专利名称：Dr5 结合多肽激动剂的制作方法
DR5结合多肽激动剂
背景技术：
肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)在多种致瘤和转化细胞系中诱导凋亡，对正常细胞具有很小的作用或无作用。已鉴定出至少5个TRAIL受体，其中2个，即DR4 (死亡受体 4，TRAIL-Rl)和 DR5 (死亡受体 5，TRAIL-R2 ；KILLER 或 TRICK 2)能够转导凋亡信号，而另外3个(TRAIL-R3，TRAIL-R4和可溶性0PG)作为诱饵受体来阻断TRAIL介导的凋亡。见例如 Ozoren 和 El-Deiry, Sem. Cancer Bioll3:135 (2003) ;Yagita 等，CancerSci.，95(10) :777(2004)。TRAIL或Apo2L是281个氨基酸的细胞毒性配体，发现其整合入细胞质膜，C端暴露在细胞的胞外表面(II型配体)。还可以检测到少量可溶性TRAIL配体。TRAIL形成同三聚体分子，结合其各自受体，起始信号发放事件级联。
·
TRAIL配体与受体DR4或DR5的结合起始外在细胞死亡途径，导致诱导死亡的信号传递复合物(DISC)的形成，该复合物包含衔接头FADD (Fas激活DD)和胱天蛋白酶原8或胱天蛋白酶原10。DISC上的相互作用和下游级联的激活类似于FAS，导致NF K B和Jun N端激酶途径(JNK)的激活。见例如 Mongkolsapaya 等，Nat. Struct. Biol. , 6(11) : 1048 (1999)；Cha 等，J. Biol. Chem.，275 (40) :31171 (2000)。TRAIL 与 DR4 或 DR5 的结合还导致 BID 切割(通过胱天蛋白酶8或10)、线粒体激活，从而导致内在凋亡途径的激活。TRAIL配体优先诱导肿瘤细胞的凋亡而对正常细胞具有很小的作用或无作用的能力使它成为癌症治疗的潜在良好的候选物。但是，已显示可溶性TRAIL在体外诱导正常人肝细胞的凋亡，突出了潜在的毒性忧虑。见例如Jo等，Nat Med. 6 (5) : 564 (2000) 0癌症治疗的更有利的靶标是DR5。因为DR5需要多个受体来诱导正常肝细胞的凋亡，所以开发针对负责诱导凋亡的具体DR5的激动剂，预测可以避免针对正常细胞的此毒性，同时保留杀死肿瘤细胞的能力。已用DR5的肽和抗体激动剂在表达DR5的细胞中诱导凋亡。见例如Li等，J. Mol.Biol.，361，522-536(2006) ；Kajiwara 等,Biochim. Biophys. Acta 1699:131-137(2004)；Yang等，Cancer Cell，5，501-512 (2004)。DR5的激动剂具有用于癌症治疗中抵抗范围广泛的癌症的潜能。例如，抗DR5的单克隆抗体Lexatumumab在肾细胞癌的小鼠模型中诱导DR5的表达并促进凋亡。Zhang等，Cancer Lett. 251 (I) : 146-57 (2007)。其他抗DR5的激动剂性单克隆抗体，或抗DR5的单链Fv片段，及其杀肿瘤活性也被类似地描述于例如 Takeda 等,Journal Exp. Medicine, 199, 437-448 (2004) ；Guo 等,J. Biol.Chem.，280，41940-41952(2005) ；Motoki 等,Clin.Cancer Res 11 (8):3126-35(2005)；和 Ichikawa 等，Nature Medicine,7，954-960 (2001) ；Chuntharapai 等，J.Immunol. 166(8) :4891-8(2001) ;Shi 等，Cancer Res.，66 (24) : 11946-11953 (2006)中。正在研发多种DR5特异性抗体用于临床，但尚无任何一种获批。据信，为了激活DR5，需要多个交联抗体，在作用部位足量递送这些抗体来达到可再现的疗效仍存在问题。因此，存在对用于治疗相关疾病的改进的DR5特异性激动剂的需要。发明概述
本发明涉及包含本文提供的针对死亡受体5 (本文称为“DR5”)的氨基酸序列的一种或多种“NB剂”，以及涉及包含一个或多个这种氨基酸序列或基本上由一个或多个这种氨基酸序列组成的特异性化合物或构建体，尤其是蛋白质和多肽(也分别称为“化合物”和“多肽”)，及其片段，以及编码这类构建体的核酸。本文提供本发明的DR5特异性构建体的单体变体和多聚体变体。提供NB剂的人源化变体和人工程化(humaneered)变体。在一个实施方案中，本发明的药物相关NB剂作为TRAIL受体DR5的激动剂起作用。本发明还涉及编码这类氨基酸序列和多肽的核酸；用于制备这类氨基酸序列和多肽的方法；表达或能够表达这类氨基酸序列或多肽的宿主细胞；包含这类氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物，尤其是药物组合物；以及这类氨基酸序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的用途，尤其是用于预防、治疗或诊断目的，如本文提到的目的。本文描述为NB剂的TRAIL受体DR5的激动剂具有用于治疗中对抗范围广泛的DR5相关疾病的潜能。因此，本发明的NB剂在增生性疾病的治疗中具有效用，该增生性疾病包括例如，癌症，如实体瘤，原发性和转移性癌症，如肾细胞癌和肺癌(例如小细胞肺 癌“SCLC”和非小细胞肺癌“NSCLC”)，胰腺、造血系统恶性肿瘤，神经胶质瘤，星形细胞瘤，间皮瘤，结肠直肠癌，前列腺癌，骨肉瘤，黑素瘤，淋巴瘤(包括但不限于伯基特淋巴瘤)，乳腺癌，子宫内膜癌，肝癌，胃癌，皮肤癌，卵巢癌和任意来源(例如肺、头和颈、乳腺、甲状腺、子宫颈、皮肤、食管等)的鳞状细胞癌；以及液体癌症，例如白血病(见例如Uno等，NatureMedicine, 12 (6) : 693-698 (2006))，尤其包括T细胞白血病(如急性T细胞白血病(T-ALL))、急性B细胞白血病(B-ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、浆细胞性骨髓瘤和多发性骨髓瘤(丽)。本发明的NB剂在非癌适应症的治疗中也具有效用，该非癌适应症包括炎性和自身免疫性疾病,如系统性红斑性狼疮、桥本病、类风湿性关节炎、移植物抗宿主疾病、干燥综合症、恶性贫血、艾迪生病、硬皮病、肺出血肾炎综合症、克罗恩病、自身免疫性溶血性贫血；不育、重症肌无力、多发性硬化、突眼性甲状腺肿(Basedow’ sdisease);血栓形成性血小板减少症、血小板减少性紫癜、胰岛素依赖性糖尿病、变态反应；哮喘；特应性疾病；动脉硬化；心肌炎；心肌病；肾小球肾炎(globerula nephritis);和再生不良性贫血。本文描述的氨基酸序列和多肽可以针对任意DR5或对任意DR5特异。根据一个非限制性方面，本文所述的氨基酸序列和多肽针对DR5。在一个实施方案中，NB剂特异性结合DR5胞外域。本发明的多肽和组合物可以一般地用于调节DR5。在一个实施方案中，NB剂将触发、激活和/或增加或增强由DR5介导的信号发放。在一个实施方案中，NB剂对DR5的激动作用将调节，尤其是触发或增加，与DR5、其信号发放和/或DR5所涉及的途径相关的生物学机制、反应和效应。在一个实施方案中，本文所述的化合物、多肽和组合物诱导、触发、增加或增强在某些细胞或组织中的凋亡。在一个实施方案中，本文所述的化合物、多肽和组合物能够结合细胞表面上的DR5，尤其是以诱导、触发、增加或增强DR5介导的信号发放这样的方式结合DR5。在一个实施方案中，本文所述的多肽和组合物可以是这样的，它们能够结合DR5从而在其上存在DR5的细胞中触发或诱导凋亡。在一个实施方案中，本文所述的NB化合物、(单价或多价)多肽和组合物可以结合DR5上的TRAIL结合部位。在一个实施方案中，NB剂与TRAIL竞争结合DR5。在一个实施方案中，该化合物和多肽与DR5的结合诱导、触发、增加或增强由DR5介导的信号发放，尤其是在其上存在DR5的细胞中触发或诱导凋亡。本发明的其他方面、实施方案、优势和应用将从本文的进一步描述变得显而易见。附图
简述图I是ELISA实验的图示，显示多价抗-DR5NB剂对TNF受体家族成员的结合。图2是四价抗-DR5 NB剂的肿瘤组织H)(胱天蛋白酶3/7激活)的图示。图3是四价和五价抗-DR5 NB剂在Colo205肿瘤模型中的体内功效的图示。图4A和4B图示11H6四聚体在无(图4A)或有(图4B) CSF-IR抑制剂的情况下在 生长于NSG宿主(即巨噬细胞/NK缺陷宿主)中的MiaPaCa胰腺肿瘤模型中表现出抗肿瘤活性。图5显示11H6四聚体使患者来源的胰腺肿瘤TPAN1-IFA消退的能力，该肿瘤对LCR211 (一种对DR5特异的鼠抗体)不敏感。图6A、6B和6C的图示显示了，对于(图6A ) 11H6三聚体、四聚体和五聚体在Colo205细胞中，(图6B) 4E6和11H6四聚体和五聚体在Colo205细胞中，以及(图6C) 4E6和11H6四聚体和五聚体在H226细胞中，NB构建体中增加的亚基数对应于改善的功效和效力。发明详述本文所述的NB剂(即化合物、多肽(单价或多价)和组合物)结合死亡受体5(“DR5”)。在一个实施方案中，所公开的化合物和多肽与DR5的结合诱导、触发、增加或增强由DR5介导的信号发放，尤其是在其上存在DR5的细胞中触发或诱导凋亡。如本文所使用，本发明的“NB剂”定义为特异性结合DR5多肽且其结合对DR5活性产生激动作用的、包含至少一个CDR3序列的多肽，或编码该多肽的核苷酸。在一个实施方案中，本发明的NB剂是具有Vh结构域的一般结构的多肽。在一个实施方案中，本发明的NB剂是具有Vhh结构域的一般结构的多肽。在一个实施方案中，本发明的NB剂是具有\结构域的一般结构的多肽。在一个实施方案中，除该CDR3序列外，本发明的NB剂还包含至少一个⑶Rl和至少一个⑶R2序列。在一个实施方案中，本发明的NB剂包含至少一个具有下文式I定义的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4构造的单价多肽。在一个实施方案中，本发明的NB剂是单体组合物。在一个实施方案中，NB剂是多聚体组合物。在一个实施方案中，本发明的NB剂是单价组合物。在一个实施方案中，NB剂是多价组合物。在一个实施方案中，构架区包含为用于人而进行了序列优化的残基。下文描述本发明的NB剂的其他方面。术语“NB剂”被用作意在涵盖全部范围的本发明组合物的上位术语，而术语“NB序列”或备选的“NB构建体”在本文中用来指本文作为SEQID N0:l-72、87-88和103-104公开的具体多肽变体和编码它们的核苷酸，包括本文作为SEQ ID NO:96-99明确公开的那些，及与SEQ ID N0:96-99编码相同的多肽序列但因简并密码而不同的那些序列。本发明的NB剂在一个实施方案中，NB剂选自11D1、11H6、10F1、7A12和4E6，或其变体。在一个实施方案中，NB剂是为用于人类而对其序列进行了优化(例如人源化)的变体。在一个实施方案中，人源化NB剂包括但不限于4E6hu和llH6hu的组。在一个实施方案中，NB剂是所列组的单体变体，或其变体。在一个实施方案中，NB剂是所列组的多聚体变体，或其变体。在一个实施方案中，所列组的多聚体变体，或其变体，是单特异性的。在一个实施方案中，所列组的多聚体变体，或其变体，是多特异性的。在一个实施方案中，多特异性NB剂(或其变体)所识别的多个表位是DR5靶标上的多种表位。在一个实施方案中，多特异性NB剂(或其变体)所识别的多个表位是DR5靶标上的至少一个表位和非DR5多肽的靶标上的至少一个表位。在一个实施方案中，NB剂选自 SEQ ID NO: 1_22、26 - 40、87_88 和 103-104，或 SEQID NO: 96-99，或其变体中的一个或多个。NB剂11D1、11H6、10F1、7A12和4E6或其变体的具
体实施方案在下文及表1-4中提供。本发明的示例性NB剂包括以下NB多肽构建体及其变体。
4E6 家族在一个实施方案中，NB剂是4E6，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体是SEQID N0:1的单体，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体是SEQ ID N0:26的单体，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQ ID N0:1的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQID NO:26的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体是包含有效连接的两个或更多个单体的多聚体、或其变体，其中所述两个或更多个单体为SEQ ID NO: I和SEQ IDNO:26单体两者的组合，其中所述单体可以处于任何顺序。在一个实施方案中，4E6多聚体构建体是SEQ ID NO: I的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，4E6多聚体构建体是SEQID NO: 26的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，4E6多聚体构建体是SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:26 二者组合的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体，其中单体可以处于任意顺序。在一个实施方案中，4E6构建体是SEQ ID NO:6-8和27-29的任意一个或多个中提供的多聚体，或其变体。本发明还考虑更高级的多聚体,如由6-10个亚基组成的多聚体。在一个实施方案中，4E6构建体包含SEQ ID N0:64，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体包含SEQ ID N0:65，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体包含SEQ IDNO:42 的 CDRl 序列、SEQ ID NO:52 的 CDR2 序列及 SEQ ID NO:64 和 / 或 SEQ ID NO:65 的任意一个或多个的CDR3序列，或其变体。在一个是实施方案中，4E6构建体是人源化或人工程化序列，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体如SEQ ID NO: 28中所提供，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体如SEQ ID NO:29中所提供，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体包含SEQ ID NO: 35、42、46、52、57、64或70，或其变体。在一个实施方案中，4E6构建体包含SEQ ID N0:36、42、47、52、58、65或71，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO: I的4E6多肽或其变体、多聚体或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ IDN0:26的4E6Hu多肽或其变体、多聚体或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码4E6Hu多肽的一个或多个CDR区(即SEQ ID N0:42、52和64)的核酸，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码4E6多肽的一个或多个⑶R区(即SEQ ID N0:42、52和65)的核酸，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:65的⑶R3区的核酸，或其变体。
7A12 家族在一个实施方案中，NB剂是7A12，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体是SEQ ID N0:2的单体，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQ ID N0:2的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，7A12多聚体构建体是SEQ ID NO: 2的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体是SEQID N0:9-ll的任意一个或多个中提供的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体包含SEQ ID N0:63。在一个实施方案中，7A12构建体包含SEQ ID N0:41的CDRl序列、SEQ ID N0:51的⑶R2序列及SEQ ID NO:63的⑶R3序列，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体是人源化或人工程化序列，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体如SEQID NO: 10中所提供，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体如SEQ ID NO: 11中所提供，或其变体。在一个实施方案中，7A12构建体包含SEQ ID NO: 34、41、45、51、56、63或69，或其变体。还考虑更高级的多聚体,如由6-10个亚基组成的多聚体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:2的7A12多肽或其变体、多聚体 或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQID N0:41、51和63的⑶R区中的一个或多个的核酸，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID N0:63的⑶R3区的核酸，或其变体。IOFl 家族在一个实施方案中，NB剂是10F1，或其变体。在一个实施方案中，IOFl构建体是SEQ ID N0:3的单体，或其变体。在一个实施方案中，IOFl构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQ ID N0:3的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，IOFl多聚体构建体是SEQ ID NO:3的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，IOFl构建体是SEQ ID NO: 12-16的任意一个或多个中提供的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，IOFl构建体包含SEQ ID N0:68，或其变体。在一个实施方案中，IOFl构建体包含SEQ ID NO:44的⑶Rl序列、SEQ ID NO:55的⑶R2序列及SEQ ID NO:68的⑶R3序列，或其变体。在一个实施方案中，IOFl构建体是人源化或人工程化序列，或其变体。在一个实施方案中，IOFl构建体包含SEQ ID NO: 15，或其变体。在一个实施方案中，IOFl构建体包含SEQ ID NO: 16,或其变体。在一个实施方案中，IOFl构建体包含SEQ ID N0:40、44、50、55、62、68或72，或其变体。还考虑更高级的多聚体,如由6-10个亚基组成的多聚体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:3的IOFl多肽或其变体、多聚体或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQID NO:44,55和68的⑶R区中的一个或多个的核酸，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID N0:68的⑶R3区的核酸，或其变体。IlDl 家族在一个实施方案中，NB剂是11D1，或其变体。在一个实施方案中，IlDl构建体是SEQ ID N0:4的单体，或其变体。在一个实施方案中，IlDl构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQ ID N0:4的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，IlDl多聚体构建体是SEQ ID N0:4的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，IlDl构建体是SEQ ID NO: 17-19的任意一个或多个中提供的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，IlDl构建体包含SEQ ID N0:67，或其变体。在一个实施方案中，IlDl构建体包含SEQ ID NO:43的CDRl序列、SEQ ID NO:54的CDR2序列及SEQ ID N0:67的CDR3序列，或其变体。在一个实施方案中，IlDl构建体是人源化或人工程化序列，或其变体。在一个实施方案中，IlDl构建体包含SEQ ID NO: 18，或其变体。在一个实施方案中，IlDl构建体包含SEQ ID NO: 19,或其变体。在一个实施方案中，IlDl构建体包含SEQ ID N0:39、43、49、54、61、67或71，或其变体。还考虑更高级的多聚体,如由6-10个亚基组成的多聚体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:4的IlDl多肽或其变体、多聚体或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQID N0:43、54和67的⑶R区中的一个或多个的核酸，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID N0:67的⑶R3区的核酸，或其变体。 UH6 家族在一个实施方案中，NB剂是11H6，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体是SEQ ID N0:5的单体，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体是SEQ ID N0:30的单体，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQ ID NO:5的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体是包含有效连接的两个或更多个SEQ ID NO:30的单体的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体是包含有效连接的两个或更多个单体的多聚体，或其变体(例如SEQ ID N0:88)，其中所述两个或更多个单体为SEQ ID N0:5和SEQ IDN0:30 二者的组合，其中所述单体可以处于任意顺序。还考虑更高级的多聚体，如由6-10个亚基组成的多聚体。在一个实施方案中，11H6多聚体构建体是SEQ ID NO: 5的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，11H6多聚体构建体是SEQ ID NO: 30的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体。在一个实施方案中，11H6多聚体构建体是SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:30二者组合的三聚体、四聚体或五聚体，或其变体，其中单体可以处于任意顺序。在一个实施方案中，11H6构建体是SEQ ID NO: 20-22和31-33的任意一个或多个中提供的多聚体，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体包含SEQ ID NO: 66或83，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体包含SEQ ID NO: 43的CDRl序列、SEQ ID NO: 53的CDR2序列及SEQ IDNO:66的任意一个或多个的CDR3序列，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体是人源化或人工程化序列，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体如SEQ ID N0:31中所提供，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体如SEQ ID NO:32中所提供，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体如SEQ ID NO:33中所提供，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体包含SEQ ID NO: 37、43、48、53、59、66或70，或其变体。在一个实施方案中，11H6构建体包含 SEQ ID N0:38、43、48、53、60、66 或 71，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID NO:5的11H6多肽或其变体、多聚体或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQID NO: 30的IlH6Hu多肽或其变体、多聚体或片段的核酸。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ ID N0:43、53和66的⑶R区中的一个或多个的核酸，或其变体。在一个实施方案中，NB构建体是编码SEQ IDNO: 66的⑶R3区的核酸，或其变体。所考虑的其他NB剂变体在一个实施方案中，本发明的NB剂是包含选自11D1、11H6、10F1、7A12和4E6的至少两个不同亚基的多聚体构建体，或其变体。在一个实施方案中，多聚体构建体中的具体顺序包含交替亚基。SEQ ID N0:84中提供示例性构建体。考虑亚基在多聚体NB构建体内的其他排列。基于本文的公开内容和可选地在有限程度的常规实验后，技术人员通常将能够确定和选择适宜的取代、缺失或插入，或其适宜组合，该常规实验可以例如涉及引入有限数目的可能取代，和确定它们对这样获得的NB构建体的特性的影响。除所公开的本文提供的示例性NB多肽构建体外，本发明还涵盖编码本发明公开内容所涵盖的任何NB剂的核苷酸，其非限制性地包括DNA和RNA序列或其变体，可以是分离的或在重组载体中的等等，和/或为编码区或片段，包括尤其是编码所公开的NB构建体的CDR3区的片段。在一个实施方案中，NB剂是编码表1-4中提供的序列中任一个的NB构建体的核酸。在一个实施方案中，NB剂是编码SEQ ID N0:l-5、2、3、4、5、26、30和87中任一个的4E6构建体的核酸。在一个实施方案中，NB剂是编码SEQ ID NO: 41_44、51_55和63-68中任一个的核酸。在一个实施方案中，NB剂是编码SEQ ID N0:41-44、51-55和63-68中任一个的核酸。
下文表1-4中提供本发明的示例性序列。表头的术语“ID”指给定的SEQ ID NO。 对于每一种NB构建体，FR和⑶R序列的优选组合在本申请通篇中可互换使用。表I :来自最初筛选的单价/单体DR5结合组分的多肽序列，附SEQ IDNO
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Grf tisrdnakdtmylqmnslkpedtavyf CnaElLKRAYlDvyvNywgqgtqvtvss表2 :具有可选的接头序列的多价抗-DR5NB构建体的多肽序列，附SEQ ID NO
权利要求
1.分离的多肽，其包含特异性结合人DR5的NB剂的单可变结构域的至少一个单体。
2.权利要求I的多肽，其中所述单可变结构域选自a)包含一个或多个互补决定区3(⑶R3)序列的单可变结构域，该一个或多个⑶R3序列选自SEQ ID NO:63-68的任何一个或多个；b)包含一个或多个互补决定区3 (⑶R3)序列的单可变结构域，该一个或多个⑶R3序列与选自SEQ ID NO:63-68的任何一个或多个的至少一个⑶R3具有90%同一性；和c)包含一个或多个互补决定区3 (CDR3)序列的单可变结构域，该一个或多个CDR3序列与选自SEQ ID NO:63-68的任何一个或多个的至少一个⑶R3具有至少95%同一性。
3.权利要求I的多肽，其中所述单可变结构域选自a)SEQID NO: 1_5、26、30和87的单可变结构域；和b)与SEQ ID N0:l-5、26、30和87的至少一个单可变结构域具有至少95%同一性的单可变结构域。
4.分离的多肽，其包含特异性结合人DR5的单可变结构域的至少3个、至少4个或至少5个单体亚基，其中所述亚基可选地通过多肽接头连接。
5.权利要求4的多肽，其中所述多肽包含单可变结构域的相同的单体，且其中所述单可变结构域选自a) SEQ ID N0:l-5、26、30和87的单可变结构域；b)与SEQ ID NO: 1-5,26,30和87的至少一个单可变结构域具有至少90%同一性的单可变结构域；和c)与SEQID NO: 1-5、26、30和87的至少一个单可变结构域具有至少95%同一性的单可变结构域。
6.权利要求4的多肽,其包含选自以下的一个或多个亚基的氨基酸序列a)SEQ IDN0:6、9、12-14、17、20、27 和 31 的氨基酸序列；和 b)与所述 SEQ ID NO:6、9、12-14、17、20、27和31的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
7.权利要求4的多肽，其特异性结合人DR5，且其中所述多肽对选自Colo205、Jurkat、Molt4、H2122、H226和H2052的一组至少2个肿瘤细胞系具有等于或低于IOOnM的体外效力(IC50)。
8.权利要求7的多肽，其中所述多肽具有等于或低于ΙΟηΜ、等于或低于InM、或等于或低于IOOpM的体外效力。
9.分离的多肽，其包含选自SEQID N0:l-22、26-33、87和88的一个或多个氨基酸序列的氨基酸序列。
10.权利要求I的分离的多肽，其包含至少一个互补决定区(⑶R)，该至少一个⑶R与SEQ ID NO:41 至 44 (CDR1)、SEQ ID NO:51 至 55 (CDR2)、SEQ ID NO:63 至 68 (CDR3)、更优选SEQ ID N0:51至55和SEQ ID NO:63至68中任一个所示的CDR区的至少一个具有至少 60%、70%、80%、90%、95% 或 100% 序列同一性。
11.前述权利要求中任一项的分离的多肽，其是人源化免疫球蛋白、驼源化免疫球蛋白、或可通过亲和力优化技术获得的免疫球蛋白，或其片段。
12.前述权利要求中任一项的分离的多肽，其基本上由轻链可变结构域序列，例如Vl-序列、或重链可变结构域序列，例如Vh-序列组成；或是结构域抗体、单结构域抗体、dAb和驼源抗体或片段，包括但不限于Vhh序列。
13.前述权利要求中任一项的分离的多肽,其基本上由Vhh序列组成，该Vhh序列 (a)与SEQ ID NO 1-22、26_40、87_88和103-104的氨基酸序列中的至少一个、或由SEQID NO:96-99中的至少一个编码的氨基酸序列具有至少90%氨基酸同一性，其中，为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；且其中 (b)可选地，根据Kabat编号的氨基酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108中的一个或多个被人工程化。
14.化合物，其包含一种或多种根据前述权利要求中任一项的多肽或基本上由该一种或多种多肽组成，且可选地进一步包含一个或多个其他基团、残基、结构部分或结合单位，其中所述化合物能够增强细胞凋亡。
15.权利要求14的化合物，其中所述至少3个、4个、5个或更多个单价结合多肽全都针对人DR5的同一结合区。
16.权利要求14的化合物，其中所述至少一个单价结合多肽针对DR5的一个结合区，至少一个其他单价结合多肽针对DR5的另一不同的结合区或另一 DR5的结合区。
17.权利要求1的多肽，其用作药物。
18.权利要求17的多肽，其用作抗癌药物。
19.权利要求18的多肽和至少一种可药用载体、稀释剂或赋形剂和/或助剂。
20.用于预防和/或治疗可以通过增强细胞凋亡来治疗的障碍的方法，该方法包括对有需要的受试者施用药物有效量的至少一种任何以上权利要求的多肽。
21.权利要求20的方法，其中所述障碍是对激动DR5活性有反应的增生性疾病。
22.权利要求21的方法，其中所述增生性疾病选自 a)一种或多种实体癌症，选自原发性和转移性癌症，如肾细胞癌和肺癌(例如小细胞肺癌“SCLC”和非小细胞肺癌“NSCLC”)，胰腺、造血系统恶性肿瘤，神经胶质瘤，星形细胞瘤，间皮瘤，结肠直肠癌，前列腺癌，骨肉瘤，黑素瘤，淋巴瘤(包括但不限于伯基特淋巴瘤)，乳腺癌，子宫内膜癌，肝癌，胃癌，皮肤癌，卵巢癌和任何来源的鳞状细胞癌(包括但不限于肺、头和颈、乳腺、甲状腺、子宫颈、皮肤和/或食管的鳞状细胞癌); b)一种或多种液体癌症，选自白血病，包括尤其T细胞白血病，如急性T细胞白血病(T-ALL)、急性B细胞白血病(B-ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、浆细胞性骨髓瘤和多发性骨髓瘤(MM);和 c)一种或多种非癌适应症，该适应症包括一种或多种炎性和自身免疫性疾病，如系统性红斑性狼疮、桥本病、类风湿性关节炎、移植物抗宿主疾病、干燥综合症、恶性贫血、艾迪生病、硬皮病、肺出血肾炎综合症、克罗恩病、自身免疫性溶血性贫血、不育、重症肌无力、多发性硬化、突眼性甲状腺肿、血栓形成性血小板减少症、血小板减少性紫癜、胰岛素依赖性糖尿病、变态反应、哮喘、特应性疾病、动脉硬化、心肌炎、心肌病、肾小球肾炎和再生不良性贫血。
23.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是胰腺癌。
24.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是T-ALL。
25.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是间皮瘤。
26.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是任何组织来源的鳞状细胞癌。
27.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是AML。
28.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是黑素瘤。
29.权利要求22的方法，其中所述增生性疾病是骨髓瘤。
30.前述权利要求中任何一项或多项的分离的多肽，其中按照Kabat和/或Chothia规贝IJ，计算CDR。
31.前述权利要求中任何一项或多项的NB构建体，其结合表29A中提供的DR5表位或结合表30A中提供的DR5表位。
全文摘要
本发明涉及针对TRAIL细胞表面受体2(本文也称“DR5”)的氨基酸序列，以及其化合物或构建体，尤其是蛋白质和多肽及编码它们的核酸(本文将其整体称为“NB剂”)及其片段，其药物有效变体，及它们在诊断和治疗DR5相关疾病和障碍中的用途。
文档编号C07K16/28GK102884083SQ201180017709
公开日2013年1月16日 申请日期2011年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者K·克罗米, B·东布雷克特, S·埃滕伯格, J·科尔克曼, J·李, K·米尔斯谢尔特, D·R·斯托弗, J·张 申请人:诺瓦提斯公司, 博灵克斯股份有限公司