基于avl9的癌症的诊断及治疗的制作方法

专利名称：基于avl9的癌症的诊断及治疗的制作方法
基于AVL9的癌症的诊断及治疗本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽(刺激抗肿瘤免疫应答疫苗复合物的活性药物成分)联合使用的由CD8+T细胞识别的肿瘤相关表位。本发明涉及33种新型肽序列及其变体，它们源自可用于引发抗肿瘤免疫应答的疫苗组合物中的人肿瘤HLA-I类分子，尤其是细胞毒性T细胞免疫应答。
背景技术：
胃癌是恶性细胞在胃壁形成的一种疾病。胃癌可发生于胃部的任何部分，可能扩散到整个胃部以及其他器官；尤其是食道、肺和肝脏。胃癌是全球第四最常见的癌症，2002年有93万确诊病例。胃癌具有高死亡率(每年 80万)，使之成为全球仅次于肺癌导致癌症死亡的第二大最常见原因。此病较常见于男性，更常见于亚洲国家和发展中国家。(http://www. who. int/mediacentre/factsheets/fs297/en/.)
在美国，胃癌约占每年所有新发癌症病例的2% (25500例)，但在其他国家更常见。在韩国，胃癌是位于第一位的癌症，占恶性肿瘤的20. 8%。在日本，胃癌仍是男性最常见的癌症。在美国，每年约有8000名男性和13000女性被诊断患有胃癌。大部分患者为70岁以上。胃癌是全球第四大常见癌症，仅次于肺癌、乳腺癌、结肠癌和直肠癌。此外，胃癌仍是第二大最常见癌症死因。据美国癌症协会估计，2007年有一百万新发病例，其中近70%发生在发展中国家，大约 80 万例死亡。(http://www. cancer, org/downloads/STT/Global_Facts_and_Figures_2007_rev2. pdf.)此疾病的全球发病率中存在巨大的地域差异。该疾病的发病率在亚洲和南美洲部分地区最高，在北美最低。根据记录，该疾病的死亡率在智利、日本、南美和前苏联最高。除了日本通常进行早期检测外(在韩国以有限的方式进行)，世界大部分地区均不进行筛查，因此，胃癌在得到确诊时通常已为晚期。因而，胃癌仍然对医疗保健专业人士带来重大挑战。胃癌的危险因素为幽门螺杆菌OLpylori)感染、吸烟、摄入高量盐分、以及其他饮食因素。少数胃癌(1%至3%)与胃癌遗传易感性症候群相关。在弥漫型胃癌常染色体显性遗传易感性家族中，大约25%发生上皮钙黏蛋白基因突变。这一亚群胃癌被称为遗传性弥漫性胃癌。12提供遗传咨询，并考虑在种系截断的年轻无症状携带者中进行预防性胃切除术可能是有益的。胃壁由3层组织组成粘膜(最内)层、肌(中间)层和浆膜(最外)层。胃癌首先发生于粘膜层内壁，随着生长而扩散至外层。有四种标准治疗方法可治疗胃癌。胃癌治疗方法包括手术、化疗、放疗或放化疗。手术是胃癌的主要治疗方法。手术的目的是进行完全切除，并使切缘为阴性(R0切除)。但是，大约有50%局部胃癌不能进行RO切除。Rl切除表示在显微镜下可发现残留癌细胞(切缘阳性)，R2切除表示有肉眼可见的残留癌细胞，但疾病未向远处转移。患者结果取决于诊断时发现的最初期别(NCCN肿瘤学临床实践指南 )。对于II期疾病的患者，治疗性手术切除后的5年生存率为30-50%，III期患者为10-25%。这些患者局部及全身复发的可能性极高。80-90%的胃癌患者均会发生转移，在较早期别得到确诊的患者中6个月生存率为65%，而在较晚期确诊的患者中不到15%。因此，仍然需要对以下癌症患者实施安全有效、并且在不使用化疗药物或可能导致严重副作用的药物即可提升患者健康的新型治疗方案胃癌、摄护腺(上皮)癌、口腔癌、口腔鳞状细胞癌(OSCC)、急性髓性白血病(AML)、幽门螺旋杆菌引起的MALT淋巴瘤、结肠(上皮)癌/结直肠癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、宫颈(上皮)癌、人乳腺癌、摄护腺癌、结肠癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肝癌、不同表型的脑肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)等白血病、肺癌、尤因氏肉瘤、子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌、喉上皮癌、食管癌、口腔(上皮)癌、膀胱癌、卵巢(上皮)癌、肾细胞癌、非典型脑膜瘤、乳头状甲状腺癌、脑肿瘤、涎腺导管癌、宫颈癌、结外型T/NK细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌和乳腺癌等恶性实体瘤、以及其他肿瘤。本发明采用刺激免疫系统的肽以一种无创方式作为抗肿瘤制剂
发明内容
是否能刺激免疫应答取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现肿瘤相关抗原的存在增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。对于癌症免疫疗法，目前正在探索各种利用免疫系统的体液和细胞免疫作用的机制，用于癌症免疫治疗。细胞免疫应答的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的细胞毒性T-细胞(CTL)表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是⑶8阳性T细胞CTCD8+)在这种反应中发挥重要作用，T⑶8+能识别通常8至10个源自蛋白或位于细胞质的缺损核糖体产物(DRIP)的氨基酸残基的主要组织兼容性复合体(MHC)所载的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。MHC分子有两类大部分有细胞核的细胞上都可发现的MHC-I类分子。MHC分子分别由一条α重链和β_2-微球蛋白(MHC-I类受体)或α和β链(MHC-II类受体)组成。其三维构造形成一个结合槽，用于与肽进行非共价相互作用。MHCI类分子提呈的肽主要为内源性的蛋白、DRIPS和较大肽裂解生成的。MHC II类分子主要发现于专业抗原提呈细胞(APC)上，它们主要提呈在内吞作用过程中由APC占据且随后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。肽和MHC I类分子的复合体由负载相应T细胞受体(TCR)的CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞进行识别，而肽和MHC II类分子的复合体由负载相应TCR的CD4阳性辅助T细胞进行识别。本领域已熟知其中的TCR、肽和MHC按1:1:1的化学计量比例而存在。对于引发细胞免疫应答的肽，它必须与MHC分子结合。这一过程依赖于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异性多态性。MHC-I类-结合肽的长度通常为8-12个氨基酸残基，并且在其与MHC分子相应结合沟槽相互作用的序列中通常包含两个保守残基(「锚」)。这样，每个MHC的等位基因都有「结合基序」，从而确定哪些肽能与结合沟槽特异性
彡口口 在MHC-I类依赖性免疫应答中，肽不仅能与肿瘤细胞表达的某些MHC-I类分子结合，而且它们还必须能被带有T细胞特异性受体的T细胞(TCR)识别。肿瘤特异性CTL所识别的抗原，即它们的表位，可以是源自所有蛋白类型的分子，如酶、受体、转录因子等，它们在相应肿瘤的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达上调。
目前将肿瘤相关肽分类为以下主要几组a)癌-睾丸抗原T细胞能够识别的最先确认的TAA属于这一类抗原，由于其成员表达于组织学相异的人肿瘤中、正常组织中、仅在睾丸的精母细胞/精原细胞中、偶尔在胎盘中，因此，它最初被称为癌-睾丸(CT)抗原。由于睾丸细胞不表达HLA I类和II类分子，所以，在正常组织中，这些抗原不能被T细胞识别，因此在免疫学上可考虑为具有肿瘤特异性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成员或NY-ES0-1。b)分化抗原肿瘤和正常组织(肿瘤源自该组织)都含有TAA，大多数TAA发现于黑色素瘤和正常黑色素细胞中。许多此类黑色素细胞谱系相关蛋白参与黑色素的生物合成，因此这些蛋白不具有肿瘤特异性，但是仍然被广泛用于癌症的免疫治疗。实例包括，但不仅限于，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-Ι或摄护腺癌的PSA。c)过量表达的TAA :在组织学相异的肿瘤中以及许多正常组织中都检测到了基因编码被广泛表达的TAA，一般表达水平较低。有可能许多由正常组织加工和潜在提呈的表位低于T细胞识别的阈值水平，而它们在肿瘤细胞中的过量表达能够透过打破先前确立的耐··受性而引发抗癌反应。这类TAA的典型实例为Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1。d)肿瘤特异性抗原这些独特的TAA产生于正常基因(如联蛋白XDK4等)的突变。这些分子变化中有一些与致瘤性转化和/或进展相关。肿瘤特异性抗原一般可在不对正常组织带来自体免疫应答风险的情况下诱导很强的免疫应答。另一方面，这些TAA在多数情况下只与其上确认了有TAA的确切肿瘤相关，并且通常在许多个体肿瘤之间并非共享 ΤΑΑ。e)由异常转译后修饰产生的TAA :此类TAA可能由肿瘤中既不具有特异性也不过量表达的蛋白产生，但其仍然具有肿瘤相关性(该相关性由主要对肿瘤具有活性的转译后加工所致)。此类TAA产生于变糖基化模式的改变，导致肿瘤产生针对MUCl的新型表位或在降解过程中导致诸如蛋白拼接的事件，这可能具有也可能不具有肿瘤特异性。f)肿瘤病毒蛋白这些TTA是病毒蛋白，可在致癌过程中发挥关键作用，并且由于它们是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能够激发T细胞应答。这类蛋白的例子有人乳头状瘤16型病毒蛋白、E6和E7，它们在宫颈癌中表达。对于被细胞毒性T淋巴细胞识别为肿瘤特异性抗原或相关性抗原以及用于治疗的蛋白质，必须具备特殊的先决条件。该抗原应主要由肿瘤细胞表达，而不由正常健康组织表达，或表达数量相对较少。更为适宜的情况是，该相应抗原不仅出现于一种肿瘤中，而且浓度(即每个细胞的相应肽拷贝数目)高。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原往往是源自直接参与因细胞周期控制或凋亡抑制中的一项功能而发生的正常细胞向肿瘤细胞转化的蛋白。另外，这些直接导致转化事件的蛋白的下游靶标可能会被上调，因此可能与肿瘤间接相关。这些肿瘤间接相关抗原也可能是预防接种方法的祀标(Singh-Jasuja H. , EmmerichN. P. , Rammensee H. G. , Cancer Tmmunol. Immunother. 2004 Mar; 453 (3) : 187-95)。在这两种情况中，至关重要的是，都要存在抗原氨基酸序列的表位，所以这种来自肿瘤相关抗原的肽(「免疫原性肽」)可导致体外或体内T细胞应答。基本上，任何能与MHC分子结合的肽都可能充当一个T细胞表位。诱导体外或体内T细胞应答的前提是存在具有相应TCR的T细胞并且不存在对该特定表位的免疫耐受性。因此，TAA是研发肿瘤疫苗的起点。识别和表征TAA的方法基于可从患者或健康受试者分离出来的CTL的使用情况，或基于肿瘤与正常组织肽之间差别转录特性或差别表达模式的产生。然而，对肿瘤组织或人肿瘤细胞株中过量表达或选择性表达的基因的识别并不提供在免疫疗法中使用这些基因所转录抗原的准确信息。这是因为，有着相应TCR的T细胞必须要存在而且对这个特定表位的免疫耐受性必须不存在或为最低水平，因此，这些抗原的表位只有一部分适合这种应用。因此，只选择那些蛋白过量表达或选择性表达的肽，并且这些肽是与可找到对抗性功能性T细胞的MHC分子结合在一起被提呈，这一点非常重要。这种功能性T细胞被定义为在以特异性抗原刺激后能够克隆地扩展并能够执行效应子功能的T细胞(「效应子T细胞」)。辅助T细胞在编排抗肿瘤免疫的CTL效应子功能中发挥着重要作用。触发Tm细胞应答的辅助T细胞表位支援CD8阳性杀伤T细胞的效应子功能，其中包括直接作用于肿瘤细胞的细胞毒性功能(该类肿瘤细胞表面显示有肿瘤相关肽/MHC复合体)。这样，单独形式的或与其他肿瘤相关肽形成组合物的肿瘤相关T辅助细胞肽表位可作为刺激抗肿瘤免 疫应答疫苗组合物的活性药物成分。


图I :证实CDC2-001提呈于原发性肿瘤样本GC2464的代表性质谱。NanoESI-LCMS在从GC样本2464中洗脱所得的肽库上进行。质量色谱m/z597. 3501±0. OOlDa、z=2显示肽在保留时间151. 63分钟时达到峰值。B)质量色谱中在151. 63分钟时检测到峰值显示，信号在MS谱中为m/z 597.3501。C) nanoESI_LCMS实验中指定保留时间时所记录的选定前体的碰撞诱导衰变质谱为m/z597. 3501，证实了 GC2464肿瘤样本中提呈CDC2-001。D)合成CDC2-001参考肽的破碎模式进行了记录，并且与C所示的自然TUMAP破碎模式以验证序列。图2 :选定蛋白的mRNA在正常组织和25份胃癌样本中的表达谱a)CDC2(Probeset ID:203213_at)b)ASPM(Probeset ID:219918_s_at)图3 :I类TUMAP肽特异性体外免疫原性的典型结果。CD8+T细胞用分别载有相关(左图)和不相关肽(右图)的人工抗原提呈细胞引入。经过3个周期的刺激后，用相关和不相关的A*2402-多聚体二重染色法对肽反应性细胞进行检测。所示细胞在活CD8+淋巴细胞上得到门控，图中数字代表多聚体阳性细胞的百分比。
具体实施例方式除非另有说明，否则本文使用的所有术语定义如下。本文所用「肽」这一术语，系指一系列氨基酸残基，通常以α-氨基酸与相邻氨基酸的羰基团之间的肽键相互连接。这些肽的长度优选为9个氨基酸，但至短可为8个氨基酸长度，最长可为10、11、12、13或14个氨基酸长度。本文使用的术语「寡肽」是指一系列氨基酸残基，通常以α -氨基酸与相邻氨基酸的羰基团之间的肽键相互连接。寡肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要在寡肽中保持正确的表位即可。通常，寡肽长度约小于30个氨基酸残基，约长于14个氨基酸。
「多肽」这一术语是指一系列氨基酸残基，通常以α -氨基酸与相邻氨基酸的羰基团之间的肽键相互连接。多肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要保持正确的表位即可。与术语肽或寡肽相对，「多肽」这一术语是指包含多于约30个氨基酸残基的分子。一种肽、寡肽、蛋白质或编码该分子的核苷酸如果能诱导免疫应答，则具有「免疫原性」(因此是本发明中的一种「免疫原」)。在本发明的场合，免疫原性的更具体定义是诱导T细胞应答的能力。因此，「免疫原」是一种能够诱导免疫应答的分子，并且在本发明的情况下，是一种能诱导T细胞应答的分子。T细胞「表位」要求的是一种结合至MHC I类受体上的短肽，从而形成一种三元复合体(MHC I类α链、β-2-微球蛋白和肽)，其可由载有以相应亲和力结合至MHC/肽复合体的匹配T细胞受体的一种T细胞进行识别。结合至MHC I类分子的肽的典型长度为8-14个氨基酸，最典型为9个氨基酸长度。
在人类中，有三种编码MHC I类分子的不同基因位点(人MHC分子也是指定的人白细胞抗原(HLA) ) HLA-A, HLA-B 和 HLA-C。HLA_A*01、HLA_A*02 和 HLA_A*024 是可从这些基因位点表达的不同MHC I类等位基因的实例。表I :HLA-A*024和最常见HLA*A02402血清类型的表达频率F。频率根据Mori等人(Mori et al. 1017-27)使用的 Hardy-Weinberg 公式 F=I-(I-Gf) 2 改编,从美国人群范围内的单体型频率中推导出。有关详细信息，请参阅Chanock等人的文献(Chanock etal. 1211-23)。全球血清型HLA*24和A*2402的表达频率等位基園人群根*等位*因频率算得的显型
A*24菲律宾人65%
A*24俄穸斯iM況茨人61%
A#2402H 本人59%
A*24马来两亚人58%
A*2402革律宾人54%
A*24印度人47%Α*24韩 I.Kl 人40%
Α*24斯1Ht 卡人37%
Α*24屮 W 人32%
Α*2402[丨度人29%
A*24澳人.利#.西部人22%
A *24划1=:| 人22%
A*24俄罗斯萨4拉人20%
Α*24痛) 人20%
Α*24 欧洲人W%本文提到的DNA序列既包括单链DNA也包括双链DNA。因此，除非本文另有所指，否则具体的序列是该序列的单链DNA、该序列与其互补序列的双工(双链DNA)以及该序列的互补序列。「编码区」这一术语是指在基因的天然基因组环境中天然或正常编码该基因的表达产物的那部分基因，即，体内编码该基因的天然表达产物的区域。编码区可来自非突变(「正常」)基因、突变基因或异常基因，甚至还可以来自DNA序列，完全可在实验室中使用本领域熟知的DNA合成方法合成。术语「核苷酸序列」系指脱氧核苷酸的杂聚物。编码特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可为天然核苷酸序列，也可为合成核苷酸序列。一般来说，编码肽、多肽以及本发明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸衔接物，或一系列寡核苷酸组成，以提供一种合成基因，该基因能够在包含源自微生物或病毒操纵子的调节元素的重组转录单元中被表达。「表达产物」这一术语是指多肽或蛋白，它是基因和遗传码退化并因而编码同样的氨基酸所造成的任何核酸序列编码同等物的转译产物。「片断」这一术语，当指的是一种编码序列时，表示包含非完整编码区的DNA的一部分，其表达产物与完整编码区表达产物基本上具有相同的生物学功能或活性。「DNA片段」这一术语是指一种DNA聚合物，以单独的片段形式或一种较大DNA结构的组分形式存在，它们从至少分离过一次的DNA中以基本纯净的形式获得，即不含污染性内源性材料，并且获得的数量或浓度能够使用标准生化方法，例如使用克隆载体，进行识另|J、操纵和回收该片段及其组分核苷酸序列。此等片段以开放阅读框架(未被内部未转译序列打断)或内含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。未转译DNA序列可能存在于开放阅读框架的下游，在那里其不会干预编码区的操纵或表达。「引物」这一术语表示一种短核酸序列，其可与一个DNA链配对，并在DNA聚合酶开始合成脱氧核糖核酸链之处提供一个游离的3' -OH末端。「启动子」这一术语表示参与RNA聚合酶的结合从而启动转录的DNA区域。术语「分离」表示一种物质从其原来的环境(例如，如果是天然发生的则是天然环境)中被移走。例如，活体动物中的天然核苷酸或多肽不是分离的，但是，从天然系统中一些或所有共存物质中分离出来的核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可能是载体的一部分和/或此类多核苷酸和多肽可能是一种组合物的一部分，并且由于该载体或组合物不是其天然环境的一部分，因此它仍然是分离的。
本发明中披露的多核苷酸和重组或免疫原性多肽也可能以「纯化」的形式存在。术语「纯化」并非要求绝对的纯度；它只是一个相对的定义，可以包括高度纯化或部分纯化的制剂，相关领域技术人员能理解这些术语。例如，各个从已用传统方法纯化为具有电泳同质性的cDNA库中分离出的各种克隆物。明确考虑到将起始材料或天然物质纯化至少一个数量级，优选为两或三个数量级，更优选为四或五个数量级。此外，明确考虑到所述多肽的纯度优选为99. 999%，或至少为99. 99%或99. 9% ;更适宜者为以重量计99%或更高。根据本发明公开的核酸和多肽表达产物，以及包含此类核酸和/或多肽的表达载体可能以「浓缩的形式」存在。本文使用的术语「浓缩」是指材料的浓度至少是其自然浓度的大约2、5、10、100或1000倍，有优势的是，按重量计为O. 01%，优选为至少O. 1%。也考虑了按重量计约为O. 5%、1%、5%、10%和20%的浓缩制剂。序列、构型、载体、克隆物以及包含本发明的其他材料可有优势地以浓缩或分离的形式存在。「活性片段」这一术语是指产生免疫应答的片段(即具有免疫原性活性)，不论是单独或可选地与合适的佐剂一起给予一种动物，比如哺乳动物，例如兔子或小鼠，也包括人；这种免疫应答采用的形式是在接受动物(如人)体内刺激T细胞应答。或者，「活性片段」也可用于诱导体外T细胞应答。本文使用的「部分」(portion)、「节段」(segment)、「片段」(fragment)这几个术语，当与多肽相关地使用时是指残基的连续序列，比如氨基酸残基，其序列形成一个较大序列的子集。例如，如果一个多肽以任一种肽链内切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)进行处理，则该处理获得的寡肽会代表起始多肽的部分、节段或片段。这表示，任何此类片段必定包含与SEQ ID NO: I至33序列基本相同(如果不是完全相同)的一个节段、片段或部分作为其氨基酸序列的一部分，其对应于SEQ ID NO: I至33的天然蛋白或「亲本」蛋白。当与多核苷酸相关地使用时，这些术语系指用任何共同核酸内切酶处理所述多核苷酸产生的产物。根据本发明，术语「百分等同度」或「百分等同性」，如果指的是序列，则表示在待对比序列(「被对比序列」)与所述序列或权利要求的序列(「参考序列」)对准之后将被对比序列与所述序列或权利要求的序列进行比较。然后根据下列公式计算百分等同度百分等同度=100[I-(C/R)]其中C是参考序列与被对比序列之间对准长度上参考序列与被对比序列之间的
差异数量，其中
(i)参考序列中每个硷基或氨基酸序列在被对比序列中没有对应的对准硷基或氨
基酸；(ii)参考序列中每个空隙，以及(iii)参考序列中每个对准硷基或氨基酸与被比对比序列中对准硷基或氨基酸不同，即构成一个差异；并且R是参考序列与被对比序列对准长度上在参考序列中产生任何空隙也计算为一个硷基或氨基酸的参考序列中的硷基或氨基酸数目。如果「被对比序列」和「参考序列」之间存在的一个对准按上述计算的百分等同度大致等于或大于指定的最低百分等同度，则被对比序列与参考序列具有指定的最低百分等同度，虽然可能存在按本文上述计算的百分等同度低于指定百分等同度的对准。如果没有另外说明，那么本文公开的原始肽可以透过在肽链内的不同(可能为选择性)位点上取代一个或多个残基而被修饰。此取代可能是保守性的，例如，其中一个氨基 酸被具有类似结构和特点的另一个氨基酸所取代，比如其中一个疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或类似的大小和化学性质的氨基酸间的取代，例如，亮氨酸被异亮氨酸取代。在天然同源蛋白质家族序列变异的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，这些氨基酸往往表现出与原氨基酸的大小、电荷、极性和疏水性之间的相似性相关，这是确定「保守取代」的基础。在本文中，保守取代定义为在以下五种基团之一的内部进行交换基团I-小脂肪族、非极性或略具极性的残基(Ala，Ser, Thr, Pro, Gly);基团2-极性、带负电荷的残基及其酰胺(Asp, Asn, Glu, Gln);基团3-极性、带正电荷的残基(His, Arg, Lys);基团4-大脂肪族非极性残基(Met, Leu, He, Val, Cys)以及基团5_大芳香残基(Phe, Tyr, Trp)。较不保守的取代可能涉及一个氨基酸被另一个具有类似特点但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如丙氨酸被异亮氨酸残基取代。高度不保守的取代可能涉及一个酸性氨基酸被另一个具有极性或甚至具有碱性性质的氨基酸所取代。然而，这种「激进」取代不能认为是无效的而不予考虑，因为化学作用是不完全可预测的，激进的取代可能会带来其简单化学原理中无法预见的偶然效果。当然，这种取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其他结构。因此，D-氨基酸可能被本发明的抗原肽中常见的L-氨基酸取代，也仍在本公开的范围之内。此外，具有非标准R基团的氨基酸(即，除了天然蛋白的20个常见氨基酸之外的R基团)也可以用于取代之目的，以生产根据本发明的免疫原和免疫原性多肽。如果在一个以上位置上的取代发现导致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定义值，则对这些取代的组合进行测试，以确定组合的取代是否产生对肽抗原性的叠加或协同效应。肽内被同时取代的位置最多不能超过4个。术语「T细胞应答」是指由一种肽在体外或体内诱导的效应子功能的特异性扩散和启动。对于MHC I类限制性CTL，效应子功能可能为溶解肽脉冲的、肽前体脉冲的或天然肽提呈的靶细胞、分泌细胞因子，优选为肽诱导的干扰素- Y、TNF-α或IL-2，分泌效应分子、优选为肽或脱颗粒作用诱导的颗粒酶或穿孔素。优选情况是，当SEQ ID NO: I至33任何序列的肽特异性CTL相比于取代肽受到检测时，如果取代肽在相对于背景肽溶解度增加达到最大值的一半，则该肽浓度不超过约ImM，优选为不超过约I μ M,更优选为不超过约InM,再优选为不超过约IOOpM,最优选为不超过约ΙΟρΜ。另一个优选的情形为，取代肽被一个以上的CTL识别，最少为2个，更优选为3个。因此，本发明所述的表位可能与天然肿瘤相关表位或肿瘤特异性表位相同，也可能包括来自参考肽的不超过4个残基的不同肽，只要它们有基本相同的抗原活性即可。免疫治疗方法是否能刺激免疫应答取决于是否存在被宿主免疫系统视为异物的抗原。发现肿瘤相关抗原的存在增加了运用宿主免疫系统干预肿瘤生长的可能性。对于癌症免疫疗法，目前正在探索控制免疫系统中的体液和细胞免疫的各种机制。细胞免疫应答的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的细胞毒性T-细胞(CTL)表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是⑶8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，它能识别通常8至12个源自蛋白或位于细胞质的缺损核糖体产物(DRIP)的氨基酸残基的主要组织兼容性复合体 (MHC)所带有的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。MHC-I类分子，在细胞核提呈因主要内源性、细胞质或细胞核蛋白质、DRIPS和较大肽蛋白裂解产生的肽的细胞上都能发现此类分子。然而，源自内体结构或外源性来源的肽也经常在MHC-I类分子上发现。这种I-类分子非经典提呈方式在文献中被称为交叉提
Mo对于被细胞毒性T淋巴细胞识别为肿瘤特异性抗原或相关性抗原以及用于治疗的蛋白质，必须具备特殊的先决条件。该抗原应主要由肿瘤细胞表达，而正常健康组织根本不表达或表达数量较少。更为适宜的情况是，该相应抗原不仅出现于一种肿瘤中，而且浓度(即每个细胞的相应肽拷贝数目)高。肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原通常是源于由于细胞周期调控或凋亡等功能在正常细胞转化为肿瘤细胞中直接涉及的蛋白。另外，这些直接导致转化的蛋白的下游靶标也可能会被上调，因此间接与肿瘤相关。这些间接肿瘤相关抗原也可能是预防接种方法的靶标。至关重要的是，在这两种情况中，都存在抗原氨基酸序列的表位，所以这种来自肿瘤相关抗原的肽(「免疫原性肽」)可导致体外或体内T细胞应答。基本上，任何能与MHC分子结合的肽都可能充当一个T细胞表位。诱导体外或体内T细胞应答的前提是存在具有相应TCR的T细胞并且不存在对该特定表位的免疫耐受性。因此，TAA是研发肿瘤疫苗的起点。识别和表征TAA的方法基于对患者或健康受试者CTL的使用情况，或基于肿瘤与正常组织肽之间差别转录特性或差别表达模式的产生(Lemmel et al. 450-54;Weinschenk et al. 5818-27)。然而，对肿瘤组织或人肿瘤细胞株中过量表达或选择性表达的基因的识别并不提供在免疫疗法中使用这些基因所转录抗原的准确信息。这是因为，有着相应TCR的T细胞必须存在且对这个特定表位的免疫耐受性必须不存在或为最低水平，因此，这些抗原的表位只有一部分适合这种应用。因此，只选择那些蛋白过量表达或选择性表达的肽，并且这些肽是与可找到对抗性功能性T细胞的MHC分子结合在一起被提呈，这一点非常重要。这种功能性T细胞被定义为在以特异性抗原刺激后能够克隆地扩展并能够执行效应子功能的T细胞(「效应子T细胞」)。 辅助T细胞在安排抗肿瘤免疫的CTL效应子功能中发挥着重要作用。触发Tm细胞应答的辅助T细胞表位支援CD8阳性杀伤T细胞的效应子功能，其中包括直接作用于肿瘤细胞的细胞毒性功能(该类肿瘤细胞表面显示有肿瘤相关肽/MHC复合体)。这样，肿瘤相关T辅助细胞表位单独使用或与其他肿瘤相关肽结合使用可作为刺激抗肿瘤免疫应答的疫苗化合物的活性药物成分。由于⑶8及⑶4依赖型反应共同和协同促进抗肿瘤作用，因此，⑶8阳性CTL(MHC-I分子)或⑶4阳性CTL (MHC-II类分子)对肿瘤相关抗原的识别和鉴定对研发肿瘤疫苗非常重要。因此，提出含有与任一类MHC复合体结合的肽组合物是本发明的一个目标。考虑到治疗癌症相关的严重副作用和费用，迫切需要更好的预后和诊断方法。因此，通常有必要确定代表癌症生物标志物的其他因子，尤其是胃癌。此外，通常有必要确定可用于治疗癌症的因子，尤其是胃癌。此外，还没有确定的治疗设计，可用于根治性摄护腺切除术后生化性复发的胃癌患者，复发通常是由原发部位残留的肿瘤出现局部晚期肿瘤生长所致。需要能够降低发病率且疗效与现有治疗方法相当的新型治疗方法。
本发明提出了有利于治疗胃癌以及其他过量表达本发明肽的肿瘤肽。这些肽由质谱分析法直接显示出，而由HLA分子自然提呈于人原发性胃癌样本中(请参见实施例I和图I)。衍生肽源基因在胃癌、肾细胞癌、结肠癌、非小细胞肺癌、腺癌、摄护腺癌、良性肿瘤和恶性黑色素瘤中与正常组织相比显示出高度过量表达(请参见实施例2和图2)，这表明这些肽与肿瘤关联程度高，即这些肽大量提呈于肿瘤组织，而不提呈于正常组织。HLA结合肽能够被免疫系统识别，特别是被T淋巴细胞/T细胞识别。T细胞可破坏提呈被识别的HLA/肽复合体的细胞(如提呈衍生肽的胃癌细胞)。本发明的所有与确认平台兼容的肽(见实例3)已被证明具有刺激T细胞应答的能力(参见实例3和图3)。因此，该等肽可用于在患者中产生免疫应答，从而能够杀死肿瘤细胞。患者的免疫应答能够透过直接给予患者所述肽或前体物质(如，加长肽、蛋白或编码这些肽的核酸)，较理想是与加强免疫原性的制剂相结合，而进行诱导。源自该治疗性疫苗的免疫应答预期能够高度特异性地对抗肿瘤细胞，因为本发明的目标肽在正常组织上提呈的复制数目较少，防止患者发生对抗正常细胞的不良自体免疫应答的风险。药物组合物包括游离形式或以一种药用盐形式存在的肽。此处使用的「药用盐」系指所公开的肽的一种衍生物，其中该肽由制被备药剂酸式或碱式盐进行改性。例如，酸式盐采用自由基(通常其中药物的中性形式具有一种中性-NH2基团)透过与合适酸发生反应而制得。适合制备酸盐的酸包括有机酸，如乙酸、丙酸、羟基酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水杨酸等等、以及无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一种肽上提呈的酸性基团的碱式盐制剂使用药用硷基进行制备，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等等。在特别优选的实施例中，药物组合物包括乙酸(醋酸盐)或盐酸(氯化物)形式的肽。本发明的肽除了用于治疗癌症，也可用于诊断。由于肽由胃癌细胞产生，并且已确定这些肽在正常组织中不存在，因此这些肽可用于诊断癌症是否存在。组织切片中含专利申请范围的肽，可有助于病理师诊断癌症。用抗体、质谱或其他本领域内已知的方法检测某些肽可使病理师判断该组织为恶性的、炎症还是一般病变。肽基团的存在使得能对病变组织进行分类或进一步分成子类。对病变标本中肽的检测使得能对免疫系统治疗方法的利益进行判断，特别是如果T-淋巴细胞已知或预计与作用机制有关。MHC表达的缺失是一种机制，充分说明了哪些受感染的恶性细胞逃避了免疫监视。因此，肽的存在表明，分析过的细胞并没有利用这种机制。肽可用于分析淋巴细胞对肽的反应(如T细胞应答)，或抗体对肽或MHC分子络合的肽发生的反应。这些淋巴细胞应答可以作为预后指标，决定是否采取进一步的治疗措施。这些反应也可以用作免疫疗法中的替代指标，旨在以不同方式诱导淋巴细胞应答，如接种蛋白疫苗、核酸、自体材料、淋巴细胞过继转移。基因治疗中，淋巴细胞对肽发生的反应可以在副作用的评估中考虑。淋巴细胞应答监测也可能成为移植疗法随访检查中的一种有价值的工具，如，用于检测移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。
肽可用于生成和研发出针对MHC/肽复合体的特定抗体。这些抗体可用于治疗，将毒素或放射性物质靶向病变组织。这些抗体的另一用途是为了成像之目的(如PET)将放射性核素靶向病变组织。这可有助于检测小转移灶或确定病变组织的大小和准确位置。此外，可用它们在活检样本的基础上验证病理师对癌症的诊断。表2显示了根据本发明的肽、它们各自的SEQ ID NO、以及可能产生这些肽的源蛋白。所有肽均与HLA A*024等位基因结合。表2:本发明中的肽
权利要求
1.一种肽，其包括选自SEQ ID No. I至SEQ ID No. 95群组的一个序列、或与SEQ IDNo. I至SEQ ID No. 95具有80%，优选具有90%，更优选具有95%的同源性的其变体、或诱导与该肽发生T细胞交叉反应的一个变体，其中所述肽不是一种全长多肽。
2.根据权利要求I所述的肽，其中该肽总长度为8至100个氨基酸、优选为8至30个氨基酸，最优选为8至14个氨基酸。
3.根据权利要求I至2中任一项所述的肽，其具有与主要组织兼容性复合体(MHC)I或II类分子结合的能力。
4.根据权利要求I至3中任一项所述的肽，其中该肽系由或基本系由根据SEQID NOI至SEQ ID NO 95所选的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求I至5中任一项所述的肽，其中该肽被修饰和/或包含非肽键。
6.根据权利要求I至5中任一项所述的肽，其中该肽为融合蛋白，特别是含HLA-DR抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸。
7.—种核酸，其编码根据权利要求I至6中任一项所述的肽，如果该肽不是完全人蛋白。
8.根据权利要求7所述的核酸，其可能为DNA、cDNA、PNA、CAN、RNA，也可能为其组合物。
9.根据权利要求7或8所述的一种能表达核酸的表达载体。
10.根据权利要求I至6中任一项所述的一种肽、根据权利要求7或8所述的一种核酸、或根据权利要求9所述的一种表达载体。
11.根据权利要求7或8所述的一种宿主细胞或根据权利要求9所述的一种表达载体。
12.根据权利要求11所述为一种抗原提呈细胞的宿主细胞。
13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其中抗原提呈细胞为树突状细胞。
14.根据权利要求I至6中任一项所述的一种制备肽的方法，该方法包括根据权利要求11所述的培养宿主细胞，从宿主细胞或其培养基中分离出肽。
15.一种体外制备启动的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，该方法包括将CTL与载有抗原的人I或II类MHC分子进行体外连接，这些分子在合适的抗原提呈细胞表面表达足够的一段时间从而以抗原特异性方式启动CTL，其中所述抗原为根据权利要求I至6中任一项所述的肽。
16.根据权利要求15所述的方法，其中抗原透过与足够量的含抗原提成细胞的抗原结合被载入表达于合适抗原提呈细胞表面的I或II类MHC分子。
17.根据权利要求15所述的方法，其中该抗原提呈细胞包括一个表达载体，该载体有能力表达含SEQ ID NO I至SEQ ID NO 95的肽或所述变体氨基酸序列。
18.权利要求15至17中任一项所述的按其方法制成的启动细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，该淋巴细胞会有选择性地识别一种细胞，该细胞异常表达含权利要求I至4中任一项给定氨基酸序列的多肽。
19.一种杀灭患者中祀向细胞的方法,其中祀向细胞异常表达一种多肽,该多肽含权利要求I至4中任一项给定的氨基酸序列；一种给药方法，其中包括给予患者权利要求15定义的有效量细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
20.根据权利要求I至6中任一项所述的一种肽的用途、根据权利要求7或8所述的一种核酸的用途、根据权利要求9所述的一种表达载体的用途、根据权利要求11至13中任一项所述的一种细胞的用途、根据权利要求18所述的一种作为药剂或制造药剂的启动细胞毒性T淋巴细胞的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其中药剂系指一种疫苗。
22.根据权利要求20或21所述的用途，其中药剂有抗癌活性。
23.根据权利要求22所述的用途,其中所述癌细胞为胃癌细胞、胃肠癌细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞或肾癌细胞。
全文摘要
本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽(刺激抗肿瘤免疫应答疫苗复合物的活性药物成分)联合使用的肿瘤相关细胞毒性T辅助细胞(CTL)肽表位。本发明涉及95种新型肽序列及其变体，它们源自可用于引发抗肿瘤免疫应答的疫苗组合物中的人肿瘤HLA-I类分子。
文档编号C07K7/08GK102905721SQ201180014644
公开日2013年1月30日 申请日期2011年3月15日 优先权日2010年3月19日
发明者托尼·怀申克, 延斯·弗里切, 斯特芬·沃尔特, 彼得·莱维卓尔斯奇, 哈普利特·辛格 申请人:伊玛提克斯生物技术有限公司