性能。这种侧链或白蛋白结合剂可在给予之前连接到所述蛋白质上并且例如可以在体内稳定所述蛋白质或改进或延长所述蛋白质的体内半衰期。因此白蛋白结合剂可促进衍生物在血流中循环。白蛋白结合剂可具有延长或延迟与之结合的蛋白质的作用时间的效果，这是因为以下事实肽衍生物和白蛋白的复合物仅缓慢崩解以释放活性药物成分。因此，优选的取代基或侧链作为整体可称为白蛋白结合部分。白蛋白结合剂(白蛋白结合部分)可包含与白蛋白结合以及因此在血流中循环的延长特别相关的部分，所述部分因此可称为延长部分。延长部分优选位于白蛋白结合部分相比于其与肽的连接点的相反一端或附近。在一个优选的实施方案中，白蛋白结合剂是或包含能够与白蛋白形成非共价复合物的侧链。白蛋白结合剂可与白蛋白非共价结合和/或可逆结合。白蛋白结合剂可与白蛋白特异性结合。根据下述方法可以清楚的是，白蛋白结合剂可结合到环糊精。白蛋白结合剂可与环糊精非共价结合和/或可逆结合。白蛋白结合剂可与环糊精特异性结合。本文所述的白蛋白结合剂通常是疏水性基团。白蛋白结合部分的其它部分，即介于延长部分和与肽的连接点之间的部分，可称为接头部分、接头、间隔物等。然而，这类接头的存在是任选的，因此白蛋白结合部分可与延长部分相同。在特别的实施方案中，白蛋白结合部分和/或延长部分是亲脂的，和/或在生理pH(7. 4)下带负电荷。白蛋白结合部分和/或延长部分可通过缀合化学例如烷基化、酰化或形成酰胺而与肽的氨基共价连接；或通过例如酯化、烷基化、肟化而与羟基共价连接。在一个优选的实施方案中，白蛋白结合部分和/或延长部分的活性酯在形成酰胺键的条件下与唾液酸残基或唾液酸衍生物的氨基共价连接(该过程称为酰化)。除非另有说明，否则当谈及蛋白质酰化时，应当理解为氨基与糖蛋白上的唾液酸残基连接。对于本发明的目的，术语“白蛋白结合部分”、“延长部分”和“接头”包括这些分子 的未反应形式以及反应形式。是否意指一种形式或其它形式，根据其中使用术语的上下文是清楚的。白蛋白结合部分可以是或可包括脂肪酸或脂肪二酸或其衍生物或其任一种。术语“脂肪酸”是指具有4-28个碳原子、例如16个碳原子的脂族一羧酸。其优选是无支链的，和/或偶数个的，并且它可以是饱和或不饱和的。术语“脂肪二酸”是指如上定义的、但在《位置上具有额外羧酸基团的脂肪酸。因此，脂肪二酸是二羧酸。命名按照本领域常用的命名，例如-COOH以及H00C-，是指羧基；_C6H4-是亚苯基；-C0_以及-0C-,是指擬基(0=C〈)；和C6H5-O-是指苯氧基。在一个优选的实施方案中，所述接头部分，如果存在的话，具有2-80个C原子、优选5-70个C原子。在额外优选的实施方案中，所述接头部分，如果存在的话，具有4-20个杂原子，优选2-40个杂原子，更优选3-30个杂原子。杂原子的特别优选的实例是N原子和0原子。H原子不是杂原子。在另一个实施方案中，所述接头包含至少一个OEG分子、和/或至少一个谷氨酸残基，或相应的基团(0EG是指8-氨基-3，6-二氧杂辛酸，即以下基团-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-)。在一个优选的实施方案中，所述接头部分包含通过酰胺键与唾液酸残基连接的二羧基残基。在优选的实例中，所述二羧基残基具有2-30个C原子，优选4-20个C原子，更优选4-10个C原子。在另外的优选实例中，所述二羧基残基具有0-10个杂原子，优选0-5个杂原子。在另一个优选的实例中，所述接头部分包含同时含有氨基和远端羧基的基团，所述基团通过其远端羧基经由酰胺键与唾液酸残基连接。在一个优选的实施方案中，该基团是OEG基团。氨基酸谷氨酸(Glu)包含2个羧酸基团。其Y-羧基优选用于与唾液酸残基或唾液酸衍生物的氨基、或与OEG分子的氨基(如果有的话)、或与另一 Glu残基的氨基(如果有的话)形成酰胺键。Glu的氨基进而与延长部分的羧基、或与OEG分子的羧基(如果有的话)、或与另一 Glu的Y-羧基(如果有的话)形成酰胺键。这种包含Glu的方式偶尔简称为“ Y-Glu，，。
不受理论的束缚，设想之所以将疏水性侧基与具有降低的vWF结合能力的因子VI11分子连接，而不是将这类侧基与具有正常vWF结合能力的因子VIII分子连接可能有利的原因在于侧基的相对大小在大的因子VIII/vWF复合物中是相对小的。假定相对大的侧基在保护游离因子VIII不被清除中起更有效的作用。还假定FVIII的半衰期与vWF的相关。与vWF结合能力降低的FVIII分子最有可能具有暴露的清除表位，所述清除表位通常已被vWF保护。因而假定通过连接侧基，该“清除保护”可被恢复。在其它情况下，侧基例如抗体片段的连接可通过例如将所述分子与具有相对长循环半衰期的蛋白、细胞或血小板连接而起作用。0-联寡糖N_聚糖和0-聚糖都通过产生蛋白质的细胞而与该蛋白连接。当初生蛋白质从核糖体向内质网移动时，细胞的N-糖基化机构识别氨基酸链中的N-糖基化信号(N-X-S/T 基序)并使之糖基化(Kiely 等，1976 ；Glabe 等，1980)。同样，0-聚糖连接到氨基酸链中的特异性0-糖基化位点，但触发0-糖基化的基序与N-糖基化信号相比要异质得多，并且我们对氨基酸序列中0-糖基化位点的预测能力尚不充分(Julenius等，2004)。因此，人工0-糖基化位点的构建有一些不确定性。
疏水性侧基的连接可使用化学方法进行因子FVIII分子与疏水性侧基的缀合。然而，使用酶促方法具有很多潜在优势。根据本发明优选的酶促方法，可经化学方法制备[疏水性延长基团]-唾液酸基-CMP底物。使用唾液酸转移酶，可经酶促方法将该底物转移到因子FVIII上存在的聚糖上。本发明的发明人已经出乎意料地证明无需添加任何有机溶剂就可进行这种酶促方法。使用有机溶剂有很多的不利条件，例如丧失生物活性、环境问题、确保完全除去有机溶剂所采取的额外步骤等。也有可能可避免加入环糊精，环糊精是一种去垢剂，也可造成生物功能的损失。在酶促缀合过程中，添加甘油，例如5-30%甘油，优选10-20%甘油，可能是有利的。甘油的存在似乎例如在冷冻/融解过程中稳定因子VIII分子，并且它还可防止形成因子VIII结晶。因此，在缀合过程完成之后，无需除去酶促缀合期间所存在的甘油。唾液酸转移酶唾液酸转移酶是将唾液酸转移到初生寡糖上的酶。每种唾液酸转移酶对特定的糖底物具有特异性。唾液酸转移酶将唾液酸添加到唾液酸化糖脂(神经节苷月旨)的末端部分或添加到糖蛋白的N-联糖链或0-联糖链上。存在大约20种不同唾液酸转移酶，其可根据它们所作用的受体结构和它们所形成的糖键类型而区分。本发明优选的唾液酸转移酶是ST3Gal-I (对0-聚糖具有特异性)和ST3Gal-III (对N-聚糖具有特异性)。因此有可能通过例如选择特异性唾液酸转移酶和/或改造具有特定糖基化模式的因子VIII分子，对本发明的缀合的因子VIII分子的结构进行改造。药物组合物药物组合物在本文优诜意指包括包含本发明因子VIIII分子的适于胃肠外给药用的组合物，例如即用型无菌含水组合物或可在例如水或含水缓冲液中重构的干燥的无菌组合物。本发明的组合物可包含多种药学上可接受的赋形剂、稳定剂等。在这类组合物中的额外成分可包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节齐U、螯合剂、金属离子、油性溶媒、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白)和两性离子(例如氨基酸，例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。这类额外成分当然不应对本发明药物制剂的总体稳定性有不利影响。胃肠外给药可通过使用注射器任选笔样注射器经由皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射而进行。或者，胃肠外给药可通过输注泵的方式而进行。进一步的选项是组合物，其可以是以鼻或肺部喷雾的形式给予FVIII化合物的溶液剂或混悬剂。作为再一个进一步的选项，含有本发明FVIII化合物的药物组合物也可适于透皮给药，例如通过无针注射或贴剂(任选离子电渗贴剂)，或透黏膜给药例如口腔给药。本文所用的术语“治疗”是指对有需要的任何人类或其它动物受试者的医学治疗。预期所述受试者已经历医师的体检，所述医师已经做出试验性或确定性诊断，表明使用所述特定治疗对所述人类或其它动物受试者的健康而言是有益的。所述治疗的时机和目的可依据受试者的健康现状而因不同个体而异。因此，所述治疗可以是预防性的、治标的、针对症状的和/或治愈性的。第一方面，本发明涉及重组因子VIII分子，其中所述因子VIII分子是包含因子VIII分子和融合配偶体的融合蛋白。在第一实施方案中，所述融合配偶体置换了因子VIII分子的a3结构域。因此，因子FVIII的小的a3结构域可被融合配偶体全部或部分置换。在第二实施方案中，所述融合配偶体插入到因子VIII的B结构域中。B结构域可以是全长B结构域，但在一个优选的实施方案中，B结构域是显著截短的。因此在融合配偶体的N-末 端和C-末端有至少3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸来自B结构域。在另一个优选的实施方案中，所述融合配偶体插入到或位于因子FVIII的C2结构域的C-末端。在第三实施方案中，本发明的因子VIII分子与抗体结合分子例如Fe受体融合。抗体结合分子的实例列于下表中。在第四实施方案中，因子VIII分子与具有与人血清白蛋白结合的能力的分子融合。在另一个实施方案中，因子VIII与转铁蛋白融合。其实例也在下文提供。在第五实施方案中，因子VIII分子与具有与血小板结合的能力的分子融合，这类分子的具体实例同样在下文提供。在再一个实施方案中，因子VIII分子与具有与因子VIII清除受体结合的能力的分子融合。在第六实施方案中，本发明的因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。优选地，这类因子VIII分子在跨越SEQ ID NOl的氨基酸1670-1684的区域内包含突变(氨基酸的取代、缺失或添加)。最优选地，这类因子VIII分子包含一个以下点突变Y1680F、Y1680R、Y1680N、和 E1682T、和 Y1680C。在第七实施方案中，本发明的分子与侧基缀合。该侧基可选自以下列出的一种或多种亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。优选地，侧基是PEG基团、脂肪酸衍生物或多肽。优选地，使用酶促方法将这类侧基连接到分子上，所述方法为例如W00331464中所公开的技术，其中0-联聚糖和/或N-联聚糖用作接头。本发明的另一方面涉及与融合配偶体融合的FVIII分子，其中所述融合配偶体置换因子VIII分子的A3结构域。在一个实施方案中，所述融合配偶体是白蛋白。在另一个实施方案中，所述融合配偶体是Fe受体。在另一个实施方案中，所述Fe受体是Fe YRI。在另一个实施方案中，所述融合配偶体是Fe结构域。在另一个实施方案中，所述Fe结构域是具有降低的效应子功能和/或增加的对新生儿Fe受体的亲和力的突变Fe结构域。在另一个实施方案中，所述融合蛋白与侧基缀合。在另一个实施方案中，所述侧基通过N-联聚糖和/或0-联聚糖连接到融合蛋白。在另一个实施方案中，所述侧基通过唾液酸连接到N-联聚糖和/或0-联聚糖。在另一个实施方案中，所述侧基选自以下列出的一种或多种亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。在另一个实施方案中，所述FVIII分子是B结构域截短的分子，其中B结构域包含SEQ ID NO 2所示的序列。在另一个实施方案中，所述融合蛋白在包含SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的截短的B结构域中包含与O-联聚糖连接的侧基。在另一个实施方案中，因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。在另一个实施方案中，具有降低的vWF结合能力的因子VIII分子包含选自以下列出的突变Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。本发明的另一方面涉及与融合配偶体融合的FVIII分子，其中所述融合配偶体插入到因子VIII的B结构域中。在一个实施方案中，所述融合配偶体是白蛋白。在另一个实施方案中，所述融合配偶体是Fe受体。在另一个实施方案中，所述Fe受体是Fe YRI。在另一个实施方案中，所述融合配偶体是Fe结构域。在另一个实施方案中，所述Fe结构域是具有降低的效应子功能和/或增加对的新生儿Fe受体的亲和力的突变Fe结构域。在另一个实施方案中，所述融合蛋白与侧基缀合。在另一个实施方案中，所述侧基通过N-联聚糖和/或0-联聚糖与融 合蛋白连接。在另一个实施方案中，所述侧基通过唾液酸连接到N-联聚糖和/或0-联聚糖。在另一个实施方案中，所述侧基选自以下列出的一种或多种亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。在另一个实施方案中，所述FVIII分子是B结构域截短的分子，其中所述B结构域包含SEQ ID NO 2所示的序列。在另一个实施方案中，所述融合蛋白在包含SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的截短的B结构域中包含与0-联聚糖连接的侧基。在另一个实施方案中，因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。在另一个实施方案中，具有降低的vWF结合能力的因子VIII分子包含选自以下列出的突变Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。本发明的另一方面涉及与融合配偶体融合的FVIII分子，其中所述融合配偶体插入到因子FVIII的C2结构域的C-末端。在一个实施方案中，所述融合配偶体是白蛋白。在另一个实施方案中，所述融合配偶体是Fe受体。在另一个实施方案中，所述Fe受体是Fe YRI。在另一个实施方案中，所述融合配偶体是Fe结构域。在另一个实施方案中，所述Fe结构域是具有降低的效应子功能和/或增加的对新生儿Fe受体的亲和力的突变Fe结构域。在另一个实施方案中，所述融合蛋白与侧基缀合。在另一个实施方案中，所述侧基通过N-联聚糖和/或0-联聚糖连接到融合蛋白。在另一个实施方案中，所述侧基通过唾液酸连接到N-联聚糖和/或0-联聚糖。在另一个实施方案中，所述侧基选自以下列出的一种或多种亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。在另一个实施方案中，所述FVIII分子是B结构域截短的分子，其中所述B结构域包含SEQ ID NO 2所示的序列。在另一个实施方案中，所述融合蛋白在包含SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的截短的B结构域中包含与0-联聚糖连接的侧基。在另一个实施方案中，因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。在另一个实施方案中，具有降低的vWF结合能力的因子VIII分子包含选自以下列出的突变Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。另一方面涉及本发明分子的制备方法，其中所述方法包括在合适条件下温育编码所述分子的宿主细胞。因此，本发明也涉及包含编码本发明分子的核酸序列的核酸分子以及表达载体和宿主细胞。经由这类方法获取的或可经由这类方法获取的分子同样是本发明的一个方面。另一方面涉及本发明分子作为药物的用途。另一方面涉及本发明分子用于治疗血友病、优选A型血友病的用途。
另一方面涉及包含本发明的分子和任选一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本发明的另一方面涉及血友病的治疗方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的本发明分子。
实施例实施例I FVIII构架和融合配偶体
本发明的融合蛋白由与来自另一蛋白的多肽(融合配偶体)连接的FVIII蛋白(FVIII部分)组成。融合蛋白的FVIII部分可以是具有FVIII活性的任何蛋白。FVIII部分可以是B结构域缺失的/截短的(BDD) FVIII蛋白，其中FVIII B结构域部分已从该蛋白上切除。可构成融合蛋白的FVIII部分的FVIII构架的非限制性实例见表I。F8-500是一种BDD人FVIII蛋白。从N-端开始，F8-500由FVIII信号肽(氨基酸-19至-I)、后接无B结构域的 FVIII HC (氨基酸 1-740)、21 个氨基酸的接头(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR) (SEQ ID NO2)和FVIII LC (野生型人FVIII的氨基酸1649-2332)组成。21个氨基酸的接头序列源自FVIII的B结构域并由全长野生型人FVIII的氨基酸741-750和1638-1648组成。F8-500- A a3由无a3区的F8-500组成。在F8-500- A a3中，将野生型人FVI11的氨基酸1647-1687从F8-500中除去。因此，氨基酸1645-1648处的弗林蛋白酶位点已被破坏。然而，合并的弗林蛋白酶和凝血酶位点是由在F8-500-Aa中的R1645-H1646-P1688-R1689氨基酸段所产生的。a3区对于FVIII与vWF的结合而言是重要的并因此与野生型FVIII相t匕，降低了 F8-500-Aa3对vWF的亲和力。F8-500_His由具有插入到F8-500接头的His标签的F8-500组成。因此F8-500-His 的接头序列是 SFSQNSRHPSHHHHHHSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO 3)。F8-500-Aa3-His由无a3区、但具有插入到F8-500接头的His标签的F8-500组成。因此，在F8-500-Aa3-His中，野生型人FVIII氨基酸1647-1687已从F8-500中除去并且接头序列是 SFSQNSRHPSHHHHHHSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO 4)。F8-500-Y1680F 和 F8-500-Y1680C 由 F8-500 组成，其中全长野生型人 FVIII 的氨基酸1680已从酪氨酸分别变为苯丙氨酸和半胱氨酸。这两个氨基酸置换降低了 FVIII对vWF的亲和力。此外，Y1680C氨基酸置换引入游离半胱氨酸，其可用作将延长部分与融合蛋白缀合的柄(handle)。可将融合配偶体与融合蛋白的FVIII部分的若干位置连接。用于连接融合配偶体的FVIII上的位置的非限制性实例是在介于FVIII HC和LC之间的B结构域或B结构域衍生的接头中的位置，在a3的位置，和在FVIII LC的C-端。实施例2
编码FVIII构架和融合蛋白的表达载体的构建
FVIII和融合配偶体间的融合都涉及用于扩增融合配偶体的PCR。将限制位点加入到所用的PCR引物的末端。限制酶用于克隆融合配偶体cDNA或合成DNA为FVIII cDNA。在F8-500的B结构域中的融合发生在aa750和aal638之间。在B结构域内或其侧翼的限制位点AvrII、NruI、AgeI和MluI用于插入编码融合配偶体的DNA。对于在FVIII轻链羧基端的融合，修饰F8-500编码构建体。通过定点诱变消除内部BamHI位点(aa 604-606)并将编码柔性(GGGS)6接头的DNA插入到编码区3’。将一个新的BamHI位点引入编码接头的DNA的3’端，以便于将C-端融合配偶体克隆到BamHI位点和NotI位点之间。然后，插入融合配偶体DNA。来自该构建体的融合蛋白在表2-12中称为F8-500-C2-连接的-(GGGS) 6-X。类似于(GGGS) 6接头，将最小GS-接头(BamHI限制位点)插入到F8-500编码区3’端。BamHI限制位点(GGATCC)形成GS (甘氨酸-丝氨酸)的两个密码子。来自该构建体的融合蛋白在表2-12中称为F8-500-C2-连接的-GS-X。没有任何接头的情况下与F8-500的C-端的融合如下进行通过用延伸引物PCR扩增融合物，所述延伸引物在5’端带有F8-500编码区最后的109 bp和在PCR产物的3’端具有NotI限制位点。XbaI限制位点存在于离F8-500终止密码子的104-109 bp处。XbaI限制酶和NotI限制酶用于克隆无接头的融合配偶体。来自后面这些构建体的融合蛋白在表2-12中称为F8-500-C2-连接的-X。为了在a3位置插入融合配偶体编码DNA并由此在编码蛋白中用融合配偶体置换 a3，将SacII限制位点引入a3编码区的3’。因此，融合配偶体编码DNA可通过插入AgeI位点和SacII位点之间或者AvrII位点和SacII位点之间而引入。hFc (SEQ ID NO 5)
htcppcpapeaegepsvflfppkpkdllfTniisrtpevtcvwdvshedpevkfnwyvcigvevhnaktkpfeeqyqs
lyrwsviMhqdwingke^tekvsnNalpapieMskakgqprepqvyttppsrclellkriqvsltcIvkgfypscJiavewesng
qpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmheaihnhytqkslslspgk
mFc (SEQ ID NO 6)
kpcppckcpapnaegepsvfifppkikdvloistepmvtcwvdvseddpdvqiswfvninvevftaqiqlhrecJyq
stlrvvsalpiqfiqclwmsfkefkckvninkalpapiertiskpkgsvrapqvyvtppfeeemWqvtltcmvtdfmpediyvewt
nngktelfiykntepvidsdgsyfmysklrvek^nwvernsyscsvvheglhnhhtlksfsrtpgk
人血清白蛋白(HSA) (SEQ ID NO 7)
DahksevahrfkdlgeerrfkaivlisfaqylqqcpfedhvklvnevtefaklcvaclesatncdksllittfgdkIcIvatIr
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转铁蛋白(SEQ ID NO 8)VPDKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVfPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYG-SKEDPQTFYAVAWKKOSGFQMNQLRGKKSCH 丁 GLS3RSAGWN 劃 GLLYCDLPEPRKPLEKAVAMFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAfKClKDGAGDVAFVKHSTtFEMLANKADRDQYELLCiDNTRKFVDEVKDCHLAQVPSHTWARSMGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHG-
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hFc Y RI (CD64) (SEQ ID NO 9)
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FcRn (SEQ ID NO 10)
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FcRn-H166K (SEQ ID NO 11)
seshlsllyhltavsspapgtpafwvsgwlgpqciyteynslrgeaep-cgawvwenqvswyweketldlrikeklfle afkalggkgpytlqgllgcelgpdntsvptakfalngeefmnfdlkqgtwggdwpealaisqrwqqqdkaankeltfllfscphfire ktergrgnlewkeppsinrlkarpsspgfsvltcsafsfyppelqirflrnglaaglgqgdfgpinsdgsfhasssltvksgdehhycci vq haglaqpl rveles pakss
LRP-CR5-6 (SEQ ID NO 12)
tcppn-cjfscasgrcipiswtcdfdddogdrsdesascayptcfpltqftcnngrciranwrcdnclncJcgdnscJeagc
sh
LRP-CR6-7 (SEQ ID NO 13)
tcfpllciftcnngrcininwrcdndPidcgcinsdeagcshscsstqfkcnsgrcipehwtcdgdncJcgclysclet-han
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LRP-CR6 (SEQ ID NO 14)
tcfpttqftcnogrcininwrcdndndcgcJfisdeagcBli SC 抗 GPIIIa-I-HC-LC (SEQ ID NO 15)mdilmi<isp$$rri$vslgdtv$itchascigissiiigwlciqkpgksfmg!iyygifilvdgvpsrfs§sgsgacjy$ltissl
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接头-SC 抗 GPIIIa-I-HC-LC (SEQ ID NO 16)
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dsedfadyycyqyaqlpylfgggtkleklggggsggggsggggsnsvcilqqsgaelMkpgasvklsctasgfnikdlyvNwvkq rpeqglewigridpangytkydpkfqgkatiiaclissntaylqlssllsedlavyycvrplydyyanidywgqglsvtvssggggsg
gggsggggs
SC 抗 GPIIIa-2-HC-LC (SEQ ID NO 17)
qvqlqqsgaelvrpgtsvksckasgytflnywlgwvkqrpglhgtewigdiyf^gfynkynenfkgkattladtssst
Qymqlssitsedsavyfcareygnydlyanidswgqgtsvtvssggggsggggsggggsdivmtqaapsvpvtpgesvsiscr
ssrsllhsrtgfltjioivflqrpgcispqlliyrnisnlasgvpdffsgsgsgfaflliisfveauclvgvyyemcihleypftfgsgtlctoikr
SC 抗 GPIIIa-2-LC-HC (SEQ ID NO 18)
diviiilqaapsvpvlp§esysiscrssrsllbsngntylcwflqrpgqspqlliyrmsr>tasgvpdrfsgsgsgtafllrisf
veaedvgvyycmqhleypflfgsglkteikrggggsggggsggggsqvqfqqsgaelvrpgtsvkisckasgylfinywlgwvk
Qrpghglewigdiypggg^nkynenfkglcalltadtssstayoiqlssitsedsavyfGareygnydyamdswgqglsvtvss
ABD035 (SEQ ID NO 19)
Iaealc vlanreicJkygvscffykrlinkakivegvealWhilaalp
序列 A (SEQ ID NO 20)
GSPAGSFFSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPWrEEGTSTEPS
EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSP
TSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSE
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GTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPASSPTSTEEGSPAGSPTSTEE
GSPAGSPTSTEEGTSESAIPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETP
GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSFTSTEE
GTSESATPESGPGSEPATSGSETF-GTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG-SPTSTEE
GTSTCPSEGSAPGTSESATPESGP-G 丁 SESAIPESGPGTSESATreSGPGSEfWTSGSETP
GSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTS1EPSEGSAFGTSTEPSEGSAPGSEPA1SGSETP
GTSESMPESGPGTSTEPSEGSAPG
ELP80 (SEQ ID NO 21)gvpgvgvpfggvpgvgvf^vgvpgagvpgvgvpgggvpgvgvj^vgvpgagvpgvgvpgggvpgvgvpgv gvf^agvpgvgvpgggvpgvgvpgvgvpgagvpgvgvpgggvpgvgvpgvgvpgagvpgvgvp^ggvpgv gvpgvgvpgagvpgvgv^ggvpgvgvpgvgvpgagvpgvgvpgggvpgvgvpgvgvpgagvpg ^gvpgg gvpgvgvpgvgvpgagvpgvgvpgggvpgvgvpgvgvpgsgvpgvgv^ggvpgvgvpgvgvpgagvpgv gvpgggvrevgvpgvgvpgagvpgvgvpgggvpgvgvpgvgvpgagvpgvgvpgggvpgvgvpgvgvpga gvpgvgvpgggvpgvgvpgvgvpgagvpgvgvpgggvpgvgvpgvgvpga
额外的 a3 (SEQ ID NO 22)
eiirtilqsdqeaidyddiisvemttedfdiycleclenqspr
GHBP (SEQ ID NO 23)
fsgsealaatlsrap^slqsvnpgtktnsskepkftkcrspefetfschwtdevhtiglknlgpiqlfytrmlqewlqew
kecpdyvsagePSGyfnssflsiwipycikltsnggtvdekGfsvdeivqpcJppisinwlllnvsllgihadiqvrweapmadliqkg
wmvteplciykevnetkwlcmmcJpiiiisvpvyslkvdkeyevivfslcqmsgnygefsevlyvtlpqmsci
FIX298-342 (SEQ ID NO 24)
iflkfgsgyvsgwarvfhkgrsatviqylrvplvdratclrstkf
FIX47-125 (SEQ ID NO 25)
DdgclqGesnpclnggsckddinsyecwcpfgfegkricetdvtcnikngrceqfcknsadnkwcsctegyrfaen
qksce
vWFl-272 (SEQ ID NO 26)
slscrpprtwlclvcpaclnlraeglecilcicqnycltecms-mgcvsgclcppgmvrfieorcvaJercpcfliqglkeyaip getvkigcntcvcrclrtwnctdlivcdatcstigmahyWdgikyifpgecqyvlvqcJycgsopgtfriiv'gnkgcslipsvkcklirvti IveggeielfdgevnvkrpmkdelhfewesgryiilllgkalswwdrhlsiswfkqtyqekvGglcgofd gicifindltssnIqvee dpvdfgn swkvssq ca-dtr
vWFl-1390 (SEQ ID NO 27)
slscrppm^klvcpadnlraeglectktcqnydlecmsmgcvsgcteppgmvrhenrcvafercpcfhqgtejfap
geivkigcnicvcrcfrkwnctdhvcdstcsligmahyltfdglkylfpgecqyvlvqdycgsnpglfrMvgnkgcslipsvlcckicrvli
tveggeielfdgevnvkrprnkcJethfevvesg^iilllgkalsvwciriilsiswlkqiycie^vcgicgnfdgiqnnditssnlqvee
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ellqte^dpedcpvcevagrrfasgkkvtlnpsdpehcqidicdvvnltceaGqepgglvvpptclapvsplllyvediseppUhdf
权利要求
1.一种与融合配偶体融合的FVIII分子，其中所述融合配偶体置换因子VIII分子的A3结构域。
2.权利要求I的分子，其中所述融合配偶体是白蛋白。
3.权利要求2的分子，其中所述分子与侧基缀合。
4.一种与融合配偶体融合的FVIII分子，其中所述融合配偶体插入因子VIII的B结构域中。
5.一种与融合配偶体融合的FVIII分子，其中所述融合配偶体插入到因子FVIII的C2结构域的C-末端。
6.权利要求5的FVIII分子，其中所述FVIII分子是B结构域截短的变体，所述变体包含具有SEQ ID NO 2所示序列的B结构域，其中所述融合配偶体是Fe结构域。
7.权利要求6的分子，其中所述Fe结构域是具有降低的效应子功能和/或增加的对新生儿Fe受体的亲和力的突变Fe结构域。
8.权利要求1、4或5中任一项的分子，其中所述因子VIII分子与Fe受体融合。
9.权利要求8的分子，其中所述Fe受体是FeY RI。
10.权利要求1-9中任一项的分子，其中所述因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。
11.权利要求1-10中任一项的分子，其中所述FVIII融合蛋白与侧基缀合。
12.权利要求11的分子，其中所述侧基选自以下列出的一种或多种亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。
13.权利要求1-12中任一项的分子的制备方法，其中所述方法包括在合适条件下温育编码所述分子的宿主细胞。
14.权利要求1-12中任一项的分子在治疗血友病中的用途。
15.一种包含权利要求1-12中任一项的分子的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及经修饰的凝血因子。具体地讲，本发明涉及缀合的因子VIII分子，所述因子VIII分子与诸如抗体结合蛋白或Fc结构域等多肽融合。
文档编号C07K14/755GK102770450SQ201180009864
公开日2012年11月7日 申请日期2011年2月10日 优先权日2010年2月16日
发明者G.博尔特, K.克杰加尔德, P.L.诺尔比 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司