用于增强疫苗免疫原性的肽、偶联物及方法

专利名称：用于增强疫苗免疫原性的肽、偶联物及方法
技术领域：
本发明涉及疫苗领域，例如抗癌症或传染性疾病的疫苗。特别是，本发明提供一种含有衍生于破伤风毒素的肽的免疫原，当施用于具有抗破伤风毒素的抗体的受试者时，该免疫原用于诱导有效的体液和细胞免疫应答。
背景技术：
几乎所有的新疫苗都没有所需要的那样有效，特别是当感染已经自行建立时。最好的疫苗是以经验观察为基础的。这些例如被杀死或减弱的微生物。一般的说，这种疫苗含有用于诱导有效的和保护性的免疫应答所需的所有成分。然而，这些疫苗通常界定不明确。此外，它们含有许多未知的成分，作用机制通常在很大程度上不为人所知，它们不能可繁殖的被制备并且因此不能符合现代药剂的标准。应用它们仅由于目前无法获得更好的。因为不能接受利用来自于天然的材料(即癌细胞)，在利用疫苗抵抗癌症时情况甚至变得更 复杂。为了使疫苗引起保护性的抗微生物病原体的免疫应答，例如树突状细胞和巨噬细胞的抗原提呈细胞(APC)需要摄取足够有效的疫苗。APC必须将抗原内化并将它们转运至特定区域的引流淋巴结，在这里它们分别在MHC I类分子和MHC II类分子上加工和提呈抗原肽用于活化CD8+T细胞和0)4+T细胞(Zinkernagel等(1999) Immunol Rev156:199-209;Banchereau 和 Steinman(1998)Nature 392:245-252)。然而，由于APC摄取不足，几种疫苗有有限的免疫原性，即使它们由在人中为抗原的蛋白质所组成。摄取不足可能是因为溶液中的许多免疫蛋白以及微粒子疫苗缺少能够被APC识别用于进行内化和加工的标记，因此这种疫苗的摄取仅由随机的内噬作用介导进入APC，从而使得疫苗的有效性降低(Abdel-Motal 等(2009) Vaccine 27:3072-3082)。当施用作为具有与其相应的IgG抗体的免疫复合物的疫苗时，诸如破伤风毒素的微生物疫苗的免疫原性显示被促进(Raveth和Clynes (1998) AnnuRev Immunol16:421-432;Schuurhuis 等(2002)J Immunol 168:2240-2246;Gosselin 等(1992)JImmunol 149:3477-3481)。然而，不利的是，这种免疫复合物必须由具有Fe结构域的抗体形成，该Fe结构域能有效的结合到APC上的Fe-伽马受体，然而许多单克隆抗体的Fe结构域与APC上的Fe-伽马受体的相互作用薄弱。另外一个不利的是在这个复合物中免疫显性肽表位可能是被掩盖的，因而导致了弱的免疫原性。WO 2008/118487论述了另外一种增强疫苗免疫原性的方案，其中，公开了一种载有a -gal表位(Gal a l-3Gal β 1_4 (3) GlcNAc-R)的流感病毒，导致了增强的病毒颗粒子对APC的靶向定位以及升高的对流感的体液和细胞免疫应答。然而，与合成常规的肽相比，合成a -gal表位更加困难，其结果是更加昂贵。Volk 等(1984，Infect. Immun. 45:604-609)公开了含有毒素重链 N-末端部分的破伤风毒素片段及其抗体，该毒素重链N-末端部分含有序列GITELKKL，该序列如在SEQ IDNO 3所示的覆盖该毒素重链第383至第390位残基。
Raju等(1996, J. Autoimmun. 9:79_88)公开了每个长度为20个残基的重叠合成肽，用于确定人类⑶4+T细胞的表位组成成分。其中一个覆盖破伤风毒素重链的第371-390位的残基，完整的含有序列GITELKKL的肽被所述细胞识别。Demotz等(1989，J. Immunol. 142:394-402)公开了结合于破伤风毒素B片段以及含有序列GITELKKL的重组片段744-1315和604-1315的单克隆抗体。Engstrom等(J. Immunoassays 16:231-245)公开了一种“妝20”,含有序列GITEL，可以被人类抗体IgG和IgA识别。WO 2004/000873公开了一种偶联物，该偶联物含有衍生自破伤风重链序列830-843的含有序列GITE的破伤风表位。
Fischer 等(1994，Mol. Immunol. 31:1141-1148)公开了来自于小鼠和兔的破伤风类毒素抗体的表位图谱，并且公开了来自于覆盖破伤风类毒素重链的350-400位残基的区域的六肽表现出与抗体高度的反应性。然而，现有技术均没有教导或表明含有来自于破伤风毒素的线性表位的肽，人群中频繁出现抵抗破伤风毒素的循环抗体。现有技术也没有教导或表明利用这些肽来偶联需要免疫应答以对其进行抵抗的抗原，以便于提高诱导期望的免疫应答的效率。因此，本技术领域仍需要增强疫苗免疫原性的方法和手段。

发明内容
本发明的第一种实施方式涉及一种偶联物，该偶联物含有偶联于抗原、免疫原或含有抗原或免疫原的载体的肽，其中，所述肽含有(i )具有氨基酸序列GITELKKL的SEQ IDNO 3的至少10个氨基酸残基；或，(ii)与(i)中提供的氨基酸序列有至少80%序列一致性的氨基酸系列，并且其中，当将肽施用于来自至少10名已用破伤风类毒素接种的人类受试者的血清样本时，如在破伤风毒素或类毒素酶联免疫法(Tettox ELISA)中确定的，肽在至少50%的血清样本中通过来自于血清样本的抗体结合；并且其中，所述肽不是破伤风毒素β链。在第二种实施方式中，所述肽含有少于100个的氨基酸残基。第三种实施方式涉及根据第一种或第二种实施方式所述的偶联物，其中，抗原、免疫原或含有抗原或免疫原的载体偶联于所述肽的C-末端。第四种实施方式涉及根据前述实施方式所述的偶联物，其中，2至20个肽结合于抗原、免疫原或含有抗原或免疫原的载体。第五种实施方式涉及根据前述实施方式所述的偶联物，该偶联物作为药剂使用。优选地，这种偶联物在具有抗破伤风毒素或破伤风类毒素的抗体的受试者中作为药剂使用。更优选地，该药剂为预防性的或治疗性的疫苗。第六种实施方式涉及根据第一种至第四种实施方式中任意一种实施方式所述的偶联物，用于在受试者中预防或治疗癌症或传染性疾病。第七种实施方式涉及根据第一种至第四种实施方式中任意一种实施方式所述的偶联物在制造用于在受试者中预防或治疗癌症或传染性疾病的药剂中应用。优选地，所述偶联物在具有抗破伤风毒素或破伤风类毒素的抗体的受试者中作为药剂使用。在第八种实施方式中，所述偶联物在施用所述偶联物至少两周前已被施用用于产生破伤风毒素的循环抗体的疫苗的受试者中作为药剂使用。在第九种实施方式中，所述偶联物或其作为药剂的应用用于抗体介导的抗原靶向作用(antigen-targeting)ο在第十种实施方式中，所述偶联物或其作为药剂的应用用于癌症的治疗，其中，所述治疗进一步含有外科手术、化学疗法和/或放射疗法。在第十一种实施方式中，所述偶联物或其作为药剂的应用用于治疗已经用破伤风类毒素免疫的具有抗破伤风毒素或破伤风类毒素的抗体的，已经具有针对破伤风的暴露后预防和/或已经患有破伤风的受试者。在第十二种实施方式中，在本发明所述的偶联物中，抗原或免疫原含有T细胞表位。更优选地，抗原或免疫原含有细胞毒性T细胞和/或辅助性T细胞表位。 在第十三种实施方式中，在本发明所述的偶联物中，肽和抗原，免疫原或含有抗原或免疫原的载体通过连接体偶联。优选地，所述连接体是氨基己酸-生物素化的赖氨酸。在另一种实施方式中，在本发明所述的偶联物中，肽和抗原，免疫原或含有抗原或免疫原的载体是在没有连接体的情况下偶联在一起的。在优选的实施方式中，在本发明所述的偶联物中，肽和抗原，免疫原或含有抗原或免疫原的载体是通过共价键偶联在一起的。在第十四种实施方式中，本发明涉及一种肽，所述肽含有(i)具有氨基酸序列GITELKKLES的SEQ ID NO :3中的至少12个氨基酸残基；或，(ii )与(i )中提供的氨基酸序列有至少80%序列一致性的至少12个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中，当将肽施用于来自至少10名已用破伤风类毒素接种的人类受试者的血清样本时，如在Tettox ELISA中确定的，肽在至少50%的血清样本中通过来自于血清样本的抗体结合；其中,所述肽含有少于100个的氨基酸。在第十五种实施方式中，本发明涉及一种肽，所述肽含有(i)如SEQID NO :4_24的任意一个中提供的氨基酸序列；或( )与SEQ ID NO :4-24中提供的氨基酸序列有至少80%序列一致性的氨基酸序列，并且其中，当将肽施用于来自至少10名已用破伤风类毒素接种的人类受试者的血清样本时，如在Tettox ELISA中确定的，肽在至少50%的血清样本中通过来自于血清样本的抗体结合。在第十六种实施方式中，本发明涉及根据第十五种实施方式所述的肽，其中，所述肽具有SEQ ID NO 24中提供的氨基酸序列或由SEQ ID NO 24中提供的氨基酸序列组成。在第十七种实施方式中，本发明涉及根据第十四种至第十六种实施方式中任意一种实施方式所述的肽，其中，所述肽含有少于50个的氨基酸残基。在第十八种实施方式中，本发明涉及根据第十四种至第十七种实施方式中任意一种实施方式所述的肽，其中，所述肽在SEQ ID NO 4或SEQ IDNO 24的C-末端含有另外的
氣基酸残基。在第十九种实施方式中，本发明涉及根据第十八种实施方式所述的肽，其中，所述另外的氨基酸残基不是衍生自破伤风毒素β链。
具体实施例方式定义术语“免疫应答”在此用于表征产生抗体和/或细胞(例如T淋巴细胞)，所述抗体和/或细胞用于直接抵抗，或者协助分解或抑制特定的抗原表位。短语“有效的免疫保护性应答”、“免疫保护”以及类似的短语，为了本发明的目的，意思是在接种了疫苗的受试者中直接抵抗病原体的一个或多个抗原表位或抵抗癌细胞的一个或多个抗原表位以保护抵抗由病原体引起的感染或抵抗癌症的免疫应答。为了本发明的目的，保护抵抗由病原体引起的感染或保护抵抗癌症不仅仅含有对感染或癌症的完全的抵御，也含有例如与未接种过疫苗的感染的受试者相比，在接种了疫苗的受试者中由病原体引起的感染或癌症的任何可探知的程度上或比例上的减轻，或任何可探知的由病原体引起的感染或癌症所导致的疾病的严重性或任何症状或状况的减轻。在癌症情况下有效的免疫保护应答也含有清除癌细胞，从而减小肿瘤的尺寸或甚至清除肿瘤。为了达到此目的，接种也被称为治疗性接种。可以在先前未受病原体感染和/或在疫苗接种时未受病原体感染以及未患有癌症的受试者中诱导有效的免疫保护应答。也可以在疫苗接种时已经感染病原体或已经患有癌症的受试者中诱导有效的免疫保护应答。
根据本发明，在此普遍使用的术语“抗原”表示任何特异性结合于抗体的分子。这个术语也表示任何可以被MHC分子结合并提呈给T细胞受体的分子或分子片段。抗原可以是例如蛋白质类分子，即多聚氨基酸序列，任意含有非蛋白基团如碳水化合物部分和/或脂类部分或抗原可以为例如非蛋白质类的分子如碳水化合物。抗原可以为例如蛋白质的任何部分(肽，部分蛋白质，全长的蛋白)，其中，蛋白质为天然产生或合成衍生，细胞组分(全细胞，细胞裂解物或破裂的细胞)，有机体(完整的有机体，裂解或破裂的细胞)或者碳水化合物或其它分子，或其部分，能够在特定受试者中诱发抗原特异性的免疫应答(体液和/或细胞免疫应答)，免疫应答优选能够通过试验或方法进行测量。术语“抗原”在此可以用术语“免疫原”进行替换，在此用于描述蛋白、肽、细胞组分、组织或其他诱发体液免疫和/或细胞免疫应答(即，是抗原的)的分子，使得免疫原施用于受试者(例如，通过本发明的疫苗)发动免疫原特异性的免疫应答抵御在受试者组织中遇到的相同或相似的免疫原/抗原。因此，为了接种受试者抵抗特异性的抗原方法，在一种实施方式中，诱发免疫应答抵御该抗原或其免疫原部分作为使用此种抗原的结果。接种优选地导致防御或治疗作用，其中，后续的暴露于抗原(或抗原的来源)诱发抵御抗原(或来源)的免疫应答，该免疫应答在受试者中降低或预防疾病或症状。接种的概念在本技术领域是为人所熟知的。与未施用疫苗的情况相比，由施用本发明的预防性的或治疗性的组合物诱发的免疫应答可以为在免疫状况的任何方面的任何可探知的变化(例如，细胞应答，体液应答，细胞因子产生)。此处“表位”可以定义为足以在受试者中引起免疫应答的在给定的抗原/免疫原中的单独的免疫原的位点。本领域技术人员将意识到T细胞表位的大小和组成与B细胞表位不同，并且T细胞表位通过MHC I类途径来提呈不同于通过MHC II类途径提呈的表位。依赖于免疫应答的类型，表位可以是线性的序列或结构性表位(保守结合区域)。抗原可以小至单个的表位，或更大，并且可以包括复合的表位。例如，抗原的大小可以小至5-12个氨基酸(例如，肽)并大至全长的蛋白质，该蛋白质含有多聚体和融合蛋白，嵌合蛋白，全细胞，完整的微生物，或它们的部分(例如，全细胞的裂解物或微生物的提取物)。此处所用的术语“抗体”的意思是能够特异性的结合于特定抗原的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的片段。抗体对于免疫学领域的技术人员是众所周知的。
在此术语疫苗的“免疫原性”定义为有能力在受试者中诱导和活化T细胞(细胞毒性T细胞和辅助性T细胞)及诱发抗体产生。术语“抗体介导的抗原靶向作用”在此用于表示抗原传递系统，该系统利用通过在APC (例如树突状细胞(DC)和巨噬细胞)的细胞表面表达的Fe受体的抗体(例如IgG)介导的抗原靶向作用。通过利用抗原特异性的抗体，可以在体外和体内形成这些抗体与蛋白质抗原的复合物。这些复合物(称为免疫复合物(IC))可以通过这些Fe受体结合于APC，及接下来被获取，抗原被加工并且由其衍生的肽将被提呈给特异性的T细胞。重要的是，在抗体介导的抗原靶向作用中IC也将活化APC并且导致对特异性的T细胞的最适的刺激(Schuurhuis等，J Immunol. 168，2240-2246，2002)。因此,在抗体介导的抗原祀向作用中在人中循环的特异性抗体用于选择性的定位抗原来刺激细胞免疫系统。在此处使用的术语“肽”被定义为氨基酸残基的链，通常具有特定的序列。此处使用的术语肽是可以与术语“多肽”和“蛋白质”互换的。在本发明的语境中，术语“肽”被定义为含有至少两个通过修饰的或未修饰的肽键连接起来的氨基酸的任何肽或蛋白质。术语 “肽”表示短链分子如寡肽类或寡聚体或表示长链分子如蛋白质。根据本发明的肽可以含有修饰的氨基酸。因此，本发明的肽也可以通过天然过程修饰，如转录后修饰，或通过化学过程进行修饰。这些修饰的一些例子为乙酰化，酰基化，ADP核糖基化，酰胺化，与黄素共价结合，与血红素共价结合，与核苷酸或核苷酸的衍生物共价结合，与修饰的或未修饰的碳水化合物部分共价结合，与脂质或脂质衍生物结合，与磷脂酰肌醇共价结合，交联，环化，形成二硫键，去甲基化，形成半胱氨酸分子，形成焦谷氨酸盐，甲酰化，Y-羧基化，羟基化，碘化，甲基化，氧化，磷酸化，外消旋化，羟基化等等。因此，任何对消除肽的免疫原性没有作用的肽的修饰均在本发明的范围内。术语“序列识别”在此定义为两种或多种氨基酸(肽或蛋白质)序列或两种或多种核酸(多核苷酸)序列之间的关系，通过序列比对确定。通常，序列一致性和相似性的比对通过比对序列的全长进行。本技术领域中，“一致性”同样表示氨基酸或核酸序列之间的序列亲缘关系的程度，根据情况确定，通过匹配这种序列的串来确定。两种氨基酸序列之间的“相似性”通过将一种肽的氨基酸序列和它的保守的氨基酸替代物与第二种肽的序列进行比较来确定。“一致性”和“相似性”可以通过多种方法容易的测得，这是本领域技术人员所熟知的。在优选的实施方式中，如在此确定的，序列一致性通过比对序列的全长来确定。确定一致性的优选的方法设计为在被测试序列之间给出最大的匹配。确定一致性和相似性的方法在公开可用的计算机程序中已被编撰。优选的确定两个序列的一致性和相似性的计算机程序方法包括例如 BestFit, BLASTP, BLASTN 和 FASTA (AltschuI，S. F.等，J. Mol.Biol.215:403-410(1990), publicly available from NCBI and other sources (BLASTManual, Altschul, S.,等，NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894)。被应用的最优选的计算程序为 EMBOSS(http://www. ebi. ac. uk/emboss/align)。用 EMBOSS 进行氨基酸序列比对的优选参数为缺口开放10. 0，缺口延伸0. 5，Blosum 62矩阵。用EMBOSS进行氨基酸序列比对的优选参数为缺口开放10. 0，缺口延伸0. 5，DNA全矩阵(DNA单位矩阵)。可选择地，在确定氨基酸相似性的程度中，本领域技术人员也可以计算称为“保守的”氨基酸替代，对本领域技术人员来说是清楚的。保守的氨基酸替代指的是有相似侧链的残基的相互替代。例如，有脂肪族侧链的一组氨基酸为丙氨酸、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；例如，有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；有含酰胺类侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；有酸性侧链的一组氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸；有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸；有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；有含硫的侧链的氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的氨基酸替代是用来自相同的保守氨基酸组中的氨基酸进行氨基酸的替代。这些保守氨基酸组为丙氨酸-缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-甲硫氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸；赖氨酸-精氨酸-组氨酸；天冬酰胺-谷氨酰胺；天冬氨酸-谷氨酸；丝氨酸-苏氨酸；甘氨酸-脯氨酸。在特定情况下，另一种保守氨基酸替代组为赖氨酸-甲酰赖氨酸(formyllysine)。术语受试者中的“肿瘤”或“癌症”指的是具有例如不规则的生长或形态的特征的细胞的出现，包括不受控制的增殖，永生，有潜在的迁移性，迅速生长和增殖率，以及特异的形态特征。通常，癌细胞为肿瘤的形式，但是这种细胞也可以在受试者中以相互独立的形式存在。“肿瘤”包括良性和恶性肿瘤。在本发明的语境中，“患者”或“受试者”可能是动物(包括人类)。优选地，患者或受试者为人类。 术语“Tettox elisa”在此用于指明用于破伤风类毒素抗体的特定的酶联免疫法，在此做进一步定义。本发明的详细描述本发明人先前已经指出形成的免疫复合物(IC)是非常有效的疫苗配方用于在小鼠中有效地引起T细胞免疫应答(Schuurhuis等，J Immunol. 168，2240-2246，2002)。通过将蛋白质抗原卵白蛋白(OVA)与抗OVA的抗体混合，发明人可以有效的将抗原靶向作用于树突状细胞(DC)，同时导致强的DC成熟。这些成熟的DC在体外交叉提呈OVA-衍生肽给⑶8T细胞并且在小鼠中基于免疫非常有效地引起⑶8+T细胞。重要的是，这些T细胞应答可以在体内控制肿瘤，当这些IC预先载入DC时特别有效(Schuurhuis等，J Immunol176，4573-4580，2006)。用加载预先形成的IC的DC进行免疫导致保护的肿瘤免疫，同时也对荷瘤小鼠有治疗作用。体内肿瘤控制取决于DC上活化的Fe受体的存在以及特异的CD8+细胞毒性T细胞的诱导。这些发现显示特异的抗体介导的抗原靶向作用于DC是诱导抗癌症的T细胞免疫的高度有效的模式。本发明的发明人现在已经惊奇的发现在小鼠中预先存在的循环抗体可以用于有效的引起特异性的T细胞增值。抗半抗原TNP (三硝基苯基基团结合于肽或蛋白质)的抗体通过用特异性的半抗原载体(TNP-BSA)的免疫来诱导。接下来用非相关的蛋白抗原与相同的半抗原(TNP-OVA)偶合攻击被免疫的小鼠。发现与用没有TNP的BSA接种的对照小鼠相比，抗非相关蛋白抗原OVA的T细胞应答在这些小鼠中以更高的水平被诱导。这些发现提供了对原理的验证即可以通过利用在接种时已经存在的循环抗体来增强疫苗的免疫能力。由于小鼠和人的种间差异，必须靶向不同的循环抗体类群，并因此发明人提出了可以适用于人类的用于增强疫苗效力和免疫能力的肽。这种方法尽可能的模拟自然的免疫应答，机体免疫系统使用该免疫应答去除入侵的微生物，特别是感染和依靠机体细胞的微生物，如病毒和如结核杆菌的细胞内细菌。本发明的接种方法实际上对特异性免疫的两个主要的装备进行了最好的利用，即血浆中预先存在的抗体和T细胞提供的细胞介导的免疫。本发明利用抗体的Fe片段传递结合于抗体另一末端的抗原至抗原提呈细胞。之前的工作显示这是将免疫原靶向抗原提呈细胞(APC)的最有效的方式之一，抗原提呈细胞即体内起始免疫应答的细胞，例如树突状细胞(DC)或巨噬细胞。针对本发明，DC是最重要的APC。并没有希望与任何原理结合，似乎是由于抗原引发所需的细胞介导的免疫是与定义的结合于血清中预先存在的抗菌的抗体的氨基酸物理相关的，抗原意外的集中对APC的前所未有的作用，例如，DC将会通过结合抗体的复合物与位于APC上的所谓的Fe受体的结合发生(见图I)。这不仅提供非常有效的介导靶抗原(即病毒或肿瘤靶抗原)进入APC，也诱导强烈的APC活化。这些事件对于介导强烈的治疗性的细胞免疫应答(T细胞应答)是至关重要的，用于清除非正常细胞，比如肿瘤细胞或受病毒感染的细胞。实际上，在有抗体结合的复合物的小鼠的实验中，结合于肽诱发T细胞应答，与抵抗非结合成分的应答相比，这种方法显著地增强T细胞应答。由于历史原因，现代药效学和药物分散学很难应用于疫苗。考虑到传统疫苗的复杂状态，这并不意外，因为在人体内追踪每个主要由热致死或减毒的有机体组成的传统疫苗的分解产物，就成了一个几乎不可能的任务。然而，这种论断不适用于本发明的疫苗。第一，根据本发明的更接近药物状态的疫苗允许在体内好得多的疫苗结局。第二，对新出现疫 苗的药效学和药物分散学研究对于开发其在适宜条件下的治疗潜能是非常必要的。设计和测试新的疫苗的挑战在于如何使其更具潜能从而将它们从纯的预防疫苗当中转化出来，这很大程度上依靠中和抗体，转化为具有诱导强烈的T细胞应答并治疗已形成的由感染(例如病毒肿瘤)引起的持续的感染和疾病的效力的，以及对如非病毒肿瘤的非感染的状况有疗效的治疗性疫苗。肽根据本发明的肽，优选为抗受试者中免疫应答所需要的已获得的循环抗体的分子。破伤风毒素(TTx)，也称为破伤风痉挛毒素，痉挛毒素，TeTx，TeNT和TTX，是已知的最具毒性的蛋白质中的一种。TTx是一种神经毒素，由厌氧环境中的破伤风梭菌(Clostridiumtetani)的无性生殖芽孢产生，能够引起人类的破伤风。它以通过半胱氨酸L428和HlO之间的二硫键以及非共价键的相互作用相连接的一条重链和一条轻链的形式存在。破伤风类毒素(TTd)通过将TTx用福尔马林的蛋白质处理脱毒获得。这种处理导致蛋白的多种修饰(例如，赖氨酸残基侧链的甲酰化作用和分子内及分子间的交联的形成)。尽管TTd为TTx的修饰型(且因此为一个不同的蛋白)TTd可以介导抗破伤风的免疫保护，这表明由TTd接种引起的抗体可以识别TTx。本发明的发明人用来自于TTx氨基酸序列的的未修饰线性表位来寻找TTd抗体的线性表位。破伤风毒素有1314个氨基酸(SEQ ID NO: I)并且由破伤风以一个单独的肽链合成，该肽链水解产生两个片段，轻链(LC ;也被称为α链)衍生自氨基末端(SEQ ID Ν0:2)，和重链(HC ;也被称作β链)衍生于羧基末端(SEQ ID Ν0:3)。破伤风类毒素(TTd)用于免疫，例如抵抗三种传染病(白喉，百日咳(哮喘性咳嗽)，破伤风)的儿童DTP联合疫苗或DTP脊髓灰质炎疫苗。几乎所有人在生命早期都曾免疫接种过破伤风类毒素(TTd)，这是由于它包括于许多国家的儿童预防接种计划的疫苗中。另夕卜，许多人在以后的生命中受到(TTd)的攻击，这是由于抗破伤风接种是在有疑似的潜在引起破伤风感染的外伤后的常规程序。作为结果，抗破伤风毒素/类毒素抗体在工业化国家特殊部分人类群体中出现。因此，由于原位构建抗破伤风毒素/类毒素抗体和含有TTx/TTd表位的偶联物之间的免疫复合物，含有TTx/TTd表位的偶联物(即根据本发明的肽)对APC的靶向作用可能被希望在这种疫苗中起作用。本发明的第一个方面涉及一种肽，所述肽含有(i)含有氨基酸序列GITELKKL的SEQ ID NO :3中的至少10个氨基酸残基；或(ii)与(i)中提供的氨基酸序列有至少70、80,90或100%序列一致性的氨基酸序列，并且其中，当将肽施用于来自于至少10位曾用破伤风类毒素免疫接种过的人类受试者的血清样本时，如在Tettox ELISA中确定的，肽在至少50%的血清样本中通过来自于血清样本的抗体结合；并且其中，肽不是破伤风毒素β链。优选地，(i)中的SEQ ID NO:3中至少10个氨基酸残基为来自于SEQ IDN0:3的10个连续氨基酸。优选地，与(i)中提供的氨基酸序列有至少70、80、90或100%序列一致性的氨基酸序列是10个氨基酸的至少7、8、9或10个氨基酸与含有氨基酸序列GITELKKL的SEQ IDNO:3中的10个连续氨基酸残基有一致性的氨基酸序列。优选地，根据上述(ii)的肽，施用于来自至少10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、100,150,250或更多的人类受试者的血清样本。更优选地,血清样本来自于具有高效价抗-TTd抗体的人类受试者，例如，由后面描述的Tettox ELISA测定的每毫升至少100国际单位(IU)。在优选的实施方式中，人类受试者为随机选择的人类受试者，优选地，随机选择·的人类受试者有如上所述的高效价的抗-TTd抗体。Tettox ELISA优选以下述方式进行包覆有抗生素的96孔板(优选来自于Euro-Diagnostica, Arnhem,荷兰)。包覆有抗生素的96孔板用含有5%BSA的PBS固定(200 μ I/孔，I小时，室温)。然后，用含有O. 05%吐温20的PBS清洗孔板3次。生物素化肽的涂布方式为，以2 μ g/mL的浓度溶解于含有1%BSA的PBS，以100 μ I/孔涂布孔板，室温孵育I小时。孔板用含有O. 05%吐温20的PBS清洗3次，接下来用已经至少用含有1%BSA的PBS稀释100、200、400、500或1000倍的并且优选为不多于100000、10000、7500、5000或2500倍的100 μ I来自于如上所述的人类受试者的血清(优选地，具有高效价的抗-TTd抗体)于室温孵育I小时。然后用含有O. 05%吐温20的PBS清洗孔板3次。每个孔用连接了辣根过氧化物酶的抗体(小鼠抗人IgG-HRP单克隆抗体，克隆G18-145，产品代码555788，Becton Dickinson, 1000X稀释于含有O. 05%吐温20的PBS，100 μ I/孔)孵育I小时，然后用含有O. 05%吐温20的PBS清洗孔板3次。利用
2,2' _连氮基_双-(3-乙基苯并噻唑啉横酸)(2，2' -azino-di-(3-ethylbenzthiazoline sulfonic acid) )，ABTS+H2021/1000，100 μ I/孔进行显影。用 BIO-RAD，680 型，全自动定量绘图酶标仪在415nm测量光密度。在每个板中，优选包括有阴性对照，更优选至少三次重复。优选的阴性对照为来自于没有能够检测的抗-TTd抗体的人类受试者的血清。另一种优选的阴性对照为BSA溶液。如果根据上述(ii)的肽至少与受试的人类血清样本中的40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99% 最优选为 100% 的抗体相结合那么根据上述(ii)的肽为根据本发明的肽。如果特定血清样本的测试光密度与阴性对照相比至少为2. 0，更优选为2. 5,3. 0,3. 5或更多倍高于阴性对照的测试光密度，那么肽被认为通过血清样本中的抗体结合。可选择地，如果(ii)的肽可以被TetaQuin:忠(Sanquin, Amsterdam,荷兰)存在的抗体结合，那么这个肽为根据本发明的肽。在如上所描述的TettoxELISA中，代替了来自于人类受试者的血清，可以用100 μ I已经以800χ稀释于含有1%BSA的PBS溶液中的TetaQuin,当样本的测试光密度与阴性对照相比至少为2. 0，更优选的2. 5,3. 0,3. 5或更多倍高于阴性对照的测试光密度，那么肽被认为通过TetaQmiKKi中的抗体结合。优选地，Tettox ELISA中的所有测试均为重复进行，更优选为三次或更多次重复。优选地，根据本发明的肽含有FIGITELKKL (SEQ ID NO:4)、GITELKKLES(SEQID NO:5)或IGITELKKLE(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。更优选地，根据本发明的肽由FIGITELKKL (SEQ ID NO: 4) ,GITELKKLES (SEQ ID NO:5)或 IGITELKKLE (SEQ ID NO:6)的氨基酸序列组成。在一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽，所述肽含有(i)SEQID NO:4-24的任意一个中提供的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO:4-24中提供的氨基酸序列有至少70、80、90或100%序列一致性和/或至少70、80、90或100%序列相似性的氨基酸序列，并且其中，当将肽施用于来自至少10名曾经接种过破伤风类毒素的人类受试者的血清样本时，如上面所描述的Tettox ELISA中确定的，肽在至少50%的血清样本中被来自于血清样本的抗体结合。优选地，所述肽在其N-末端不再含有其他的氨基酸残基。更优选地，本发明涉 及根据本发明的肽，其中，所述肽含有SEQ ID NO:24中提供的氨基酸序列。本发明的肽含有至少10个氨基酸残基或由至少10个氨基酸残基组成，优选地，含有至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60 或更多个氨基酸残基或由至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60 或更多个氨基酸残基组成。然而在另外的实施方式中，本发明涉及本发明的肽，其中，所述肽含有少于100个氨基酸残基或由少于100个氨基酸残基组成，更优选地，含有少于90、80、70、60、50、40、30、20个氨基酸残基或由少于90、80、70、60、50、40、30、20个氨基酸残基组成。更优选地，根据本发明的肽由18个氨基酸残基组成，且最优选地，根据本发明的肽由SEQ ID N0:24组成。在另一实施方式中，本发明的肽中的氨基酸残基被其他的氨基酸残基所取代，优选的被如前面进一步定义的保守氨基酸残基所取代。本发明的肽中的氨基酸残基是被取代的，优选的在SEQ ID N0:3的381、382、386-390、392-398位点的氨基酸残基被取代。可选择地或与至少一种前述实施方式相结合，本发明涉及一种实施方式，其中，肽在SEQ ID NO:4-24的C-末端含有另外的氨基酸残基。在另一实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽，其中，另外的氨基酸残基并非衍生于破伤风毒素或破伤风毒素β链。在另一实施方式中，本发明涉及本发明的肽，其中，所述肽由权利要求1-3中任意一项所述的氨基酸序列组成。在另一实施方式中，本发明的肽为表2中所不的肽,有大于O. 2、0. 25、0. 35、0. 45、O. 6,0. 75,0. 8,0. 85,1. 0,1. 05,1. I 或 I. 15 的 OD值；表 3 中所示的肽有大于 O. 3,0. 35,0. 4、O. 75,1. 0,1. 15,1. 45,1. 5,1. 55,1. 65,1. 7,1. 85、1. 9 或 2. O 的 OD 值；表 5 中所示的肽有大于 O. 16,0. 18,0. 3,0. 38,0. 62,0. 65,0. 7,0. 71,0. 85,0. 88,0. 9,0. 91 或 I. O 的 OD 值；或表6中所示的肽有至少一个TetaQuinK或血清034960的OD值大于O. 37,0. 41,0. 7,0. 72,0. 8、
O.83,0. 88,0. 9,0. 95,0. 97,1. 01,1. 02,1. 04 或 I. I。这些 OD 值是根据本文另外一处所描述的利用TeiaQuin⑩的Tettox ELISA所测得的。本发明另外提供一种制备本发明的肽的方法，本发明的肽优选通过化学合成和接下来的纯化(例如，见实施例)所制备。本发明蛋白质的肽的独立残基可以通过肽键或肽键模拟(mimetic)结合而成。本发明的肽键模拟包括被本领域的技术人员所熟知的肽骨架修饰。这种修饰包括酰胺氮、α-碳、氨酰羧基、氨酰键的完全取代、延长、截短或骨架交联。通常参见，斯帕托拉，氨基酸的化学和生物化学，妝和蛋白质，卷VIKSpatola, Chemistry and Biochemistry of AminoAcids, Peptides andProteins, Vol. VII) (Weinstein ed.，1983)。许多妝骨架修饰是已知的，包括，Ψ [CH2S]、Ψ [CH2NH]、[CSNH2]、Ψ [NHC0]、Ψ [COCH2]和 Ψ [ (E)或(Z) CH=CH]。以上所用的术语，是依照上述Spatola的建议的。在本文中，Ψ表示缺少一个酰胺键。取代酰胺基团的结构在括号中详细说明。 类氨基酸也可以在肽中结合。这里所用的“类氨基酸”是一个部分而并非自然产生的在构象上和功能上替代本发明的肽的氨基酸。这种部分如果不影响肽与TTd以之前所定义的方式结合，那么其作用是作为氨基酸残基的替代。类氨基酸可以包括非蛋白氨基酸，例如β _、Y _、δ -氨基酸，β -、Y -、δ -亚氨基酸(如哌啶-4-羧酸)还有许多L- α -氨基酸的衍生物。许多适合的类氨基酸是为本领域技术人员所熟知的，它们包括丙氨酸环己酯，3-环己基丙酸，L-金刚烷丙氨酸，金刚烷乙酸及其类似物。另外，D-氨基酸可以认为是模拟的。Morgan 和 Gainor 在(1989)Ann. Repts. Med. Chem. 24:243-252 中讨论了适用于本发明的肽类似物。偶联物在另一方面，本发明涉及一种偶联物，含有前面所定义的肽和免疫原或含有免疫原的载体。优选地，如前面所定义的肽的C-末端连接于免疫原或含有免疫原的载体。根据本发明的偶联物可以用于改进种类广泛的疫苗，包括防御和/或治疗传染性疾病(例如，病毒或细菌疫苗)和(非病毒性的)癌症(例如肿瘤疫苗)的疫苗。例如，本发明可以方便的应用于抗如HIV，Ebola和SARS病毒的疫苗，防止如疟疾的寄生性疾病并且抵御如多重耐药金黄色葡萄球菌(MRSA )和多重耐药结核菌的细菌。重要的是，利用本发明的肽引起抗破伤风的免疫保护并非为本发明的意图。准确的说，本发明的肽以循环的抗TTd或抗TTx抗体结合，优选强烈结合本发明的肽的的形式用于具有抗破伤风的预先存在的免疫的受试者中。本发明的肽用于具有抗破伤风的预先存在的免疫的受试者中用于运送免疫原和/或含有免疫原的载体到抗原提呈细胞(APC)以诱导和/或增强受试者抗该免疫原的能力。本发明的偶联物中的免疫原可以是肽，蛋白质片段，蛋白质，糖和/或它们的结合。在本发明的一个实施方式中，所述免疫原是肽，这里是指免疫原性肽，以区别于与抗-TTd或抗-TTx抗体结合的肽(TTd抗体结合蛋白)。本发明的免疫原性肽用于介导和/或加强免疫应答，优选为T细胞应答，由本发明的免疫原性肽中的T细胞表位所引发。由本发明的免疫原性肽介导和/或加强的优选的T细胞应答包括HLA I类限制性的细胞毒T细胞应答和HLA II类限制性的辅助体细胞应答中的至少一个。更优选地，所述T细胞应答同时由HLA I类限制性的细胞毒T细胞应答和HLA II类限制性的辅助体细胞应答组成，并且有利的是可以伴随有B-细胞应答。在一种实施方式中，本发明的免疫原性肽包括至少HLA I类表位和HLA II类表位，和/或至少HLA I类表位和HLA II类表位在至少两个不同的免疫原性肽中一起实施。许多公开的文献已经指出，CD4+T细胞与II类表位提呈树突状细胞(DC)紧随的进行相互作用正调节⑶40配体。⑶4+Th细胞通过其⑶40配体与位于DC上的⑶40相互作用导致DC的活化。活化的DC细胞显示上调的共刺激分子和分泌CTL-促进细胞因子，这不仅允许更多的由这种提呈MHC I类限制性表位的活化的DC引起的强的CD8+CTL应答，也允许更多的强的 CTL 记忆应答(Ridge 等 1998, Nature 393:474 ;Schoenberger 等 1998, Nature 393:480 ；Sun等2004，Nat. Immunol. 5:927)。为了强的抗肿瘤的CD8+CTL应答需要CD40在DC上表达伴随有长的(35个氨基酸)肽在Zwaveling等(2002, J. Immunol. 169 :350)中公开。目前发现在没有包括有长表位的MHC II类表位诱发的CD4+Th应答时，被弓丨发的CD8+CTL应答的强度低，且存在时间短，完全缺乏⑶8+CTL记忆。在一种实施方式中，本发明的免疫原性肽包括多于一个HLA I类表位和/或多于一个HLA II类表位，和/或多于一个HLA I类表位和/或多于一个HLA II类表位在至少两个不同免疫原性肽中结合应用。在多于一个HLA I类表位和/或多于一个HLA II类表位出现在本发明的免疫原性肽中的情况下(或在至少两个不同的免疫原性肽中实施)，多种不
同表位可以各自来自于一个并相同来源抗原，或者它们可以来自于多于一个的不同来源抗原。在它们来自于多于一个的不同来源抗原时，该多种抗原可以各自来自于一个和相同的病原体或相同的肿瘤/肿瘤细胞，或者他们可以来自于多于一种的不同病原体或来自于多于一种的肿瘤/肿瘤细胞。来自于传染性因子(病原体)的抗原或肿瘤细胞可以衍生HLAI类表位和/或HLA II类表位，用于以下描述的本发明的免疫原性肽。HLA I类提呈的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位以及HLA II类T辅助表位是在细胞内形成的，以已经定义的细胞内机制和序列的形式。首先，定义T细胞表位的主导事件为表位(或表位前体)通过细胞溶质肽酶的酶解从本发明的免疫原性肽的侧面蛋白区域释放。多种肽酶，细胞溶质和/或非细胞溶质肽酶(如内质网肽酶)可以参与免疫原性肽中表位从其侧面区域的蛋白水解释放。这种细胞溶质肽酶包括例如多催化蛋白酶体(Rock等2004，Nat. Immunol. 5:670),其可能参与CTL表位N-末端以及C-末端的形成。在特定的情况下，蛋白酶体经常参与CTL精确的C-末端的形成。由于许多氨基末端外肽酶(exo-peptidases)(如ERAP1，嘌呤毒素敏感性氨基肽酶，霉菌素水解酶及其它)位于细胞质和内质网(ER)并且这些剪切酶(trimmingenzymes)有将N-末端延长的表位前体剪切为其精确的长度的能力，T细胞表位的氨基-末端的形成在一定程度上是可变的。其他参与加工来自于免疫原性肽的表位的肽酶包括如苯乙肼裂解酶(nardilysin)。由于胞质甲拌磷寡肽(TOP) (EC
3.4. 24. 15)有通过释放3-5个氨基酸将C-末端延长的表位前体剪切为其精确长度的能力，T细胞表位的C-末端的产生可以在一定程度上改变。在一种实施方式中，本发明的免疫原性肽包括以串珠的形式排列的两个或更多个以上所描述的表位，借此表位(珠子)直接地连接在一起和/或通过连接序列连接。侧面相接或连接肽/表位的氨基酸序列优选包括本文所描述的嘌呤毒素可剪切位点。当嘌呤毒素可剪切位点为表位的一部分时，在本发明的免疫原性肽中与表位侧面相接或连接的中间隔氨基酸序列不需要出现。然而，在其他情况，不包括一个或更多个嘌呤毒素可剪切位点的间隔氨基酸序列，可以是长度为2、3、4、5、6、8、10、12、15或更多的氨基酸。间隔区氨基酸序列可以与或不与自然地侧面相连于其来源抗原的表位的氨基端序列相连。在本发明的免疫原性肽的进一步实施方式中，所述免疫原性肽含有不是自然产生的氨基酸序列，即在自然界中不存在但却是人类调节和/或设计的产物。在该实施方式中，免疫原性肽将含有一个或更多个如上面所定义的HLA I类表位和/或HLA II类表位，为此这种表位优选含有来自于传染性因子和/或肿瘤的自然氨基酸序列。然而，侧面相连和/或连接至少一个免疫原性肽中的表位和/或连接两个免疫原性肽中的表位的免疫原性肽中的至少一个氨基酸序列并非来自于(自然产生的或野生型)衍生该表位的抗原和/或连接/侧面相连氨基酸序列来自于与和其侧面相连的表位并不结合的抗原内的其他位点。在一个优选方式中，该本发明的免疫原性肽连接/侧面相连氨基酸序列含有如上所述的一个或多个蛋白酶切割基序。因此在根据发明的(疫苗)用于诱导T细胞应答的免疫原性肽可以由包括一个或多个HLA I类表位和/或HLA II类表位组成,这些表位可以与包括上面所述的蛋白酶剪切基序的氨基酸序列侧面相接或连接，蛋白酶剪切基序将指导表位从免疫原性肽的嘌呤毒素释放，在合适的I或II类MHC分子中用于将表位提呈于细胞表面。在进一步的实施方式中，本发明的免疫原性肽是合成肽。不可用的或浪费的多于100个氨基酸的自然蛋白质的可以在体外有效合成的相关短肽的应用对于医疗目的来说是高度优选的。对本领域技术人员来说，肽的化学合成是常规操作并且已知多种合适的方法。 本发明的一个方面因此也涉及通过化学合成或在重组宿主细胞中制造本发明的免疫原性肽的方法。肽的化学合成也克服了完整蛋白制造所伴随的问题，即难于标准化且需要广泛的提纯和质量控制标准。长度超过HLA I类和/或II类表位(如有以下所指出的长度)的免疫原性肽特别适用于作为疫苗复合物使用，这是由于它们有足够的长度去被专门的抗原提呈细胞所摄取，特别是DC，如W002/070006中所解释的，并且在含有HLA I和II类表位的细胞表面提呈发生前在DC细胞中被加工。所以，不利的通过在非抗原提呈细胞系统提呈极小的HLA I类表位的T细胞耐受的介导(如展示于Toes等，1996, Proc. Natl. Acad. Sci.美国93:7855和Toes等，1996，J. Immunol. 156:3911)，被通过采用本发明的有在此指出的长度的免疫原性肽避免(如Zwaveling等，2002，J. Immunol. 169:350所示)。为了清楚的目的，本发明的免疫原性肽优选包括HLA I类提呈的表位和HLA II类提呈的表位中的至少一个。这些表位中的每一个都是可提成的并且在经过本文所述的加工后将结合于出现于细胞表面的相应特异HLA分子。每个HLA表位可以因此被命名为HLA结合和/或可提成表位。本发明的免疫原性肽和/或合成免疫原性肽的长度优选为至少19、20、21、22、25、27、30、33、35、40或45个氨基酸并且优选为不多于100、80、60、50个氨基酸。本发明的偶联物中的本发明的TTd-抗体结合肽可以直接与免疫原偶联，或可选择地，该TTd-抗体结合肽可以与含有免疫原的药剂可接受的微载体(nanocontainers)(载体)偶联。在这种结合中，如该免疫原可以包裹于微载体中，例如纳米粒，病毒体，脂质体或纳米水凝胶，由此TTd-抗体结合肽优选与这种微载体共同偶联。这种与微载体的偶联可以直接的或通过任何已知的如鞘磷脂，聚乙二醇(PEG)或其他的多聚体的多聚体的偶联试齐U。美国专利No. 6，372，250描述了制备这种含有定向的(PEG)脂质体的制药组合物的细节。因此，在优选的实施方式中，根据本发明的偶联物是结合了制药可接受的载体或至少含有载体蛋白，微载体，脂质体，复合物系统，脂复合物系统，和聚乙二醇中的一种的偶联物。将本发明中的TTd-抗体结合肽与免疫原或含有免疫原的载体相结合的大量方法为本领域所公知。这种方法例如 Hermanson (1996, BioconjugateTechniques, AcademicPress)在U. S. 6，180, 084和U. S. 6，264,914中描述的，并且包括如广泛应用于应用免疫学中的将半抗原与载体蛋白连接的方法(见Harlow和Lane, 1988，" Antibodies:Alaboratory manual" ,Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。被认可的是，在一些情况下，TTd-抗体结合肽或免疫原可以失效或在依靠偶联的情况下发挥作用，如，在偶联过程或这里应用的化学基团。然而，本领域技术人员获得多种偶联的方法后可以找到一种不影响或最少影响本体的功效或功能的偶联方法。合适的将肽与免疫原或载体偶联的方法包括例如碳二亚胺偶联(Bauminger和Wilchek, 1980, Meth.Enzymol. 70:151-159)。可选择地，免疫原或载体可以以Nagy等Proc. Natl. Acad. Sci.美国 93:7269-7273(1996);和 Nagy 等·，Proc. Natl. Acad. Sci.美国 95:1794-1799(1998)所描述的与TTd-抗体结合肽偶联，其中的每一个通过引用的方式结合于本申请中。其他的可能合适的用于偶联的方法为例如高碘酸钠氧化接着合适反应物的烷基化还原以及戊二醛交联。其他用于交联的便捷的方法为通过施陶丁格连接(Staudinger ligation),通过施陶丁格-贝尔托齐连接(Staudinger-Bertozzi ligation),通过利用硫代酸酯的化学偶联，通过[2+3]-偶极环加成反应(点击化学)，通过二硫化物桥连，以及此类的方法。特别有益的偶联的方式可以在不仅TTd-抗体结合肽而且免疫原或载体也是(多)肽的情况下应用。在这些情况下两个个体可以以同时含有TTd-抗体结合肽和免疫原肽或载体的单个(多)肽链 的形式合成。除共价键外，根据本发明的偶联物中免疫原或载体也可以通过非特异性的或特异性的蛋白-蛋白相互作用，非共价键结合和/或配位化学键直接偶联于TTd-抗体结合肽分子，这种偶联可以通过连接于免疫原或载体以及TTd-抗体结合蛋白的间隔或连接体被随意的影响。在优选的实施方式中，根据本发明的偶联物含有1-20，更优选含有至少2、3、4、5、
6、7、8、9、10并且少于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个结合于抗原、免疫原或含有抗原或免疫原的载体的肽。更优选地，所述偶联物含有2-20，更优选含有2-15、2-10、2-5，最优选含有3或4个结合于抗原、免疫原或含有抗原或免疫原的载体的肽。在所述偶联物含有含有抗原或免疫原的载体以及肽时，肽的数目可以比20高很多，例如多于100、200、300、400、500，优选少于 800、700、600。主要含有肽的本发明的偶联物优选是可以溶解于生理可接受的水溶液中(如PBS)包括不多于60、50、40、35、20、10、5或0%DMS0。在这种溶液中，优选的偶联物在浓度至少为每毫升O. 5、I、2、4或8mg偶联物时是可溶的。可选地，本发明的多于一种的不同偶联物的混合物在浓度至少为每毫升O. 5、1、2、4或8mg肽的此种溶液中是可溶的。预防和治疗用途在另一方面，本发明涉及根据本发明的作为药剂的偶联物。更为优选地，本发明涉及以上所定义的用于在有破伤风毒素或破伤风类毒素抗体受试者中作为药剂使用的偶联物。在优选的实施方式中，根据本发明的药剂是预防或治疗疫苗，更为优选的是抗传染性疾病或癌症的药剂或治疗疫苗。在更优选的实施方式中，根据本发明的药剂用于之前已进一步定义的抗体介导的抗原祀向作用。而在另一方面，本发明涉及根据本发明的偶联物，用于防御或治疗受试者的癌症或传染性疾病。根据这个方面，本发明同样也涉及利用根据本发明的偶联物制造防御或治疗受试者的癌症或传染性疾病的药剂。因此本发明的偶联物中的免疫原可以含有广泛的来自于肿瘤和病原体(传染性因子)的 HLA I 类和 / 或 II类表位。如肿瘤抗原如 MAGE、BAGE，、RAGE、GAGE、SSX_2、NY-ESO-1、CT-抗原、CEA、PSA、p53、XAGE和PRAME但同时有病毒介导的肿瘤抗原，包括人类乳头状瘤病毒(HPV)、卡波西氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、爱泼斯坦巴尔病毒诱导的淋巴瘤(EBV)。其他可以衍生本发明中应用的表位的肿瘤病原体的例子是已知的伴随癌症的多个广泛表达的自身抗原，包括如p53、MDM-2、HDM2和其他在p53通路中发挥作用的蛋白，如生存素、端粒末端转移酶、细胞色素P450亚型IBl、Her-2/neu和⑶19以及所有称为持家蛋白的分子。可以用本发明给予治疗的癌症选自于下面所列出的肺、结肠、食道、卵巢、胰腺、皮肤、胃、脑和颈、膀胱、肉瘤、前列腺、肝细胞、脑、肾上腺、乳腺、子宫内膜、间皮瘤、肾、甲状腺、血液、良性肿瘤、黑色素瘤、副甲状腺、子宫颈、神经母细胞瘤、维尔姆斯瘤、睾丸、脑垂体和嗜铬细胞瘤癌症。此外，本发明的偶联物中的免疫原可以含有来自于源自如病毒、细菌、真菌和原 生动物的传染性因子的病原体的HLA I类和/或II类表位。引起感染或肿瘤的可以衍生来自于抗原的表位的致病病毒的例子包括肝炎(A、B或C)、肝炎病毒(如VZV、HSV- I、HAV-6、HSV- II和CMV、爱泼斯坦巴尔病毒)、腺病毒、SV40病毒(引起间皮瘤)、流感病毒、虫媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疫病毒、风疫病毒、细小病毒属、牛痘病毒、人T淋巴细胞白血病(HTLV)病毒、登革热病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒、虫媒脑炎病毒(arboviralencephalitis virus)和人类免疫缺陷病毒(HIV病毒，如I和II型)，人乳头状瘤病毒(HPV)感染，更为详细的HPV高肿瘤风险型，包括HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58,59和68型。可以衍生来自于病原体的表位的引起感染的病原微生物包括李斯特菌属(Listeria),埃希氏菌属(Escherichia),衣原体属(Chlamydia),立克次氏体细菌(Rickettsial bacteria),分歧杆菌(Mycobacteria),葡萄球菌(Staphylococci),链球菌(Streptocci)，肺炎(双)球菌(Pneumonococci)，脑膜炎球菌(Meningococci)，淋球菌(Gonococci),克雷伯菌属(Klebsiella),变形杆菌属(Proteus),沙雷氏菌属(Serratia),假单胞菌书(Pseudomonas),军团兵杆菌属(Legionella),白喉(Diphtheria),沙门氏菌属(Salmonella)，杆菌(Bacilli)，引起霍乱、破伤风、食物中毒、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病和淋巴疾病的细菌。可以衍生来自于病原体的表位的引起感染的病原真菌包括念珠菌属(Candida)(如白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)),新型隐球菌(Cryptococcus neoformans),曲霉(Aspergillus)(如烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)),毛霉菌目(Mucorales)真菌(毛霉属(Mucor)、犁头霉属(Absidia)、根霉菌属(Rhizopus)),申克氏孢子丝菌(Sporothrixschenkii),皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis),巴西芽生菌(Paracoccidioidesbrasiliensis),粗球抱子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞衆菌(Histoplasmacapsulatum)ο可以衍生来自于病原体的表位的引起感染的病原寄生虫包括痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica),结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli),福氏耐格里阿米巴(Naegleria, Fowleri ),棘阿米巴蜀(Acanthamoeba sp.),贾第虫属(Giardia Iambia),隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.),卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii), _原虫属(Plasmodium vivax),巴贝虫属(Babesia microti),布氏维虫(Trypanosomabrucei),克氏锥虫(Trypanosoma cruzi ),利什曼原虫属(Leishmaniadonovani ),丐形虫属(Toxoplasmagondii)和痕原虫(Plasmodium falciparis)。在优选的实施方式中，受试者有抗破伤风毒素或破伤风类毒素的抗体。可选择地或与另一实施方式结合，在本发明的优选实施方式中，所述药剂为用于预防或治疗的疫苗。可选择地或与其他实施方式结合，在本发明的优选实施方式中，所述方法进一步包括提供抗体来诱导针对破伤风毒素的免疫应答。优选地，用于诱导免疫应答的疫苗的施用至少在施用偶联物的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多周前。优选地，所述疫苗为TTcL
在另一实施方式中，所述偶联物与Tetaquin预混合以构建免疫复合物并随后施用。在接种试验中，对受试者进行TTd免疫的预处理很有可能增加抗TTx的抗体水平。在优选的实施方式中，所述药剂用于如上定义的抗体介导的抗原靶向作用。在另一方面，本发明也涉及治疗或预防癌症或传染性疾病的方法，该方法包括给受试者使用根据本发明的受试者所需的有效量的偶联物。在优选实施方式中，接受治疗的受试者有抗破伤风毒素或破伤风类毒素的抗体。在更优选的实施方式中，所述偶联物是与药剂可接受的载体共同施用的。药物可接受的稳定剂、渗透剂、缓冲剂、分散剂和类似的物质也可以混合进含有本发明的偶联物的药剂组合物中。优选的形式取决于施用和治疗应用的预期模式。药物载体可以是适于将偶联物传送给受试者的任意相容的、非毒性的物质。用于肠胃外给药的药物可接受的载体的例子是利用O. 9%的无菌NaCl溶液或5%葡萄糖任意添加20%白蛋白。肠胃外给药必须是无菌的。施用偶联物的肠胃外路径为根据已知的方法，如注射或通过静脉注射，腹膜内注射，肌肉注射，动脉注射或内部损伤的方式注入。根据本发明的偶联物优选通过推注的注射方式给药。典型的内部损伤注射组合物可以制造成含有，例如，I-IOml磷酸盐缓冲液和I至100 μ g，优选10至300 μ g (抗原蛋白的)本发明偶联物。制备肠胃外的药物组合物的方法在本领域是公知的并且在多种来源中有更为详细的描述，包括，例如，Remington’ sPharmaceuticalScience (15th ed. , Mack Publishing, Easton, PA, 1980)(通过全文参考的方式结合于本文)。在进一步的实施方式中，根据本发明的药物组合物进一步含有至少一种免疫应答引发化合物或佐剂。有益地，根据本发明的药物组合物可以另外含有一种或更多种合成佐齐U。这些佐剂可以与本发明的药物组合物混合或单独的施用于被治疗的动物或人类。特别优选地，已知这些佐剂通过Toll样受体发挥作用。能够活化内部免疫系统的免疫修饰复合物，可以经Toll样受体(TLR’ S)特别好地激活，包括TLR’ sl-10和/或通过RIG-I (可受维甲酸诱导的基因-I)蛋白和/或通过内皮素受体。能够活化TLR受体和修饰和诱导的化合物在本领域是有很好的记载的。TLRl可以被细菌脂蛋白和其乙酰化物所活化。TLR2可以另外被革兰氏阳性菌糖脂、LPS、LPA、LTA、菌毛、外膜蛋白、来自于细菌或宿主的热休克蛋白以及分支杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖所激活。TLR3可以被dsRNA所激活，特别是病毒来源的，或化学化合物聚合物(I:C)。TLR4可以被革兰氏阴性菌LPS、LTA、来自于宿主或细菌的热休克蛋白、病毒衣壳或包膜蛋白、紫杉醇或其衍生物，含有透明质酸的寡糖类和纤连蛋白所激活。TLR5可以被细菌鞭毛或鞭毛蛋白所激活。TLR6可以被分支杆菌脂蛋白和B族链球菌热不稳定因子(GBS-F)或葡萄球菌调控蛋白所激活。TLR7可以被咪唑并喹啉激活。TLR9可以被非甲基化的CpG DNA或染色质-IgG复合物所激活。特别地，TLR3，TLR7和TLR9在介导抗病毒感染的内部免疫应答中起重要作用，能够活化这些受体的化合物特别优选应用于治疗的方法和根据本发明的组合物或药剂。特别优选的佐剂包括但不限于，合成制造的化合物，包括dsRNA、聚(I:C)、能够诱导TLR3和TLR9受体的未甲基化的CpG DNA、IC31、IMSAVAC,Montanide ISA-51 (Seppic 7生产的佐剂，法国)。其他优选的免疫修饰化合物是T细胞附着抑制剂，更优选地，内皮缩血管肽受体抑制剂如BQ-788 (Buckanovich RJ等，Ishikawa K,PNAS (1994) 91 :4892)。BQ-788是N-顺式-2，6-二甲基-哌啶子基羰基-L-Y -甲基亮氨酸-D-1-甲氧基擬基色氨酸-D-正亮氨酸(N-cis-2, 6-dimethyl-piperidinocarbonyl-L-gamma-methy I leucy l-D-l-methoxycarbony ltryptophany 1-D-nor leucine) ο 然而任何 BQ-788的衍生物或修饰的BQ-788化合物也包括在本发明的范围内。在另一优选实施方式中，合成佐剂化合物物理连接于本发明的肽或免疫原性肽。物理连接于包括肽的HLA I类和HLA II类表位的佐剂和共刺激化合物或功能基团通过对抗原提呈细胞(尤其是树突状细胞)进行 共刺激提供增强的免疫应答，所述抗原提呈细胞内化，代谢和展示抗原。优选地，所述偶联物是预防或治疗性的疫苗。可选择地，或与一种或其他实施方式结合，在本发明的一种实施方式中，治疗的方法进一步包括在使用偶联物之前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多周前使用疫苗诱导抗破伤风类毒素的免疫应答。优选地，该疫苗为TTd。优选地，具有抗破伤风毒素或破伤风类毒素的抗体的受试者已用破伤风类毒素免疫过，已经具有用于破伤风的暴露后的预防和/或已患有破伤风。可选地或与本发明的其他实施方式结合，根据本发明的治疗癌症的方法可以进一步包括其他治疗方法，其他治疗方法的例子可以与根据本发明的治疗方法结合来增强化学疗法、放射疗法(也称放疗、X-射线治疗、辐照治疗)和/或外科手术。本领域技术人员，通常是医学医生，将了解对某一特殊情况何种治疗方法是合适的。在本文和本权利要求中，动词“含有”(to comprise)及其结合用于非限制性的意义用于表示该词语之后的事项均被含有，但也并不排除没有特意提到的事项。另外，涉及一个元素时，不定冠词“一个”或“一种”并不排除存在多于一个的元素的可能，除非语境中明确要求有一个或仅一个元素。因此不定冠词“一个”或“一种”通常表示“至少一个”。本说明书中参考引用的所有专利和文献特此通过全文参考结合于本文。以下提供的实施例仅用于说明的目的，并不用于以任何方式限制本发明范围。


图I抗体介导的抗原祀向作用图解。应当注意的是多聚化(三折叠(tree-fold))的水平仅是一个说明。图2小鼠的脾和淋巴结中被标记的T细胞的OVA特异性增殖。符号代示单个小鼠。统计分析显示抗TNP抗体介导的OVA特异性T细胞增殖显著区别于其他组P〈0. 001。图3来自于TTx α -链的22-mer肽在Tettox ELISA中的测试结果。
图4来自于TTx β -链的22-mer肽在Tettox ELISA中的测试结果。图5 单个血清 α31、β 18、β 32、β41, β 48，β 54，β 55 使用 Tettox ELISA 的测试结果。图6合成核心复合物26的合成图解。图7合成构建体(construct) 33的合成图解。图8 构建体 33 的去卷积(deconvoluted)质谱谱图，MWcalc=13, 153. I,MWobs=13, 154. O。图9用于SIINFEKL特异性⑶8+T细胞的流术引流淋巴结，利用SINKEKL-四聚体(左侧板)和SINFEKL特异性细胞因子分泌试验(右侧板)。淋巴结来自于用有(+AB)或没有 (-AB)的构建体33接种的并用TTE特异性抗体静脉注射的小鼠或来自于未经处理的小鼠(阴性的)。实施例I、材料和方法I. I、一般程序肽合成肽的合成在复合合成器上进行(Syro II，MultiSyntech)。带有适当的Fmoc保护的氨基酸(10 μ mol)的预装载的Tentagel S Ac树脂(RappPolymere)用NMP(3x0. 8ml)清洗并且用有20%哌啶的NMP (3x3min,0. 8ml)处理。树脂用NMP (6x0. 8ml)洗涤。树脂中加入Fmoc-氨基酸(6当量，O. 6M于NMP中)，PyBOP (6当量，0.67M于NMP中)和NMM (12当量，33%溶解于NMP中)。偶联反应进行90分钟并不时震荡且在偶联结束时用NMP (6x0. 8ml)清洗树脂。用Iml含有5%水的TFA处理树脂2. 5小时。当W出现于肽中时，5%巯基乙磺酸也被加入到切割混合物中。在C出现于肽中时，切割混合物在沉淀之前用两滴三乙基硅烷处理。肽用9ml乙醚/戊烷1/1 (v/v)沉淀并且离心分离。沉淀物被分离，在水或水/乙酸中溶解并冻结获得白色固体。肽的纯度用LC-MS(Acquity,Waters)检查且分子质量在Voyager DE-Pro (Perseptive Biosystems)上石角定。I. 2、Tettox ELISA 实验方案抗生蛋白链菌素包覆的96孔板(Euro-Diagnostica)用含有5%BSA (200 μ I/孔，Ih,室温)的PBS封闭。孔板用含有O. 05%吐温20的PBS洗3次。生物素化肽的包覆用100 μ I/孔的溶解有2 μ g/ml的生物素化肽的含有1%BSA的PBS在室温孵育lh。孔板用含有O. 05%吐温20的PBS清洗3次。孔用100 μ I已经以800χ稀释于含有1%BSA的PBS溶液中的TetaQuin或已经以IOOx稀释于含有1%BSA的PBS溶液中的TetaQuin，在室温下孵育Ih。孔板用含有O. 05%吐温20的PBS洗3次。每个孔在室温用辣根过氧化物酶结合的IgG抗体(鼠抗人 IgG-HRP 单克隆，克隆 G18-145，cat no 555788, Becton Dickinson, 100 μ I/孔的IOOOx溶解于含有O. 05%吐温20的PBS)孵育lh。孔板用含有O. 05%吐温20的PBS洗3次。用2，2'-连氮基-双- (3-乙基苯并噻唑啉磺酸)进行洗涤，ABTS+H2021/1000，100 μ I/孔。光密度在415nm用BI0-RAD，model680，全自动定量绘图酶标仪检测。I. 3、典型的偶联物的合成在本例中描述了含有3个TT-表位和一个卵清蛋白表位的偶联物的合成。系统在这样的方式中发展TT-和OVA-表位的偶联可以在没有铜离子的情况下在室温进行。首先，TT-表位的三拷贝已经用间隔区延长并且半胱氨酸残基与核心复合物26偶联。在第二步中OVA-表位已用间隔区延长并且偶联于叠氮化物基团获得构建体33。对本领域技术人员来说这只是合成根据本发明的构建体的一个例子，且本例并不用于限制本发明。I. 3. I复合物26的合成参见合成核心复合物26的合成图解62，2_ 双-溴化甲烧 _3_(三苯甲基氧)丙烧-I-醇(2，2-bis-bromomethane-3-(trityloxy)propan-l-ol) (16):商业上可用的二溴化物 15 (131g, 500mmol)溶解于批啶(IOOOml)并加入三苯甲基氯(69. 7，250mmol),混合物搅拌过夜，在真空离心后残基在EtOAc中提取并且用H2O洗涤，有机物涂层在真空中MgSO4上干燥。题述复合物的柱色谱法(PE-Tol-EA 50-50 — 0-99-1)中为淡黄色油(116g，93%)。(Rf:PE-EA 70-30=0. 78)2，2_双-溴化甲烷-I-苯二甲酰亚氨基-3-(三苯甲基氧)丙烷(2，2-bis- bromomethane-1-phthaIimido-3- (trityloxy)propane ) (17):16(116g,232mmol)在THF (1160ml)中共蒸发溶解并且在氩气中30min去除。PPh3 (76g，290mmol)和酞酰亚胺(42.6g，290mmol)在氩气气氛下加入。当所有固体溶解后逐滴加入DEAD (133ml，290mmol)。过夜搅拌混合物并在真空浓缩。剩余残基在甲苯中提取并且副产品在_20°C下过夜重结晶。结晶余液在真空中浓缩并在Et2O中浓缩并且副产品在_20°C下过夜重结晶。结晶余液在真空中浓缩。柱色谱法(Tol-EA 100-0 — 98-2)中为淡黄色油(76. 6g，52% 和 80g 的非纯品)。(RF: PE-EA 80-20=0. 53)，1H NMR (400MHz, CDCl3) : δ =3. 35 (s, 2H，CH2CH2OTr)，3. 57 (d, 2H, J=10. 8Hz, CH2CH2Br)，3. 66 (d, 2H, J=10. 8Hz, CH2CH2Br)，3. 95 (s, 2
H,CH2CH2NPhth)，7. 22-7. 31 (m, 9H, Harom)，7. 24-7. 44 (m, 6H, H arom)，7. 71-7. 73 (m, 2H, Harom)，7. 83-7. 86 (m, 2H, H arom) · 13C 匪R (100MHz, CDCl3) : δ =37. 2 (CH2CH2Br), 41. 3 (CH2CH2NPhth)，43. 8 (Cq CC4H8)，64. 9 (CH2CH2OTr)，87. 3 (Cq OTr), 123. 4 (CHarom), 127. 2 (CHarom), 127. 9(CH arom), 128. 2(CH arom), 128. 8(CH arom), 131. 9 (Cq arom), 134. I(CHarom), 143. 2(Cq arom), 168. 7(C=0 Phth).2，2-双-叠氮甲烷-I-苯二甲酰亚氨基-3_(三苯甲基氧)丙烷(2，2-bis-azidomethane-l-phthalimido-3-(trityloxy)-propane) (18) 17(76. 6g, 121mmol)溶角军于DMF(IOOOml)。在此溶液中加入NaN3 (39g，600mmol)和LiCl (cat)。该混合物回流6小时并在真空中浓缩。残基在EtOAc中提取并且用H2O洗涤、有机物涂层在真空(66. Ig,98%)中 MgSO4 上干燥。(RF:PE-EA 80-20=0. 57)，1H NMR(400MHz, CDCl3) : δ =3. 13 (s, 2H, CH2CH20Tr)，3. 46 (d, 2H, J=12. 4Hz, CH2CH2N3), 3. 51 (d, 2H, J=12. 4Hz, CH2CH2N3)，3. 76 (s, 2H, CH2CH2NPhth)，7. 22-7. 79 (m, 19H, H arom). 13C NMR(100MHz, CDCl3) : δ =40. 2 (CH2CH2NPhth)，44.4 (Cq CC4H8)，52. 9 (CH2CH2N3)，63. 4 (CH2CH2OTr)，86. 9 (Cq OTr)，123. 2 (CH arom)，127. 2 (CHarom), 127. 9(CH arom), 128. 2(CH arom), 128. 8(CH arom), 131. 9(Cq arom), 134. I(CHarom), 143. 3(Cq arom), 168. 5(C=0 Phth).1_氣基_2，2-双-置氣甲烧-3- (二苯甲基氧)丙烧(I-amino-2, 2-bis-azidomethane-3- (trityloxy) -propane) (19) : 18 (50. lg, 90mmol)在氩1气气氛中从干燥EtOH(450ml)和联氨(6. 55ml，135mmol)中提取，反应震荡3天(在此过程中形成固体)直至TLC分析显示起始材料完全转变为低运转点(running spot)。固体用冷的EtOH过滤和洗涤。重组有机层在真空中提取。柱色谱法(PE-EA 75-25 — 25-75)中淡黄色油(24. 8g, 64%)。(RF: DCM-MeOH 95-5=0. 44)，1H NMR (400MHz, CDCl3) : δ =2. 62 (s, 2H, CH2CH2NH2)，2. 99 (s, 2H, CH2CH2OTr)，3. 38 (s, 4H, CH2CH2N3)，7. 13-7. 43 (m, 15H, H arom) · 13C NMR (IOOMHz, CDCl3) : δ =42. I (CH2CH2NH2)，44. 6 (Cq CC4H8)，52. I (CH2CH2N3), 61. 4 (CH2CH2OTr)，86. 5 (CqOTr)，126. 9(CHarom)，127. 2(CH arom)，128. 2(CH arom)，143. 4 (Cq arom).I-(叔丁氧擬基氨基)-2，2-双-(叔丁氧擬基氨基)甲基-丙基-3-醇(l_(tert-butoxycarbonylamino)-2, 2_di-(tert-butoxycarbonylamino)methyl-propan-3-ol)
(20):19(24. 8, 58mmol)溶解于 THF(580ml),而后加入 H2O(29ml)和 PPh3 (33. 3g,127. 6mmol)。该混合物物在室温下震荡过夜并加热至50 V再次震荡6小时(Rf : EtOH t-Bu0HH2O AcOH: 4-2-2-1=0. 42)。该反应在真空浓缩并在H20提取(580ml)并且过滤。在该水溶液中加入 37%HCL (29ml，348mmol)并震荡 3 天(RF:Et0H t-BuOH H2O AcOH:4-2-2-1=0. 05)。该反应在真空浓缩并与H2O共蒸发3次以去除大部分的HCL。该残基在H2O中提取并用DCM洗涤。水层在真空中浓缩。该残基在H2O (220ml)和ACN (220ml)中提取在溶液中加入 NaOH(3溶积克分子溶液于H2O中)直至pH为7。而后将NaOH(60ml，176mmol，3溶积克分子溶液于H2O中)以及Boc2O (38. 4g，176mmol)加入该混合物震荡过夜。分离该层并且水层用EtOAc洗2遍。有机层在MgSO4上结合干燥并且在真空浓缩。由PE/EtOAc结晶题述的复合物为白色固体(12. 9g，51%)。(RF:PE-EA 80-20=0. 53)，1H NMR(400MHz, CDCl3) : δ =1 45 (s, 27Η, CH3Boc)，2. 82 (d, 6H, J=6. 8Hz, CH2CH2NH)，3. 13 (d, 2H, J=4. 4Hz, CH2CH2OH), 4. 32 (t, 1H, J=4. 4Hz, OH)，5. 78 (t, 3H, J=6. 4Hz, NH) · 13C NMR (100MHz, CDCl3) : δ =28. 3 (CH3Boc)，39.0 (CH2CH2NH)，46. I (Cq CC4H8)，60. 3 (CH2CH2OH)，79. 7 (Cq Boc)，157. 8 (C=0 Boc).I-(叔丁氧擬基氨基)-2，2_双-(叔丁氧擬基氨基)甲基_3_丙酸(I-(tert-butoxycarbonylamino)_2，2-di-(tert-butoxycarbonylamino)methyl-3-propanoic acid)
(21):20(12. 2g, 28mmol)在 EtOAc (280ml)、MeCN(280ml) ^PH20(280ml)中悬浮。在该悬液中加入NaIO4 (24. lg, 113mmol)和催化剂量的RuCl3从黑色变为橘黄色。当该悬液变清澈TLC分析显示完全转变为低的运转点时分离该有机层并用EtOAc洗水层。在结合的有机层中加入EDTA(104g，280mmOl)并震荡过夜。分离该层并用Na2S2O3洗有机层。有机层在MgSO4上干燥并且在浓缩过程中题述复合物结晶为白色固体(8. 77g，70%)。(RF:PE-EA-AcOH50-50-3drops=0. 77)，1H NMR (400MHz, CDCl3) : δ =1. 43 (s, 27Η, CH3Boc)，3. 25 (d, 6Η, J=6. OHζ, CH2CH2NH)，5. 78 (bs, 3Η, NH)，9. 59 (vbs, 1Η, C00H) · 13C NMR (100MHz, CDCl3) : δ =28. 3 (CH3Boc), 40. 31 (CH2CH2NH)，53. O (Cq CC4H8)，79. 8 (Cq Boc)，157. O (C=0 Boc)，176. 5 (C=0 C00H).带有氨基PEG-间隔区的Boc保护的二-氨基-2，2_ 二甲基丙酸(22):在気气气氛下于 DCM(20ml)和 Et3N(0. 21ml, I. 5mmol)中的溶液 21 (0. 447g, I. Ommol)力口入HATU(0. 380g, I. 5mmol),反应震荡15min并加入2-[2_(2_氨基乙氧基)乙氧基]乙基-I-胺(2_ [2_ (2-aminoethoxy) ethoxy] ethan-l-amine) (I. 46ml, 10mmol)。在震荡过夜后用H2O洗涤混合物并且该有机层在MgSO4上干燥并且在真空中浓缩。柱色谱法(DCM/MeOH100-0 — 90-10)中题述的复合物为无色油状(0. 293g, 51%)。(RF:DCM-MeOH 90-10=0. 15)，1HNMR (400MHz, CDCl3) : δ =1. 44 (s, 27H, CH3Boc), 2. 91 (t, 2H, J=4. 8Hz, CH2peg)，3. 23 (d, 6H, J=6. 4Hz, CH2Scaffold)，3. 40 (m, 2H, CH2peg)，3. 46 (bs, 2H, NH2)，3. 56 (t, 4H, J=5. 2Hz, peg)，3.63 (bs, 4H, peg)，5. 88 (bs, 3H, NH Boc)，7. 33 (bs, 1H, NH peg amide) ; 13C NMR (100MHz, CDCl3)
:δ =28. 2 (CH3Boc)，39. I (CH2peg)，41. I (CH2Scaffold)，52. 2 (Cq CC4H8)，69. 3 (2x CH2peg)，7O. O (CH2Peg)，70. I (CH2peg)，72. I (CH2peg)，79. 6 (Cq Boc)，157. 0 (C=O Boc)，172. 6 (C=O pegamide).带有二苯基环辛炔(diphenylcyclooctyn) PEG间隔区的Boc保护的三-氨基-2，2- 二甲基丙酸(24):在氩气气氛下 DMF(13ml)和 Et3N(O. 27ml, I. 98mmol)中的 22溶液中(0.383g，0.662mmol)加入23 (O. 267g, O. 695mmol)。在对混合液震荡过夜后在真空下浓缩。尺寸排阻色谱法(Size exclusionchromatography) (LH20Me0H/-DCM 1-1)和随后的柱色谱法(DCM/MeOHlOO-O — 99-1)的题述复合物是无色的油(O. 125g，33%)。(Rf: DCM-MeOH 90-10=0.9); NMR (400MHz, CDCl3) : δ =1. 44 (s, 27H, CH3Boc), 2. 89 (m, 1Η,CH2Octyn), 3. 17 (d, 1Η, J=13. 6Hz, CH2Octyn)，3. 23-3. 25 (d, 6Η, J=6. 8Hz, CH2Scaffold)，3.40-3. 45 (m, 4Η, CH2peg)，3. 58-3. 60 (m, 4Η, CH2peg)，3. 65 (bs, 4Η, CH2peg)，5. 50 (bs, 1H, CHoctyn), 5. 50 (bs, 3H, NH Boc), 5. 81 (bs, I H, NHcarbamate), 7. 27-7. 37 (m, 8Η, Harom), 7. 52 (d, 1Η, J=7. 6Hz, NH peg amide) ; 13C NMR (IOOMHz, CDCl3) : δ =28. 3 (CH3Boc)，39. I (CH2peg)，40 9 (CH2peg), 41. I (CH2CC4H8)，46. O (CH2Octyn)，52. 2 (Cq CC4H8), 69. 21 (CH2peg)，69. 9 (2χ CH2Peg)，70. O (CH2peg)，70. 3 (CH2peg)，76. 6 (CH octyn)，79. 8 (CqBoc)，109. 9 (Cq Arom), 112. 8 (CqArom), 121. 2 (Cq Arom)，123. 7-129. 8 (CHarom), 151. I, 152. 2, 155. 5, 157. O (C=O Boc), 172. 6(C=0 peg amide).带有二苯基环辛炔PEG间隔区的马来酰亚胺丙酰功能化的三-氨基_2，2- 二甲基丙酸连接体(26):复合物24 (38mg，0. 047mmol)在氩气气氛(TC溶解于HCL浓度为4M的二恶烷(O. 47ml, I. 88mmol)中。该混合物允许冷却至室温。在LCMS分析(LCMS: 1090:13. 5min,RF6. 52min)表现出完全转化为三胺(6h)时该混合物在0°C完全灌注于Et2O中并接下来自旋。Et2O被缓慢排除残基在DCM (O. 1M)提取。在此悬浮物中加入马来酰亚胺丙酸OSu酯25 (O. 05g,0. 188mmol)和 Et3N(19y 1,0. 188mmol)。在 LCMS 分析后(LCMS: 1090:13. 5min，Rf: 7. 56min)显示出完成反应混合物直接利用柱色谱纯化(DCM/MeOH 100-0 — 96-3)提供黄色油状的题述复合物(O. 0124g，27%)。(RF:DCM-Me0H 90-10=0. 4) : NMR(400MHz, CDCl3):δ =1. 26 (bs, 6H)，2. 54 (bs, 6H)，3. 19-3. 45 (m, 6H)，3. 58-3. 82 (m, 14H)，5. 47 (s, I H), 6. 71(s, 6Η)，7. 29 (s, 8Η) ; 13C NMR (IOOMHz, CDCl3) : δ =29. 6，34. 2，34. 8，39. 2，39. 7，40. 9，46. I,50. 9，53. 4，69. O, 69. 9，70. 17，76. 6，109. 8，112. 8，121. 2，123. 7，125. 8，126. I, 126. 9，127.6，127. 8，128. O, 129. 9，134. 2，150. 9，155. 5，170. 4，171. 7，172. 2.I. 3. 2构建体33的合成见图7合成构建体33的合成图。F-I-G-I-T-E-L-K-K-L-E-S-K-I-N-K-V-F-A-A-K-Y-A-R-V-R-A-K-C(TTE-SH)(30)(SEQ ID NO:217)肽30在Tentagel S Ac树脂(Rapp, Tubingen)上利用固相肽合成。利用携带有酸不稳定侧链保护(所需的)的Fmoc氨基酸常规的偶联(I. 5h)。用PyBop和NMM进行活化。Fmoc脱保护用20体积％哌啶在NMP中进行。用NMP洗涤。从树脂上切除并且侧链脱保护用含有5%水和2%三乙基硅烷的TFA中进行。用rpHPLC进行纯化。用UPLC_MS(Acquity，Waters)对纯化的肽进行分析。叠氮己酰(Azidohexanoyl)-L-E-Q-L-E-S-I-I-N-F-E-K-L-A-A-A-A-A-K(OVAE)(31)(SEQ ID NO:217)
肽31的合成与肽30相似。用偶联叠氮己酸(azidohexanoic acid) /PyBop/NMM来引入叠氮己酰基团。从树脂的切除和侧链脱保护用含有5%水的TFA进行。构建体33TTE肽30 (4. 8mg, I. 44 μ mol)在氩气气氛下在除气的水(800 μ I，微孔)中溶解，通过加入NaHC03(0. 5Μ，20μ 1，除气)将pH设定至6。在该溶液26(0. 234mg，0. 24μπιο1)中加入MeCN(23 μ I)。该混合物在质量光谱测定法(QTof)显示完成26到32的转化后震荡3h。另外，由于曾用了过量TTE-SH，TTE-SH和相关二硫化物TTE-S-S-ETT可以检测得到。在此混合物中加入了 DMSO (400 μ 1，微孔)中的肽OVAE (31，O. 63mg，O. 289 μ mol)。根据质量光谱测定法(Qtof) —小时内32转变为33。混合物用HPLC纯化获得2. 7mg，0. 20 μ mol，83%。用质量光谱测定法分析产物并出现了预期质量(见图8去卷积质谱谱图，MWcalc=13, 153. 1，MWobs=13, 154. 0)。2、结果 2. I、小鼠中系统性抗原特异性T细胞启动效应用TNP-BSA重复免疫小鼠导致高滴度的抗半抗原TNP (TNP免疫的)的循环抗体或遗留未被免疫的小鼠(阴性的)。在1-2个月后所有小鼠注射首次用于实验用荧光染料CFSE标记的OVA-特异性CD8T细胞。在24小时后为小鼠注射单剂量的TNP-0VA。3天后处死小鼠且标记的T细胞的OVA-特异性增殖在脾脏和淋巴结中用流式细胞仪(图2)分析。符号代表单个小鼠。统计学分析显示抗-TNP抗体介导的OVA-特异性T-细胞增殖不同于其他组P < 0.001。因此，系统性抗体特异性T细胞引发效应可以被先前出现的抗半抗原-表位的循环抗体所促进。2.2、合成的TTx重叠肽由于人类没有抗TNP的循环抗体并且由于并不希望免疫人类来获得抗-TNP的循环抗体，本发明选择了一个通路，大多数人有抗该通路的循环抗体。发明人在重叠肽(长度为22个氨基酸残基，10个氨基酸重叠)中合成了 TTx的α和β链。在本研究中利用故乡合成法制造了 109个肽。所述肽合成有C-末端赖氨酸(生物素)由Ahx间隔区(氨基己酸)连接于肽。这些生物素肽可以连接于抗生蛋白链菌素ELISA板用于分析。肽在ELISA中显示用于结合Tetaquin中的抗体。Tetaquin是有大面板的全部有高的抗TTd抗体滴度的抗体的组合。TetaQuin在90%的人类IgG中存在(100-180mg/ml)并且可用的来自于Sanquin(Amsterdam，荷兰)。进行Elisa’ s，其中生物素肽独立的附加于抗生素蛋白链菌素包被的Elisa板上。对每个肽测试集中连续的TetaQuin以用于结合。在此方式，确定最佳结合肽。结果以ELISA的OD值来表示。这并不是绝对数值，只用于辨别一个测试中的不同肽。技术人员知晓OD值在多种测试中是变化的。表I :重叠肽TTx α和TTx β链
权利要求
1.一种偶联物，该偶联物含有与抗原、免疫原或者含有抗原或免疫原的载体偶联的肽，其中，所述肽含有 (i)具有氨基酸序列GITELKKL的SEQ ID NO :3中的至少10个氨基酸残基；或 (ii )与(i )中提供的氨基酸序列有至少80%序列一致性的氨基酸序列，并且其中，当将所述肽施用于来自至少10名已用破伤风类毒素接种的人类受试者的血清样本时，如在破伤风毒素或类毒素酶联免疫法中确定的，所述肽在至少50%的血清样本中通过来自于血清样本的抗体结合； 其中，所述肽不是破伤风毒素β链。
2.根据权利要求I所述的偶联物，其中，所述肽含有少于100个的氨基酸残基。
3.根据权利要求I或2所述的偶联物，其中，所述抗原、免疫原或者含有所述抗原或免疫原的载体偶联于所述肽的C-末端。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的偶联物，其中，2至20个肽结合于所述抗原、免疫原或者含有所述抗原或免疫原的载体。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的偶联物，所述偶联物作为药剂使用。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的偶联物，所述偶联物用于在受试者中预防或治疗癌症或传染性疾病。
7.权利要求1-4中任意一项所述的偶联物在制造用于在受试者中预防或治疗癌症或传染性疾病的药剂中的应用。
8.根据权利要求6所述的偶联物或根据权利要求7所述的应用，其中，所述受试者具有抗破伤风毒素或破伤风类毒素的抗体。
9.根据权利要求6所述的偶联物或根据权利要求7所述的应用，其中，所述受试者为在施用所述偶联物至少两周前已经被施用用于产生抗破伤风毒素的循环抗体的疫苗的受试者。
10.一种肽,所述肽含有 (i)具有氨基酸序列GITELKKLES的SEQID NO 3中的至少12个氨基酸残基；或 (ii)与(i)中提供的氨基酸序列有至少80%序列一致性的至少12个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中，当将所述肽施用于来自至少10名已用破伤风类毒素接种的人类受试者的血清样本时，如在破伤风毒素或类毒素酶联免疫法中确定的，所述肽在至少50%的血清样本中通过来自于血清样本的抗体结合； 其中，所述肽含有少于100个的氨基酸。
11.根据权利要求10所述的肽，所述肽具有 (i)如SEQID NO 4-24的任意一个中提供的氨基酸序列；或 (ii)与SEQID NO :4-24中提供的氨基酸序列有至少80%序列一致性的氨基酸序列，并且其中，当将所述肽施用于来自至少10名已用破伤风类毒素接种的人类受试者的血清样本时，如在破伤风毒素或类毒素酶联免疫法中确定的，所述肽在至少50%的血清样本中通过来自于血清样本的抗体结合。
12.根据权利要求11所述的肽，其中，所述肽具有SEQID NO :24中所提供的氨基酸序列或由SEQ ID NO 24中所提供的氨基酸序列组成。
13.根据权利要求10-12中任意一项所述的肽，其中，所述肽含有少于50个的氨基酸残基。
14.根据权利要求10-13中任意一项所述的肽，其中，所述肽在SEQIDNO :4或SEQ IDNO 24的C-末端含有另外的氣基酸残基。
15.根据权利要求14所述的肽，其中，所述另外的氨基酸残基不是衍生自破伤风毒素β链。
全文摘要
本发明涉及偶联物，所述偶联物含有具有氨基酸序列GITELKKL的至少10个氨基酸残基的肽，当所述肽施用于具有抗破伤风类毒素的抗体的受试者时，所述肽用于诱导有效的体液和细胞免疫应答。在一种实施方式中，本发明涉及预防性的或治疗性的疫苗，在另一种实施方式中，本发明涉及癌症或传染性疾病的治疗或预防。
文档编号C07K14/33GK102892431SQ201180024092
公开日2013年1月23日 申请日期2011年3月15日 优先权日2010年3月15日
发明者F·A·奥森多普, C·J·M·梅立夫, J·W·德瑞杰夫浩特 申请人:莱顿大学医学中心附属莱顿教学医院, 德国科技术基金会