专利名称：具有增强的或抑制的效应子功能的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体、融合蛋白和多肽。具体地讲，本发明涉及经设计的抗体和多肽，其包含协同地提供针对靶Fe受体的增强的选择性和结合亲和力的Fe区氨基酸取代。发明背景
抗体是对特定抗原具有结合特异性的蛋白质。天然抗体通常是大约150，000道尔顿的杂四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链都通过一个共价二硫键与重链相连，而不同的免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数量是不同的。每条重链和轻链也具有规律间隔的链内二硫桥。每条重链在其一端具有可变结构域(Vh)，随后是多个恒定结构域。每条轻链在其一端具有可变结构域(')，在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定氨基酸残基构成轻链可变结构域和重链可变结构域之间的界面。术语“可变的”是指以下事实可变结构域的某些部分在序列上于抗体之间差异很大并且负责各特定抗体对其特定抗原的结合特异性。然而，可变性并非均匀分布在整个抗体可变结构域内。它集中在轻链可变结构域和重链可变结构域两者中的被称为互补决定区(CDR)的3个区段中。保守性更高的可变结构域部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含4个FR，主要呈P -折叠构象，由3个⑶R连接，所述⑶R形成环连接，并且在某些情况下形成该3 -折叠结构的一部分。每条链的CDR通过FR紧密保持在一起，并与其它链的CDR —起促成形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但具有多种效应子功能。根据其重链恒定区的氨基酸序列的不同，可将抗体或免疫球蛋白划分为不同类别。有5大类免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且它们中的若干还可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4 ；IgAl和IgA2。对应于免疫球蛋白不同类别的重链恒定区分别称为a、S、e、Y和ii。在各种人免疫球蛋白类别中，已知仅人IgGl、IgG2、IgG3和IgM激活补体；并且人IgGl和IgG3比IgG2和IgG4更有效地介导ADCC。抗体经木瓜蛋白酶消化产生2个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，各有一个抗原结合位点，以及一个残留的“Fe”片段，该名称反映了其易结晶的能力。已经测定了人IgG Fe 区的晶体结构(Deisenhofer, Biochemistry 20:2361-2370 (1981))。在人 IgG 分子中，通过木瓜蛋白酶切割N-端到Cys 226而产生Fe区。Fe区对于抗体的效应子功能而言至关重要。
可将由抗体Fe区介导的效应子功能分为2类(1)在抗体与抗原结合之后发挥作用的效应子功能(这些功能涉及补体级联或携带Fe受体(FcR)的细胞的参与)；和(2)不依赖于抗原结合而发挥作用的效应子功能(这些功能赋予循环中的持久性和通过胞转作用而跨越细胞屏障转移的能力)。Ward和Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77-94(1995)。尽管抗体与必需抗原的结合具有中和作用，其可阻止外源抗原与其内源靶(例如受体或配体)的结合，但仅靠结合可能不能去除外源抗原。为了有效去除和/或破坏外源抗原，应赋予抗体与其抗原的高亲和力结合和有效的效应子功能两者。Fe 等体(FcR)
抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统细胞的相互作用引起各种反应，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)(综述可参见Daeron，Annu.Rev. Tmmun01. 15:203-234 (1997) ;Ward 和 Ghetie, Therapeutic Tmmuno1. 2:77-94(1995);以及 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Tmmuno1. 9:457-492 (1991))。若干抗体效应子功能由与抗体Fe区结合的Fe受体(FcR)介导。FcR按其对免疫球蛋白同种型的特异性来定义；IgG抗体的Fe受体称为Fe y R，IgE的称为Fe e R，IgA的称为Fe a R等等。在人类中已经鉴定了 Fe YR的3个亚类Fc YRI (⑶64)、Fe Y RII (⑶32)和Fe Y RIII (⑶16)。因为每一 Fe Y R亚类由2个或3个基因编码，并且由于可变RNA剪接导致形成多种转录物，所以Fe Y R同种型中存在着广泛多样性。编码Fe y RI亚类的3个基因(Fe y RIA、Fe y RIB和Fe y RIC)簇集在I号染色体长臂的lq21. I区；编码Fe y RII同种型的基因(Fe y RIIA, Fe y RIIB 和 Fe y RIIC)和编码 Fe Y RIII 的 2 个基因(Fe y RIIIA和Fe y RIIIB)都簇集在lq22区。这些不同FcR亚类在不同细胞类型上表达(综述可参见Ravetch 和 Bollard, Annu. Rev. Immunol. 19:275-290 (2001)。例如在人类，Fe Y RIIIB仅在嗜中性粒细胞上发现，而Fe YRIIIA则在巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞以及T细胞亚群上发现。要注意的是，Fe Y RIIIA是NK细胞上仅有的FcR，NK细胞是参与ADCC的细胞类型之一。Fe Y RI、Fc Y RII和Fe Y RIII是免疫球蛋白超家族(IgSF)受体;Fc Y RI在其胞夕卜结构域中具有3个IgSF结构域，而Fe Y RII和Fe Y RIII在其胞外结构域中只有2个IgSF结构域。另一类Fe受体是新生儿Fe受体(FcRn)。FcRn在结构上类似于主要组织相容性复合物(MHC)，由与P 2-微球蛋白非共价结合的a-链组成。Fe y RII (CD32)具有若干同种型即IIa, IIbl, IIb2、IIb3和He,并且是最广泛分布的人Fe Y R类型，在大多数种类的白细胞、树突细胞和血小板上都表达。FcyRII是低亲和力受体，仅与聚集IgG结合。它是能与IgG2结合的仅有的Fe Y R类别。Fe Y RIIa在包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞在内的多种细胞类型上表达，它可通过其ITAM基序与其它免疫球蛋白受体组合共同活化所述多种细胞类型。Fe y RIIa与细胞上连接的IgG抗体结合并导致这些细胞溶解。该过程称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。Fe y RIIb也是广泛表达的，但携带免疫受体的基于酪氨酸的抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM),其是Fe Y RIIb 的抑制效应所必需的。当它与表面免疫球蛋白通过Ab-Ag复合物而交联时，Fe YRIIb可通过引发负信号转导(negative signaling)而抑制B细胞激活。巨卩遼细胞和单核细胞通过Fe Y R的激活受到 Fe Y RIIb 的共同连接的抑制。(Armour 等(2003) “ Differential binding to humanFe y RIIa and Fe y RIIb receptors by human IgG wildtype and mutant antibodies (人IgG野生型和突变抗体对人Fe y RIIa和Fe y RIIb受体的差异结合)，” Mol. Immunol.，40:585-593)。经转染而同时表达Fe Y RIIa和Fe Y RIIb的细胞相对于只携带Fe Y RIIa的细胞而言显示出降低的吞噬，并且在Fe y RIIb-缺陷型小鼠中，抗肿瘤Ab的细胞毒性增力口。 (Hunter 等(1998) “ Inhibition of Fe y receptor mediated phagocytosis bynonphagocytic Fe y receptor (Fe y受体介导的吞卩遼受非吞曬Fe Y受体的抑制) ”Blood, 91:1762-1768 ;和 Cly nes 等(2000) “ Inhibitory Fe receptors modulate invivo cytotoxicity against tumour targets (抑制性Fe受体在体内调节针对肿瘤革巴的细胞毒性).”Nat. Med. 6:443-446)。因此，从 Fe Y RIIa 到 Fe Y RIIb 的 Fe Y R 相对结合亲和力的改变，例如将会抑制B细胞和或巨噬细胞和单核细胞的激活并且将可用于在炎性病症例如多种自身免疫性疾病中抑制免疫应答。相反，从Fe Y RIIb到Fe Y RIIa的Fe Y相对结合亲和力的改变将会导致ADCC增强并可用于例如在癌症治疗中增加对肿瘤细胞的杀伤。FcyRIII (CD16)具有两种同种型，其能够与IgGl和IgG3结合。Fe Y RIIIa对IgG具有中等亲和力并在巨噬细胞、单核细胞、NK细胞和T细胞亚类上表达。Fe Y RIIIb是低亲和力受体，其在嗜中性粒细胞上选择性表达。Fe y RIIIa,如FC y RIIa 一样，与连接细胞的IgG抗体结合并通过ADCC而导致这些细胞溶解。Fe Y RIIIa与结合在细胞表面的成簇IgG分子结合,而不与单体IgG结合。因此,仅当祀细胞被抗体包被时才发生ADCC。抗体包被的靶细胞与Fe y RIIIa结合，激活NK细胞而合成并分泌细胞因子例如IFN- y，以及释放其颗粒内容物，这些内容物介导该细胞类型的细胞溶解功能。通过将效应子功能从其它抑制性免疫应答转为诱导性ADCC并且反之亦然，改变抗体效应子活性，这对于优化各种疾病和病况的治疗结果而言是合乎需要的。Lazar等(2006) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 103:4005, Stavenhagen等(2007) Cancer Res.67:8882， Oganesyan 等(2008) Mol. Immunol. 45:1872, Veri 等(2007) Immunology,121:392，和 Shields 等(2001) J. Biol. Chem. 276:6591 公开了在该研究领域中的成果。Presta等人(美国专利6，737，056)公开了包含变体Fe区的多肽。所公开的变异是基于单一位置突变的。通过进行丙氨酸扫描，Presta等人公开了在位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439的单一位置Fe区氨基酸修饰；声称这些单一位置突变导致与Fe Y RII的结合降低。Presta等人也公开了整个Fe区的系统丙氨酸扫描，据称显示了在氨基酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435 或437 中任一个的 Fe 区氨基酸修饰导致与Fe Y RIII的结合降低。Presta等人也公开了与Fe Y RII的结合增加的多肽，所述多肽包含亦通过经丙氨酸扫描鉴定的在Fe区氨基酸位置255、256、258、267、268、272、276、280、283、285、286、290、301、305、307、309、312、315、320、322、326、330、331、337、340、378、398 或430中的任一个的单一位置氨基酸修饰。Presta等人公开了同时突变两个Fe氨基酸位置(即修饰S317A和K353A)的单一实例，然而Presta等人没有表明这样的双重突变在获取经修饰多肽与Fe YRII的所需结合特征中提供任何协同效应。Presta等人完全没有提及在不止一个氨基酸位置上同时修饰的潜在协同作用。Lazar等人(美国专利7，317，091)公开了包含在Fe区位置332的氨基酸修饰的抗体，据称所述修饰导致与Fe YR的结合发生改变。Lazar等人公开了在位置234、235、239、240、243、264、266、272、274、278、325、328、330 和 332 的单一取代据称影响与 Fe Y R 的结合。尽管Lazar等人声称公开了当与经改造的糖形结合时Fe变体的协同作用,但Lazar等人没有提及与可通过经改造的糖形提供的额外协同作用无关的、可通过选择同时修饰Fe氨基酸位置而提供的潜在协同作用。Stavenhagen (美国专利号7，632，497)公开了具有变体Fe区的分子，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少一个氨基酸修饰。这些经修饰的分子据称将效应子功能赋予其中亲本分子经检测未表现出该效应子功能的分子。·
目前在与Fe区融合的治疗性单克隆抗体和可溶性多肽中优化Fe区的方法已集中于根据丙氨酸筛选、定点诱变等的有限数量的单个氨基酸改变。改造Fe区的其它方法已集中于Fe区的糖基化，以优化Fe区功能。再其它的方法已集中于Fe修饰，其据称通过修饰缺乏效应子功能的野生型分子而赋予效应子功能，但据称不会增加或以其它方式改变野生型分子的现有效应子功能。目前没有已知的经优化而与其它FeY受体相比以非常高特异性与特定的目标Fe Y R结合的Fe蛋白或多肽。尽管已经充分了解单个Fe区氨基酸突变对与某些Fe Y受体结合的影响，但先前的研究未能描述多个氨基酸同时改变的影响。另外，现有技术未提出用于获得与目标Fe y R的最佳结合的取代Fe区氨基酸的合适替代法，所述替代法包括已具有可检测的效应子功能的野生型分子的效应子功能的修饰。因此，本领域需要这样的多肽和抗体其包含在Fe区内的多个协同氨基酸取代，使得所述抗体或融合蛋白对与所选Fe Y R同种型结合而言最优化。发明概述
本发明的组成内容提供多肽、融合蛋白和抗体，其包含以极高特异性与靶Fe Y R结合的Fe区。通过合理分析每种Fe Y R与Fe区的结合并通过随后设计协同地提供对于靶Fe受体的所需选择性和结合亲和力的多个(3个或更多个)氨基酸取代，而设计这些多肽和抗体。因此，本文所提供的多肽和蛋白在Fe区中包含与野生型Fe区相比的多个变异，所述变异经定制以改善针对考虑中的Fe Y R的特异性，并用于根据通过选择每个位置的最有利氨基酸而优化的焓因素和熵因素，获取经选择的结合特征。一个实施方案提供包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含3个或更多个氨基酸修饰，并且相对于包含野生型Fe区的多肽而言具有改变的效应；其中所述3个或更多个修饰中的至少2个与所述至少2个位置的单一位置修饰相比提供协同效应，因此表现出对Fe Y受体的经选择的结合特征。另一个实施方案提供多肽，其中所述氨基酸修饰产生氨基酸相互作用和动力学，其导致与缺乏至少3个或更多个氨基酸修饰的多肽相比，对第一 Fe y受体的结合自由能增力口，而对第二 Fe Y受体的结合亲和力降低。第一 Fe Y受体可以是Fe YRIIIa受体，第二Fe y受体可以是Fe y RIIa或Fe Y Rllb。另一个实施方案提供多肽，其中所述氨基酸修饰产生有利的Fey RIIIa-特异性相互作用和/或与Fe Y RIIa受体和/或Fe Y RIIb受体不利的相互作用。另一个实施方案提供多肽，其中所述氨基酸修饰对Fe y RIIIa受体具有最小影响，而对所述多肽与Fe Y RIIa和/或Fe Y RIIb的结合产生有害效应。一个实施方案提供多肽，其中第一 Fe Y受体是Fe Y RIIa受体，第二 Fe Y受体是Fe Y RIIIa 或 Fe Y RIIb。一个实施方案提供多肽 ，其中所述氨基酸修饰产生有利的Fe y RIIa-特异性相互作用和/或与Fe Y RIIIa受体和/或Fe Y RIIb受体不利的相互作用。一个实施方案提供多肽，其中所述氨基酸修饰对Fe y RIIa受体具有最小影响，而对所述多肽与Fe Y RIIIa和/或Fe Y RIIb的结合产生有害效应。一个实施方案提供多肽，其中所述结合自由能增加的Fe Y受体是Fe Y RIIb受体，而结合亲和力降低的Fe y受体是Fe YRIIIa受体或Fe y RIIa受体。一个实施方案提供多肽，其中所述氨基酸修饰产生有利的Fe y RIIb-特异性相互作用和/或与Fe Y RIIIa受体和/或Fe Y RIIa受体不利的相互作用。一个实施方案提供多肽，其中所述氨基酸修饰对Fe Y RIIb受体具有最小影响，而对所述多肽与Fe Y RIIIa和/或Fe Y RIIa的结合产生有害效应。一个实施方案提供多肽，其中当与野生型多肽相比时，所述氨基酸取代降低或破坏与Fe y RIIa受体、Fe y RIIIa受体和Fe y RIIb受体的结合亲和力。一个实施方案提供多肽，其中包含野生型Fe区的多肽与Fe Y受体的结合可通过体外测定来检测。在本发明的某些实施方案中，提供用于改造经优化的Fe多肽和蛋白的方法。本公开内容的一个目的是提供可用于指导Fe优化的设计策略。本公开内容的另一个目的是提供可用于设计Fe蛋白的计算机扫描方法。本公开内容的还一个目的是提供用于产生用于实验测试的文库的方法。本公开内容的还一个目的是提供用于获取经优化的Fe蛋白的实验性制备和筛选方法。在某些实施方案中提供编码本文所述的Fe蛋白的分离的核酸。在某些实施方案中提供包含所述核酸的载体，所述核酸任选与控制序列可操作地连接。在某些实施方案中提供含所述载体的宿主细胞，以及制备和任选回收所述Fe蛋白的方法。在某些实施方案中提供抗体和多肽，其包含本文所公开的Fe蛋白。所述抗体和多肽可在治疗性产品中找到用处。本公开内容提供组合物，所述组合物包含含有本文所述的Fe蛋白的抗体和多肽，以及生理学上或药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施方案中提供包含本文所公开的Fe蛋白的抗体和多肽的治疗和诊断用途。本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，并相对于包含野生型Fe区或包含仅I个或2个氨基酸修饰的变体Fe区的多肽而言具有改变的效应；和其中所述修饰中的至少2个与单一位置修饰相比提供协同效应，因此表现出对Fe Y受体的经选择的结合特征。在某些实施方案中，氨基酸修饰之一或这两者位于按照EU索引的位置234-330之间。在某些实施方案中，所述修饰不包含在按照EU索引的位置317和353的同时取代。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰不包含在按照EU索引的位置332的取代。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰L235A/S239E/D265E。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰A327H/E269L/K236A。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰G237F/D270Q/S239E。在某些其它实施方案中，所述多肽包含修饰A330V/I332L/K326。在一个实施方案中，所述多肽包含修饰G236S/A327H/A330I。在本文所述多肽的某些实施方案中，所述氨基酸修饰产生氨基酸相互作用和动力学，其导致与缺乏3个或更多个氨基酸修饰的多肽相比对第一 Fe y受体的结合亲和力和/或特异性增加，而对第二 Fe Y受体的结合亲和力和/或特异性降低。在某些这样的实施方案中，第一Fe Y受体是Fe Y RIIIa受体，第二Fe Y受体是Fe Y RIIa或Fe Y Rllb。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰产生有利的Fe y RIIIa-特异性相互作用和/或与Fe Y RIIa受体和/或Fe Y RIIb受体不利的相互作用。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰对Fe Y RIIIa受体具有最小的影响，而对所述多肽与Fe Y RIIa和/或Fe Y RIIb的结合产生有害效应。本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰产生氨基酸相互作用和动力学，其导致与缺乏2·个所述氨基酸修饰的多肽相比，对Fe YRIIIa受体的结合亲和力和/或特异性增加，而对Fe y RIIa受体或Fe y RIIb受体的结合亲和力和/或特异性降低。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰S239E/D265S/I332E。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰G237F/S239E/A327H。在某些其它实施方案中，所述多肽包含修饰H268D/E269L/S298A/K326A/A327H。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰L235A/S239E/D265E/A327H。在一个实施方案中，所述多肽包含修饰G237F/S239E/D270N。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰G236E/G237F/S239E。在一个实施方案中，所述多肽包含修饰S239E/D265SI332E和备选的H268D。在某些实施方案中，所述多肽包含选自以下的修饰G237F/S239E/D265E、S239E/S298A/K326A/A327H和G236E/D270N/A327V/I332E。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰S298A/K326A/A327H，其中所述多肽与缺乏S298A/K326A/A327H修饰的多肽相比，对Fe y RIIIa受体具有改进的结合选择性。一方面，本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰产生氨基酸相互作用和动力学，其导致与缺乏至少I个所述氨基酸修饰的多肽相比对Fe y RIIa受体的结合亲和力和/或特异性增加，而对Fe YRIIIa受体或Fe y RIIb受体的结合亲和力和/或特异性降低。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰G237F、A327L和A330I。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰产生有利的Fe y RIIa-特异性相互作用和/或与Fe y RIIIa受体和/或Fe Y RIIb受体的不利的相互作用。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰对Fe YRIIa受体具有最小的影响，而对所述多肽与Fe Y RIIIa和/或Fe Y RIIb的结合产生有害效应。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰G237F、S239E和H268D。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰D265E/S267D/A330S。再一方面，本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰产生氨基酸相互作用和动力学，其导致与缺乏至少I个所述氨基酸修饰的多肽相比对Fe y RIIb受体的结合亲和力和/或特异性增加，而对Fe YRIIIa受体或Fe y RIIa受体的结合亲和力和/或特异性降低。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰产生有利的Fe Y RIIb-特异性相互作用和/或与Fe YRIIIa受体和/或Fe YRIIa受体的不利的相互作用。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰对Fe y RIIb受体具有最小的影响，而对所述多肽与Fe Y RIIIa和/或Fe Y RIIa的结合产生有害效应。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰S239D/D265S/S298A/I332E。在某些其它实施方案中，所述多肽包含修饰G237F/S298A/A330L/I332E。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰H268D、K326A、A327H和备选的E269L和S298A中的一个或两个。在一个实施方案中，所述多肽包含修饰G237F/V266L/S267D。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰L234F/S267G/N325L或L234F/S267E/N325L。在一个实施方案中，所述多肽包含修饰G236A/S239D/D270L/I332E。在本文所述的某些方面，包含野生型Fe区的多肽与Fe y受体的结合可经体外测定而检测。一方面，本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，其中所述修饰之一包含突变S239E，其中所述多肽与缺乏 S239E突变的多肽相比在与Fe Y RIIIa受体的结合方面具有更高的选择性。一方面，本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，其中所述修饰之一包含突变S239E，所述修饰之一包含突变S298A，其中所述多肽与缺乏S298A突变的多肽相比对Fe y RIIa受体和Fe y RIIb受体具有降低的结合亲和力。一方面，本文所提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，所述修饰选自D270L/Y300L/A330K、G237F/S267G/N325F、G237F/V266L/S267D、L234F/S267G/N325L、L234F/S267E/N325L、G237F/S239E/A327H、G237F/A327L/A330I、S239E/A327L/A330I、S239E/S267E/H268D、G237F/S239E/D270N、G236E/G237F/S239E、S239E/D265S/I332E、G237F/S239E/D265E、G237F/S239E/H268D、H268E/D270E/S267G、H268D/K326A/A327H、D265E/S267D/A330S、L235A/S239E/D265E、A327H/E269L/K236A、G237F/D270Q/S239E、A330V/I332L/K326 和 G236S/A327H/A330I。一方面，本文所提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少4个氨基酸修饰，所述修饰选自L235A/S239E/D265E/A327H、S239E/D265S/H268D/I332E、S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E、和 G236E/D270N/A327V/I332E、G236A/S239D/D270L/I332E 和 H268D/E269L/S298A/K326A/A327H。一方面，本文所提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，其中所述至少3个氨基酸修饰选自L234Q、L234N、L235A、G236E、E236L、E236D、G237F、G237N、S239E、S239D、D265E、D265S、S267E、S267D、S267G、H268D、H268E、E269L、E269L、D270N、D270I、D270E、S298A、K326A、K326D、A327H、A327V、A327L、A327T、A330V、A330L、A330W、A330I、A330S、I332L、I332D 和 I332E。一方面，本文所提供的是包含变体Fe区的多肽，所述变体Fe区包含氨基酸修饰组合，其中所述组合选自L235A/S239E/D265E ；L235A/G237F/D265E ；S239E/E269D/A327H ；S239E/G237N/A327H ；S239E/G237F/A327V ；G237F/D270I/S239E ；G237F/A327L/S239E ；A327H/E269L/K326A ；A330V/I332L/S239E ；A327T/E269L/K326A ；D270N/A327T/K326A ；A330V/I332L/S239E ；A330ff/I332D/S239E ；G236E/D265E/A327H/A330I ；D270N/S298A/A327V ；G236E/D265E/D270N/A327H/A330I ；G236E/D270N/A327H/A330I ；G236E/D270N/A327V/I332E ；G236E/D270N/A327V/G237F；L234N/S239E/A330I/I332E；L234Q/S239E/A330I/I332E ；L234Q/S239E/A330I/I332E/S298A ；G237F/S239D/D265E/D270N/S298A ；G237F/S239E/D270N/A330L/I332E ；G237F/S239E/D270N/A330L/I332E/S298A ；S239E/G237F/A327H ；G237F/A327L/A330I ；S239E/A330I/A327L ；D265E/S239E/L235A/A327H ；S267E/S239E/H268D ；G237F/D270N/S239E ；S239E/G237F/G236E ；I332E/D265S/S239E/H268D ；I332E/D265S/S239E ；D265E/S23 9E/G237F ；S239E/H268D/G237F；S298A/D265S/S239D/I332E ；S298A/K326A/A327H/S239E ；S298A/G237F/A3330L/I332E；H268E/D270E/S267G ；H268D/K326A/A327H ；H268D/K326A/A327H/E269L/S298A ；A330S/D265E/S267D ；S239E/S267E/H268D ；S237F/S239E/D265E 和 H268E/D270/E/S267G。一方面，本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，其中当所述变体Fe区包含氨基酸修饰H268D时，所述变体不包含修饰S267E。在本文所述多肽的某些实施方案中，所述亲本多肽的Fe区是人IgG Fe区。在某些这样的实施方案中，所述人IgG Fe区是人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的Fe区。在本文所述的多肽的某些实施方案中，所述多肽是抗体。在某些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体、人源化抗体或人抗体。一方面是核酸，其包含编码本文所述的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中是包含所述核酸的载体。一方面是制备本文所述的多肽或蛋白的方法，所述方法包括(i)在适合所述多肽表达的条件下，在培养基中培养包含编码所述多肽的核酸的宿主细胞；和(ii)从所述培养基中回收所述多肽。本文所述的一方面是特异性结合癌靶抗原的治疗用抗体，所述治疗用抗体包含本文所述的变体Fe区多肽。在某些实施方案中，所述治疗用抗体选自阿巴伏单抗(abagovomab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿伦珠单抗、aurograb、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗(belimumab)、贝伐珠单抗、briakinumab、卡那单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、培舍珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗、达克珠单抗、地舒单抗(denosumab)、依法珠单抗、加利昔单抗(galiximab)、吉妥珠单抗奥佐米星、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗、英利昔单抗、伊匹木单抗、鲁昔单抗、美泊利单抗、莫他珠单抗、莫罗单抗、mycograb、那他珠单抗、尼妥珠单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、培妥珠单抗、雷珠单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗、替利珠单抗(teplizumab)、托珠单抗/atlizumab、托西莫单抗、曲妥珠单抗、ProxiniumTM、RencarexTM、优特克单抗、扎芦木单抗(zalutumumab)和任何其它抗体。在某些实施方案中，所述靶抗原选自IL-2R的a-链(⑶25)、淀粉状蛋白P、抗EpCAM x抗⑶3,BLyS (或 BAFF)、CD1 I a、CD20、CD22、CD23、CD3、CD4、CD52、CD80、CTLA-4、EGFR、EpCAM、RSV 的 F 蛋白、G250、糖蛋白 Ilb/IIIa R、HER2、HER2/neu R、Hsp90、IgE 抗体、IL-12/IL-23、IL-lb、IL-5、IL-6 受体、整联蛋白 a-4/￠-1、粘蛋白 16/CA-125、RANKL、TNF a、VEGF-A 和其它治疗有利的靶标。本文所述的一方面是在患有以癌抗原为特征的癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的本文所述的治疗用抗体。在某些实施方案中，所述患者是人。本文所述的一方面是在患有以免疫抗原为特征的免疫性疾病的患者中治疗免疫性疾病的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效的本文所述的多肽、抗体或蛋白。一方面是药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的本文所述的多肽和药学上可接受的载体。本文所述的一方面是多肽，所述多肽包含具有至少3个氨基酸取代的变体Fe区，并且其中所述多肽在介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)方面比野生型更有效。在某些实施方案中，所述包含变体Fe区的多肽在介导ADCC方面的有效性是野生型的大约I. 5至大约100倍。在某些实施方案中，所述包含变体Fe区的多肽在介导ADCC方面的有效性是野生型的大约2至大约50倍。·
本文所述的一方面是多肽，所述多肽包含具有至少3个氨基酸取代的变体Fe区，其中所述多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面比野生型更有效。在某些实施方案中，所述包含变体Fe区的多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面的有效性是野生型的大约2倍。在某些实施方案中，所述包含变体Fe区的多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面的有效性是野生型的大约10倍。在某些实施方案中，所述包含变体Fe区的多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面的有效性是野生型的大约50倍。在某些实施方案中，所述包含变体Fe区的多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面的有效性是野生型的大约100倍。本文还提供基于计算的与Fe y RIIa、Fc Y RIIb和/或Fe Y RIIIa的结合亲和力在计算机芯片上(in silico)鉴定Fe变体多肽的方法。在某些实施方案中，在计算机芯片上鉴定Fe变体多肽的方法进一步在计算机芯片上计算所述Fe变体多肽的静电学、溶剂化、堆积(packing)、堆积密度、氢键合和熵效应。在某些实施方案中，在计算机芯片上鉴定Fe变体多肽的方法还包括构建经鉴定的Fe变体多肽并在哺乳动物细胞中以抗体形式表达所述多肽。在回顾本发明具体实施方案的以下描述后，本发明的其它方面和特征对于本领域普通技术人员来说会变得显而易见。通过引用的结合
本说明书提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用结合到本文中，其结合程度如同具体且单独地表明每篇出版物、专利和专利申请各自通过引用结合一样。附图
简述
在所附权利要求书中具体给出本发明的特征。通过对陈述说明性实施方案的以下详述的参考，将会得到对本发明特征和优势更好的理解，所述说明性实施方案中利用了本发明的原理，并且附图如下
图I :A327H和S239E突变的效应显示介于抗体Fe B链(绿色)和不同Fe Y受体(小麦)之间的结合界面的一部分。野生型Fe与Fe Y RIIIa结构示于上方，而各受体的Fe变体诱导的结构和动力学变化示于下方。待突变的侧链位置的颜色为深绿色，残基标记呈红色。虚线表示静电相互作用，所示距离以埃(A)为单位。对于FcyRIIa，Hisl34的两种所示构象是最大容许构象运动，为清楚起见而省略了中间构象异构体。图2 :S239E突变的效应显示介于抗体Fe A链(绿色)和受体(小麦)FcyRIIIa(左)和FcgRIIa & IIb (右)之间的结合界面的一部分。突变的侧链位置的颜色为深绿色，残基标记呈红色。虚线表示静电相互作用，所示距离以埃(A)为单位。FcyRIIa和Fe y RIIb都含保守Tyrl60残基和Thrl61残基并为清楚起见而显示在一起。图3 :S298A突变的效应显示介于抗体Fe B链(绿色)和不同Fe Y受体(小麦)之间的结合界面的一部分。野生型Fe示于左边，而变体Fe示于右边。与Fe Y RIIa和IIb受体的相互作用示于上方，而Fe Y RIIIa示于下方。S298A突变标记为红色，虚线表示静电相互作用，所示分子间距离以埃(A)为单位。对于？(^1 111&体系，1^128和4如126的所示构象是最大容许构象运动，为清楚起见而省略了中间构 象异构体。图4 :与3种Fe Y受体的体外结合特征用表面等离子体共振测定S239E/S298A/K326A/A327H变体(左)和S239E对照(右)的体外结合(绿色)，其结合报告为与野生型赫赛汀(Herceptin)抗体(蓝色)相比的缔合常数(Ka)，单位是摩尔[M]。发明详述
本文所公开的实施方案涉及多肽、融合蛋白和抗体，其包含Fe区中的至少3个取代，其中所述多肽与缺乏所述至少3个取代的多肽相比以更高特异性与靶Fe Y R受体结合。通过合理分析每种Fe Y R与Fe区的结合并通过随后设计协同地提供对于靶Fe受体的增加的选择性和结合亲和力的多个氨基酸取代，而设计这些多肽和抗体。因此，本文所提供的多肽和蛋白在Fe区中与野生型Fe区相比包含多个变异，所述变异经定制以改善针对考虑中的FcyR的特异性，并用于根据通过选择每个取代位置的最有利氨基酸而优化的焓因素和熵因素，获取最大的能量上有利的结合。一个实施方案提供包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含3个或更多个氨基酸修饰，并相对于包含野生型Fe区的多肽而言具有改变的效应；其中所述3个或更多个修饰中的至少2个与所述至少2个位置的单一位置修饰相比提供协同效应，因此表现出对Fe Y受体的经选择的结合特征。另一个实施方案提供多肽，其中所述氨基酸修饰产生氨基酸相互作用和动力学，其导致与缺乏所述至少3个或更多个氨基酸修饰的多肽相比对第一 Fe Y受体的结合自由能增加，而对第二 Fcy受体的结合亲和力降低。在某些实施方案中，第一 Fe Y受体是Fe YRIIIa 受体，第二 Fe y 受体是 Fe Y RIIa 或 Fe Y Rllb。另一个实施方案提供多肽，其中所述氨基酸修饰产生有利的FeY RIIIa-特异性静电相互作用以及对Fe y RIIa受体和/或Fe Y RIIb受体的空间排斥。另一个实施方案提供多肽，其中所述氨基酸修饰对Fe YRIIIa受体具有最小的影响，而对所述多肽与Fe y RIIa和/或Fe Y RIIb的结合产生有害效应。另一个实施方案提供多肽，其中与野生型Fe相比，所述氨基酸取代保留与Fe YRIIIa的结合界面和蛋白-蛋白相互作用，并导致所述多肽与Fe y RIIa受体的结合被破坏。以下或以上引用或重复的任何专利、申请或其它参考文献都通过引用以其整体结合到本文中，用于所有目的以及所述建议。以下定义可用于理解本文所提供的组合物和方法，但意在包括科学上的等同内容。在本说明书和权利要求书的全文中，免疫球蛋白重链中的残基编号为如以下文献记载的 EU 索引的编号Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)，其通过引用明确结合到本文中。“Kabat中的EU索引”是指人IgGl EU抗体的残
基编号。“亲本多肽”为包括这样的氨基酸序列的多肽所述氨基酸序列缺少一个或多个本文所公开的Fe区修饰，并且与本文所公开的多肽变体相比差别在于效应子功能。所述亲本多肽可包括天然序列Fe区或具有先前存在的氨基酸序列修饰(例如添加、缺失和/或取代)的Fe区。本文所用的“协同”意指经设计具有多个氨基酸取代的Fe蛋白的Fe Y R结合大于对单个取代所见的它们的累加结合。术语“Fe区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区。“Fe区”可以是天然序列Fe区 或变体Fe区。尽管免疫球蛋白重链Fe区的边界可能不同，但人IgG重链Fe区通常定义为从氨基酸残基位置Cys226或从Pro230延伸到其羧基端。免疫球蛋白的Fe区通常包括2个恒定结构域CH2和CH3。人IgG Fe区的“CH2结构域”(也称为“C y 2”结构域)通常从大约氨基酸231延伸到约氨基酸340。CH2结构域的独特性在于它不与另一结构域紧密配对。而是两个N连接的分支糖链介于完整的天然IgG分子的2个CH2结构域之间。推测所述糖可以为结构域-结构域配对提供取代物，并且有助于稳定CH2结构域。Burton, Molec. Immunol. 22:161-206(1985)。“CH3结构域”包括Fe区中从C端到CH2结构域的一段残基(即从IgG的大约氨基酸残基341到约氨基酸残基447)。“功能性Fe区”拥有天然序列Fe区的“效应子功能”。示例性的效应子功能包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬；细胞表面受体(例如B细胞受体，BCR)的下调等。这些效应子功能通常需要Fe区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合，并且可用例如本文所公开的各种测定法来评价。“天然序列Fe区”包含与自然中发现的Fe区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fe区包含天然序列人IgGl Fe区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fe区；天然序列人IgG3 Fe区；和天然序列人IgG4 Fe区及其天然存在的变体。“变体Fe区”包含因至少一个如本文所定义的“氨基酸修饰”而区别于天然序列Fe区的氨基酸序列。与天然序列Fe区或亲本多肽Fe区相比，变体Fe区在天然序列Fe区或亲本多肽Fe区中具有至少一个氨基酸取代，例如约I-约10个氨基酸取代和优选约I-约5个氨基酸取代。在某些实施方案中，本文的变体Fe区与天然序列Fe区和/或与亲本多肽Fe区具有至少大约80%同源性，和最优选与其具有至少大约90%同源性，更优选与其具有至少大约95%同源性。“同源性”定义为在比对序列和必要时引入空位以获得最大同源性百分率后氨基酸序列变体中相同残基的百分率。用于比对的方法和计算机程序是本领域中众所周知的。一个这类计算机程序是Genentech, Inc.所写的“Align 2”,其与用户文件一起于1991年12 月 10 日提交美国版权办公室(United States Copyright Office), Washington, D. C.20559。
术语“含Fe区的多肽”是指包含Fe区的多肽，例如抗体或免疫粘附素(参见以下定义)。术语“Fe受体”或“FcR”用于描述与抗体Fe区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，在某些实施方案中，FcR是与IgG抗体结合的受体受体)并包括FcyRI, FcyRII和FcyRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体以及可变剪接形式。FcyRII受体包括Fe Y RIIA ( “激活性受体”)和Fe Y RIIB ( “抑制性受体”)，其具有主要区别在于其胞质结构域的类似的氨基酸序列。激活性受体Fe y RIIA在其胞质结构域中含有免疫受体的基于酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体Fe Y RIIB在其胞质结构域中含有免疫受体的基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(综述参见M. in Daeron, Annu.Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)) qFcR 的综述可参见Ravetch and Kinet, Annu. Rev.Immunol 9:457-92 (1991) ;Capel 等，Immunomethods 4:25-34 (1994);和 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)。其它FcR，包括未来将被鉴定的那些均包括在本文的术语“FcR”内。该术语还包括负责将母体IgG转移给胎儿的新生儿受体FcRn (Guyer等，J. Tmmun 01. 117:587 (1976)和 Kim 等，J. Tmmuno 1. 24:249 (1994))。·“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达FcR的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，并且在随后引起该靶细胞的溶解。介导ADCC的主要细胞即NK细胞仅表达Fe ￥1 111，而单核细胞表达？(^1 1、FcyRII和FcyRIII。造血细胞上的FcR表达概述于 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. TmmunoI 9:457-92 (1991),第 464 页，表 3。“人效应细胞”是白细胞，其表达一个或多个FcR并且发挥效应子功能。优选这些细胞至少表达Fe y RIII并且发挥ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和和嗜中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应细胞可如本文所述从其天然来源例如血液或PBMC中分离。具有“改变的”FcR结合亲和力或ADCC活性的多肽是与亲本多肽或含天然序列Fe区的多肽相比具有提高的或降低的FcR结合活性和/或ADCC活性的多肽。对FcR“具有提高的结合”的多肽以比亲本多肽更好的亲和力与至少一个FcR结合。对FcR “具有降低的结合”的多肽以比亲本多肽更差的亲和力与至少一个FcR结合。如本文实施例中所测定，这些对FcR具有降低的结合的变体可具有很少或无可观的与FcR的结合，例如与FcR的结合为天然序列IgG Fe区的0-20%。以比亲本多肽“更好的亲和力”与FcR结合的多肽，是指在结合测定中多肽和亲本多肽的量基本相同时，以比亲本抗体显著更好的结合亲和力与上文鉴定的FcR中的任一种或多种结合的多肽。例如，具有改进的FcR结合亲和力的多肽与亲本多肽相比可在FcR结合亲和力方面具有约I. 15倍-约100倍，例如约I. 2倍-约50倍的改进，其中例如按照本文的实施例中所公开的那样测定FcR结合亲和力。与亲本抗体相比，“在人效应细胞存在时更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC) ”的多肽是在测定中所用的多肽变体和亲本抗体的量基本相同时，在体外或体内显著更有效介导ADCC的多肽。通常，这样的多肽可用本文所公开的体外ADCC测定来鉴定，但也考虑测定ADCC活性的其它测定或方法，例如在动物模型等中。优选多肽在例如本文所公开的体外测定中介导ADCC的有效性是亲本的约I. 5倍-约100倍，例如约2倍-约50倍。“氨基酸修饰”是指预定氨基酸序列中氨基酸序列的改变。示例性的修饰包括氨基酸取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，本文的氨基酸修饰是取代。在例如Fe区的特定位置的“氨基酸修饰”指特定残基的取代或缺失，或指在特定残基附近插入至少一个氨基酸残基。在特定残基“附近”插入意指在距其一到二个残基之内插入。在某些实施方案中，插入是在特定残基的N-端或C-端。“氨基酸取代”是指用另一个不同的“置换”氨基酸残基置换预定氨基酸序列中至少一个已存在的氨基酸残基。置换残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码的)并且选自丙氨酸(Ala);精氨酸(Arg);天冬酰胺( Asn);天冬氨酸(Asp);半胱氨酸(Cys);谷氨酰胺(Gln);谷氨酸(Glu);甘氨酸(Gly);组氨酸(His);异亮氨酸(Ile):亮氨酸(Leu);赖氨酸(Lys);甲硫氨酸(Met);苯丙氨酸(Phe);脯氨酸(Pro):丝氨酸(Ser);苏氨酸(Thr);色氨酸(Trp);酪氨酸(Tyr);和缬氨酸(Val)。优选置换残基不是半胱氨酸。用一个或多个非天然存在的氨基酸残基进行的取代也包括在本文的氨基酸取代的定义中。“非天然存在的氨基酸残基”指除以上所列的天然存在的氨基酸残基以外的、能在多肽链中与相邻氨基酸残基共价结合的残基。非天然存在氨基酸残基的实例包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，例如以下文献中所描述的那些=Ellman等.Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)。为了产生这些非天然存在的氨基酸，可以使用以下文献的方法Noren等.Science 244:182 (1989)和Ellman等，出处同上。简而言之,这些方法涉及用非天然存在的氨基酸残基化学激活抑制型tRNA，随后进行该RNA的体外转录和翻译。“氨基酸插入”是指向预定氨基酸序列中结合至少一个氨基酸。在某些实施方案中，插入由插入一个或两个氨基酸残基构成。在某些其它实施方案中，是更大的“肽插入”，例如约3-约5个或高达约10个氨基酸残基的插入。在这些实施方案中，插入的残基是如以上所公开的天然存在的或非天然存在的残基。“氨基酸缺失”是指从预定氨基酸序列中除去至少一个氨基酸残基。“铰链区”通常定义为从人IgGl的Glu216到Pro230的一段序列(Burton, Molec.Immunol. 22:161-206 (1985))。可通过将形成重链间S—S键的第一个和最后一个半胱氨酸置于相同位置上，将其它IgG同种型的铰链区与IgGl序列相连。Fe区的“低铰链区(lower hinge region) ”通常定义为紧挨着铰链区C-端的残基段即Fe区的残基233至239。在本公开内容之前，Fe Y R结合通常归因于IgG Fe区的低铰链区中的氨基酸残基。“Clq”是包含针对免疫球蛋白Fe区的结合位点的多肽。Clq与两个丝氨酸蛋白酶Clr和Cls —起形成复合物Cl，其是补体依赖性细胞毒性(⑶C)途径中的第一个组分。人Clq 可市购自例如 Quidel, San Diego, Calif. 术语“结合结构域”是指结合另一分子的多肽区。就FcR而言，结合结构域可以包含负责与Fe区结合的其多肽链的部分(例如其a链)。一个有用的结合结构域是FcRa链的胞外结构域。术语“抗体”以最广泛的意义使用，特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们具有所需生物学活性。本文所定义的“抗体片段”包括完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合区或可变区，或保留FcR结合能力的抗体Fe区。抗体片段的实例包括线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在某些实施方案中，抗体片段保留IgG重链的铰链区和任选的CHl区的至少一部分。在某些实施方案中，抗体片段保留IgG重链的完整恒定区并且包含IgG轻链。本文所用的术语“单克隆抗体”是指得自基本均一的抗体群体的抗体，即构成所述群体的各抗体除了可能天然存在的可少量出现的突变外是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，针对单个抗原性位点。而且，与通常含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”指得自基本均一的抗体群的抗体的特点，不应理解为需要通过任何特定方法产生抗体。在某些实施方案中，根据本公开内容所用的单克隆抗体通过杂交瘤方法制备(此方法首先在以下文献中描述=Kohler等，Nature 256:495 (1975))，或可以通过重组DNA方法制备(参 见例如美国专利号4，816，567)。在一些实施方案中，使用例如以下文献所述技术，从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体” :Clackson等，Nature 352:624-628 (1991)和Marks等，J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)。本文中的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分则与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这类抗体的片段的相应序列相同或同源，只要它们具有所需生物活性(美国专利号4，816，567 ;和Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体超变区的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的具有所需特异性、亲和力和能力的超变区的残基置换。在某些情况下，人免疫球蛋白Fv构架区(FR)残基被相应的非人类残基代替。此外，人源化抗体可包括在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步精修抗体性能。一般而言，人源化抗体包括至少I个、通常2个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的超变环均对应于非人免疫球蛋白的超变环，而且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还任选包括免疫球蛋白恒定区(Fe)(通常是人免疫球蛋白恒定区)的至少一部分。更多细节可参见Jones 等，Nature 321:522-525 (1986) ;Riechmann等，Nature 332:323-329 (1988);和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。本文所用的术语“超变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。超变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变结构域的残基24-34 (LI) ,50-56(L2)和 89-97 (L3)，以及重链可变结构域的残基 31-35 (HI), 50-65 (H2)和 95-102 (H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))和 / 或来自“超变环”的残基(即轻链可变结构域的残基26-32 (LI),50-52 (L2)和91-96 (L3)，以及重链可变结构域的残基26-32 (Hl) ,53-55 (H2)和 96-101 (H3) ;Chothia和 Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987))。“构架”或“FR”残基是不同于本文所定义的超变区残基的那些可变
结构域残基。 本文所用的术语“免疫粘附素”是指抗体样分子，其将异源“粘附素”蛋白(例如受体、配体或酶)的“结合结构域”与免疫球蛋白恒定结构域组合。从结构上看，免疫粘附素包括具有所需结合特异性的粘附素氨基酸序列与免疫球蛋白恒定结构域序列的融合，所述粘附素氨基酸序列不同于抗体的抗原识别和结合位点(抗原结合位点)(即是“异源的”)。本文所用的术语“配体结合结构域”是指任何天然的细胞表面受体或者其至少保留相应天然受体的定性配体结合能力的任何区或衍生物。在一个具体的实施方案中，所述受体来自具有与免疫球蛋白超基因家族成员同源的胞外结构域的细胞表面多肽。其它不属于免疫球蛋白超基因家族的成员、但是明确被此定义涵盖的受体，是细胞因子的受体，尤其是具有酪氨酸激酶活性的受体(受体酪氨酸激酶)、促红细胞生成素和神经生长因子受体超家族的成员、以及细胞粘附分子，例如(E-、L-和P-)选择蛋白。术语“受体结合结构域”用于指受体的任何天然配体，包括细胞粘附分子，或至少保留了相应天然配体的定性的受体结合能力的这类天然配体的任何区或衍生物。此定义尤其明确包括来自上述受体的配体的结合序列。“抗体-免疫粘附素嵌合体”包括使抗体的至少一个结合结构域(如本文所定义)与至少一种免疫粘附素(如本申请所定义)组合的分子。示例性的抗体-免疫粘附素嵌合体是以下文献所描述的双特异性CD4-IgG嵌合体Berg等，PNAS (USA) 88:4723-4727(1991)和 Chamow 等，J. Tmmuno1. 153:4268 (1994)。“分离的”多肽是指经鉴定和从其天然环境的组分中分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分是可干扰所述多肽的诊断或治疗性应用的物质，可包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶质。在某些实施方案中，所述多肽经纯化(I)至经Lowry法所测的大于95%重量的多肽，最优选大于99%重量，(2)至足以通过使用旋转杯顺序分析仪(spinning cupsequenator)获得N-端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至使用考马斯蓝染色或优选的银染通过在还原或非还原条件下的SDS-PAGE所测定的均一性。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，因为该多肽的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。“治疗”是指治疗性治疗和预防措施两者。需要治疗的那些包括已经患病的那些和待预防病症的那些。“病症”是可因多肽变体的治疗而获益的任何病况。这包括慢性和急性疾病或病症，包括使哺乳动物对所述病症易感的那些病理状况。在一个实施方案中，所述病症是癌症。本文所用的措词“标记”是指与所述多肽直接或间接缀合的可检测的化合物或组合物。在某些实施方案中，标记本身是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)。在某些其它实施方案中，标记催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。一个示例性的实施方案包括酶促标记，其催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。“分离的”核酸分子是经鉴定并与通常在多肽核酸的天然来源中与其缔合的至少一种污染核酸分子分离的核酸分子。分离的核酸分子不同于其在自然中存在的形式或状态。因此，分离的核酸分子区别于如其存在于天然细胞中那样的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括通常表达所述多肽的细胞中所含有的核酸分子，其中例如该核酸分子的染色体位置不同于天然细胞的染色体位置。表述“控制序列”是指可操作地连接的编码序列在特定宿主生物中表达所需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。当将核酸置于与另一核酸序列呈功能关联时，该核酸就是“可操作地连接的”。例如，如果某多肽表达为参与该多肽分泌的前蛋白，则前序列或分泌性前导序列的DNA与该多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与该编码序列可操作地连接；或者如果将核糖体结合位点定位成使得促进翻译，则核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接的”意指所连接的DNA序列是连续的，而且就分 泌性前导序列而言，则是连续的并呈阅读相。然而，增强子不必连续。通过在常规限制位点的连接来实现连接。如果这样的位点不存在，则按常规实践利用合成的寡核苷酸接头或连接子。本文所用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用并且所有这些命名包括子代。因此，措词“转化体”和“转化细胞”包括原代所述细胞及由其衍生的培养物，而不考虑传代次数。还应该理解，由于有意或无意的突变，所有子代的DNA含量可能不精确相同。经筛选与原始转化细胞的功能或生物活性相同的突变子代也包括在内。当预期差别命名时，其根据上下文会显而易见。本文所用的术语“分子复合物”是指当两个或更多个异源分子(例如多肽)彼此结合(优选非共价结合)而形成的相对稳定的结构。在本文中优选的分子复合物是免疫复合物。“免疫复合物”是指当至少一个靶分子和至少一个含异源Fe区的多肽彼此结合形成较大分子量复合物而形成的相对稳定的结构。免疫复合物的实例是抗原-抗体聚集物和靶分子-免疫粘附素聚集物。除非另有说明，否则本文所用的术语“免疫复合物”是指离体复合物(即非其可在自然中存在的形式或状态)。然而，所述免疫复合物可向哺乳动物施用，例如以评价哺乳动物中免疫复合物的清除。术语“靶分子”是指这样的分子、通常是多肽其能够被异源分子结合并具有用于该异源分子的一个或多个结合位点。术语“结合位点”是指与另一分子可与之结合的分子的区域。在本文中“第一靶分子”包括分析物(例如含Fe区的多肽)的至少2个不同的结合位点(例如2-5个独立的结合位点)，使得至少两个分析物分子可与第一靶分子结合。在一个优选的实施方案中，所述两个或更多个结合位点是相同的(例如在靶分子是多肽时具有相同的氨基酸序列)。“分析物”是待分析的物质。优选的分析物是有待分析其与Fe受体结合的能力的含Fe区的多肽。“受体”是能够结合至少一个配体的多肽。优选的受体是具有胞外配体结合结构域并任选具有其它结构域(例如跨膜结构域，胞内结构域和/或膜锚着点)的细胞表面受体。待在本文所述测定中评价的受体可以是完整受体或其片段或衍生物(例如融合蛋白，其包含与一个或多个异源多肽融合的该受体的结合结构域)。此外，有待评价其结合特征的受体可以存在于细胞中，或已被分离并任选包被在测定板或某些其它固相上。短语“低亲和力受体”是指对目标配体有弱结合亲和力例如具有结合常数为大约50nM或更差的亲和力的受体。示例性的低亲和力受体包括Fe YRII和Fe Y RIII。本文所用的“效应子功能”意指因抗体Fe区与Fe受体或配体的相互作用所导致的生化事件。效应子功能包括但不限于ADCC、ADCP和⑶C。本文所用的“效应细胞”意指表达一种或多种Fe受体并介导一种或多种效应子功能的免疫系统细胞。效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、郎格汉斯细胞(Langerhans’ cell)、自然杀伤(NK)细胞和Y YT细胞，并且可来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。本文的“文库”意指呈任何形式的Fe蛋白组，包括但不限于一系列核酸序列或氨基酸序列、一系列在不同位置的核酸或氨基酸取代、包含编码文库序列的核酸的物理文库或包含Fe蛋白的物理文库，其呈纯化或未纯化形式。本文所用的“Fe-融合物”意指这样的蛋白其中一种或多种多肽与Fe区 或其衍生物可操作地连接。本文的Fe融合物意在与现有技术(Chamow等，1996，TrendsBiotechnol 14:52-60 ;Ashkenazi 等，1997, Curr Opin TmmunoI 9:195-200)中所用的术语“免疫粘附素”、“Ig融合物”、“Ig嵌合体”和“受体球蛋白”(有时有破折号)同义。Fe融合物将免疫球蛋白的Fe区与融合配偶体结合，融合配偶体通常可以是任何蛋白或小分子。Fe融合物的非Fe部分即融合配偶体的作用为介导靶结合，并因此其是抗体可变区的功能类似物。几乎可将任何蛋白或小分子与Fe连接而得到Fe融合物。蛋白融合配偶体可包括但不限于受体的靶结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或某些其它蛋白或蛋白结构域。小分子融合配偶体可包括将Fe融合物导向治疗靶标的任何治疗剂。这样的靶标可以是牵涉疾病的任何分子，优选胞外受体。作为多个已获批准的小分子药物的靶标的表面受体的两个家族是G-蛋白偶联受体(GPCR)和离子通道，包括K+、Na+、Ca+通道。世界范围内所有现有的市售药物中有近70%都靶向GPCR。因此可将本文所述的Fe蛋白与小分子融合，所述小分子靶向例如一个或多个GABA受体、嘌呤能受体、肾上腺素能受体、组胺能受体、阿片样物质受体、趋化因子受体、谷氨酸受体、烟碱性受体、5HT (5-羟色胺)受体和雌激素受体。融合配偶体可以是靶向治疗有用靶标的蛋白的小分子模似物。可作为Fe融合配偶体的特定药物的具体实例可参见L. S. Goodman等编著，Goodman and Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics (McGraw-Hill, New York,编辑.9, 1996)。融合配偶体不仅包括与现有药物的已知靶标结合的小分子和蛋白质，而且包括尚不作为药物靶标存在的孤儿受体。基因组和蛋白质组计划的完成被证明是药物开发的驱动力，并且这些计划已产生了一批孤儿受体。证实这些新分子作为药物靶标并开发出靶向它们的蛋白和小分子治疗药，具有很大可能性。这样的蛋白和小分子治疗药涵盖在使用本文所述的Fe蛋白的Fe融合配偶体之内。以下定义和描述的各种接头可用于将Fe与融合配偶体共价连接，以产生Fe融合物。本文所用的“Fe配体”意指来自任何生物体的与抗体Fe区结合而形成Fe-配体复合物的分子，优选多肽。Fe配体包括但不限于Fe Y R> Fe y R、Fe y R、FcRn, Clq、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒Fe y R0 Fe配体也包括Fe受体同源物(FcRH),其是与Fe Y R同源的Fe受体家族(Davis等，2002，ImmunologicalReviews 190:123-136)。Fe配体可包括与Fe结合的尚未发现的分子。本文所用的“IgG”意指属于基本上由已识别的免疫球蛋白Y基因编码的抗体类别的多肽。在人类中，该类别包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，该类别包括IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3。本文的“免疫球蛋白(Ig) ”意指由基本上由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白。免疫球蛋白包括但不限于抗体。免疫球蛋白可具有多种结构形式，包括但不限于全长抗体、抗体片段和单一免疫球蛋白结构域。本文的“免疫球蛋白(Ig)结构域”意指免疫球蛋白的区域，其作为如蛋白质结构领域技术人员所确定的不同结构实体存在。Ig结构域通常具有特征性正交-夹心(quadrature-sandwich)折叠拓扑学。在IgG类抗体中的已知的Ig结构域是VH、C Y I、C Y 2、C Y 3、\和Q。本文所用的“亲本多肽”或“前体多肽”(包括Fe亲代或前体)意指随后经修饰以产生变体的多肽。所述亲本多肽可以是天然存在的多肽、或者天然存在的多肽的变体或经改造的形式。亲本多肽可指所述多肽本身、包含所述亲本多肽的组合物、或编码它的氨基酸序列。因此，本文所用的“亲本Fe多肽”意指未经修饰的Fe多肽，其经修饰以产生变体，而本文所用的“亲本抗体”意指未经修饰的抗体，其经修饰以产生变体抗体。本文所用的“残基”意指蛋白中的位置及其所关联的氨基酸的身份。例如，天冬酰胺297 (也称为Asn297，也称为N297)是人抗体IgGl中的残基。 本文所用的“靶抗原”意指被给定抗体可变区特异性结合的分子。靶抗原可以是蛋白、碳水化合物、脂质或其它化合物。本文所用的“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。本文所用的“可变区”意指免疫球蛋白的区域，其包含基本上由Vk ,VA和/或Vh基因中的任一种编码的一个或多个Ig结构域，Vk、VX和/或Vh基因分别组成K、X和重链免疫球蛋白遗传基因座。本文所用的“变体多肽”意指因至少一个氨基酸修饰而不同于亲本多肽序列的多肽序列。变体多肽可指所述多肽本身、包含所述多肽的组合物或编码它的氨基序列。优选地，与亲本多肽相比，变体多肽具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比具有约I-约10个氨基酸修饰，和优选约I-约5个氨基酸修饰。本文的变体多肽序列与亲本多肽序列优选具有至少大约80%同源性，和最优选至少大约90%同源性，更优选至少大约95%同源性。因此，本文所用的“Fe蛋白”意指因至少一个氨基酸修饰而不同于亲本Fe序列的Fe序列。Fe蛋白可只包括Fe区，或者可以抗体、Fe融合物或基本上由Fe编码的其它多肽的形式存在。Fe蛋白可指所述Fe多肽本身、包含所述Fe蛋白多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。在一个示例性的实施方案中，本文所述的变体蛋白包括本文所述的Fe蛋白，并因此可包括具有Fe蛋白的抗体(和相应衍生物)或包含Fe蛋白的Fe融合蛋白。另外，在某些情况下，所述Fe与野生型Fe或“亲本”变体相比是变体。术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)是指细胞介导的免疫的机制，藉此免疫系统的效应细胞活跃地溶解已被特定抗体结合的靶细胞。与野生型Fe区抗体相比，本文所述的Fe区变体多肽和蛋白成功地调节ADCC。在某些实施方案中，与野生型Fe区相比，变体多肽导致ADCC降低。在某些其它实施方案中，与相应的野生型Fe区相比，本文所述的Fe区变体导致ADCC增加。术语几何学度量(geometric metrics)描述了生物聚合物结构单元或残基(在本文中可互换使用)的多个可测量的物理特征，所述生物聚合物结构单元或残基在蛋白质的情况下就是氨基酸。几何学度量可通过以下定义1)由各自残基的原子所限定的两面角、平面角或其它可测量角度，2)同一残基的原子间的距离或与另一残基的原子的距离，和/或3)结构中的同一残基的原子与参考原子或位置之间的距离。残基群体是针对单个残基所获得的所有快照(snapshot)或样品的总和。在某些实施方案中，该群体等于分子动力学模拟中捕获的帧数或采自蒙特卡罗模拟的样品数。残基构象根据所观察的归因于具体残基结构的几何学度量的组合来定义。残基簇是指已根据将所有或部分已确定几何学度量聚簇而指派给同一构象的多个快照。构象频率是指已指派给同一残基构象的帧数。模拟是指通过分子动力学或基于蒙特卡罗的采样方法进行的构象采样过程。轨迹含有通过模拟所产生的构象帧。图论是指数学和计算机科学所用的术语(例如参见Reinhard Diestel, Graph Theory ;第 3 版,Springer 2005)。
术语聚类工具(clustering tool)是指多种数学方法和算法以及执行它们的程序，其可用于从数据组中鉴定类似数据点的聚类。术语动力学交叉相关法(Dynamical Cross Correlation Method)是指参考分子结构的另一构象状态的分子动力学轨迹中该分子结构的原子置换的交互相关矩阵的图示。简正模式分析是有关分子系统的局部能量最小值的特征性谐波振动和频率的研究。弹性网络模型是指将蛋白结构图示为由近似于残基对之间的相互作用的谐波弹簧网络组成。本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，并相对于包含野生型Fe区或包含仅I个或2个氨基酸修饰的变体Fe区的多肽而言具有改变的效应；和其中所述修饰中的至少2个与单一位置修饰相比提供协同效应，因此表现出对Fcy受体的经选择的结合特征。在某些实施方案中，一个或两个氨基酸修饰位于按照EU索引的位置234-330之间。在某些实施方案中，所述修饰不包括在按照EU索引的位置317和353的同时取代。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰不包括在按照EU索引的位置332的取代。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰L235A/S239E/D265E。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰A327H/E269L/K236A。在一个实施方案中，所述多肽包含修饰G237F/D270Q/S239E。在某些其它实施方案中，所述多肽包含修饰A330V/I332L/K326。在一个实施方案中，所述多肽包含修饰G236S/A327H/A330I。在本文所述的多肽的某些实施方案中，所述氨基酸修饰产生氨基酸相互作用和动力学，其导致与缺乏所述3个或更多个氨基酸修饰的多肽相比，对第一 Fe y受体的结合亲和力和/或特异性增加，而对第二 Fe Y受体的结合亲和力和/或特异性降低。在某些这样的实施方案中，第一 Fe Y受体是Fe YRIIIa受体,第二 Fe Y受体是Fe Y RIIa或Fe Y Rllb。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰产生有利的Fe Y RIIIa-特异性相互作用和/或与Fe y RIIa受体和/或Fe Y RIIb受体的不利的相互作用。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰对Fe YRIIIa受体具有最小的影响，而对所述多肽与Fe Y RIIa和/或Fe Y RIIb的结合产生有害效应。本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰产生氨基酸相互作用和动力学，其导致与缺乏2个氨基酸修饰的多肽相比，对Fe YRIIIa受体的结合亲和力和/或特异性增加，而对Fe y RIIa受体或Fe y RIIb受体的结合亲和力和/或特异性降低。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰S239E/D265S/I332E。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰G237F/S239E/A327H。在某些其它实施方案中，所述多肽包含修饰H268D/E269L/S298A/K326A/A327H。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰L235A/S239E/D265E/A327H。在一个实施方案中，所述多肽包含修饰G237F/S239E/D270N。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰G236E/G237F/S239E。在一个实施方案中，所述多肽包含修饰S239E/D265SI332E和备选的H268D。在某些实施方案中，所述多肽包含选自 G237F/S239E/D265E、S239E/S298A/K326A/A327H 和 G236E/D270N/A327V/I332E的修饰。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰S298A/K326A/A327H，其中与缺乏S298A/K326A/A327H修饰的多肽相比，所述多肽对Fe y RIIIa受体具有改进的结合选择性。一方面，本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区 相比包含至少3个氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰产生氨基酸相互作用和动力学，其导致与缺乏至少I个所述氨基酸修饰的多肽相比，对Fe y RIIa受体的结合亲和力和/或特异性增加，而对Fe YRIIIa受体或Fe y RIIb受体的结合亲和力和/或特异性降低。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰G237F、A327L和A330I。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰产生有利的Fe y RIIa-特异性相互作用和/或与Fe y RIIIa受体和/或Fe Y RIIb受体的不利的相互作用。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰对Fe Y RIIa受体具有最小的影响，而对所述多肽与Fe Y RIIIa和/或Fe Y RIIb的结合产生有害效应。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰G237F、S239E和H268D。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰D265E/S267D/A330S。再一方面，本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，其中所述氨基酸修饰产生氨基酸相互作用和动力学，其导致与缺乏至少I个所述氨基酸修饰的多肽相比，对Fe y RIIb受体的结合亲和力和/或特异性增加，而对Fe YRIIIa受体或Fe y RIIa受体的结合亲和力和/或特异性降低。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰产生有利的Fe Y RIIb-特异性相互作用和/或与Fe YRIIIa受体和/或Fe Y RIIa受体的不利的相互作用。在某些实施方案中，所述氨基酸修饰对Fe y RIIb受体具有最小的影响，而对所述多肽与Fe Y RIIIa和/或Fe Y RIIa的结合产生有害效应。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰S239D/D265S/S298A/I332E。在某些其它实施方案中，所述多肽包含修饰G237F/S298A/A330L/I332E。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰H268D、K326A、A327H和备选的E269L和S298A中的一个或两个。在一个实施方案中，所述多肽包含修饰G237F/V266L/S267D。在某些实施方案中，所述多肽包含修饰L234F/S267G/N325L或L234F/S267E/N325L。在一个实施方案中，所述多肽包含修饰G236A/S239D/D270L/I332E。在本文所述的某些方面中，包含野生型Fe区的多肽与Fe Y受体的结合可经体外测定而检测。一方面，本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，其中所述修饰之一包含突变S239E，其中所述多肽与缺乏S239E突变的多肽相比在与Fe Y RIIIa受体的结合方面具有更高选择性。一方面，本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，其中修饰之一包含突变S239E，修饰之一包含突变S298A，其中所述多肽与缺乏S298A突变的多肽相比对Fe y RIIa受体和Fe y RIIb受体具有降低的结合亲和力。一方面，本文所提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，所述修饰选自D270L/Y300L/A330K、G237F/S267G/N325F、G237F/V266L/S267D、L234F/S267G/N325L、L234F/S267E/N325L、G237F/S239E/A327H、G237F/A327L/A330I、S239E/A327L/A330I、S239E/S267E/H268D、G237F/S239E/D270N、G236E/G237F/S239E、S239E/D265S/I332E、G237F/S239E/D265E、G237F/S239E/H268D、H268E/D270E/S267G、H268D/K326A/A327H、D265E/S267D/A330S、L235A/S239E/D265E、A327H/E269L/K236A、G237F/D270Q/S239E、A330V/I332L/K326 和 G236S/A327H/A330I。一方面，本文所提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少4个氨基酸修饰，所述修饰选自L235A/S239E/D265E/A327H、S239E/D265S/ H268D/I332E、S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E、和 G236E/D270N/A327V/I332E、G236A/S239D/D270L/I332E 和 H268D/E269L/S298A/K326A/A327H。一方面，本文所提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，其中所述至少3个氨基酸修饰选自L234Q、L234N、L235A、G236E、E236L、E236D、G237F、G237N、S239E、S239D、D265E、D265S、S267E、S267D、S267G、H268D、H268E、E269L、E269L、D270N、D270I、D270E、S298A、K326A、K326D、A327H、A327V、A327L、A327T、A330V、A330L、A330W、A330I、A330S、I332L、I332D 和 I332E。一方面，本文所提供的是包含变体Fe区的多肽，所述变体Fe区包括氨基酸修饰组合，其中所述组合选自L235A/S239E/D265E ；L235A/G237F/D265E ；S239E/E269D/A327H ；S239E/G237N/A327H ；S239E/G237F/A327V ；G237F/D270I/S239E ；G237F/A327L/S239E ；A327H/E269L/K326A；A330V/I332L/S239E；A327T/E269L/K326A ；D270N/A327T/K326A ；A330V/I332L/S239E ；A330ff/I332D/S239E ；G236E/D265E/A327H/A330I ；D270N/S298A/A327V ；G236E/D265E/D270N/A327H/A330I ；G236E/D270N/A327H/A330I ；G236E/D270N/A327V/I332E ；G236E/D270N/A327V/G237F ；L234N/S239E/A330I/I332E；L234Q/S239E/A330I/I332E ；L234Q/S239E/A330I/I332E/S298A ；G237F/S239D/D265E/D270N/S298A ；G237F/S239E/D270N/A330L/I332E ；G237F/S239E/D270N/A330L/I332E/S298A ；S239E/G237F/A327H ；G237F/A327L/A330I ；S239E/A330I/A327L ；D265E/S239E/L235A/A327H ；S267E/S239E/H268D ；G237F/D270N/S239E ；S239E/G237F/G236E ；I332E/D265S/S239E/H268D ；I332E/D265S/S239E ；D265E/S239E/G237F ；S239E/H268D/G237F ；S298A/D265S/S239D/I332E ；S298A/K326A/A327H/S239E ；S298A/G237F/A3330L/I332E ；H268E/D270E/S267G ；H268D/K326A/A327H ；H268D/K326A/A327H/E269L/S298A ；A330S/D265E/S267D ；S239E/S267E/H268D ；S237F/S239E/D265E 和 H268E/D270/E/S267G。一方面，本文提供的是包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含至少3个氨基酸修饰，其中当所述变体Fe区包含氨基酸修饰H268D时，所述变体不包含修饰S267E。在本文所述的多肽的某些实施方案中，亲本多肽的Fe区是人IgG Fe区。在某些这样的实施方案中，人IgG Fe区是人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的Fe区。在本文所 述的多肽的某些实施方案中，所述多肽是抗体。在某些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体、人源化抗体或人抗体。—方面是核酸，其包含编码本文所述的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中是包含所述核酸的载体。一方面是制备本文所述的多肽或蛋白的方法，所述方法包括(i)在适合所述多肽表达的条件下，在培养基中培养包含编码所述多肽的核酸的宿主细胞；和(ii)从所述培养基中回收所述多肽。本文所述的一方面是与癌靶抗原特异性结合的治疗用抗体，所述治疗用抗体包含本文所述的变体Fe区多肽。在某些实施方案中，所述治疗用抗体选自阿巴伏单抗(abagovomab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿伦珠单抗、aurograb、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗(belimumab)、贝伐珠单抗、briakinumab、卡那单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、培舍珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗、达克珠单抗、地舒单抗(denosumab)、依法珠单抗、加利昔单抗(galiximab)、吉妥珠单抗奥佐米星、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗、英利昔单抗、伊匹木单抗、鲁昔单抗、美泊利单抗、莫他珠单抗、莫罗单抗、mycograb、那他珠单抗、尼妥珠单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、培妥珠单抗、雷珠单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗、替利珠单抗(teplizumab)、托珠单抗/atlizumab、托西莫单抗、曲妥珠单抗、ProxiniumTM、RencarexTM、优特克单抗、扎芦木单抗(zalutumumab)和任何其它抗体。在某些实施方案中，所述靶抗原选自IL-2R的a-链(⑶25)、淀粉状蛋白P、抗EpCAM x抗⑶3、BLyS (或BAFF)、CDl I a、CD20、CD22、CD23、CD3、CD4、CD52、CD80、CTLA-4、EGFR、EpCAM, RSV 的 F蛋白、G250、糖蛋白 Ilb/IIIa R、HER2、HER2/neu R、Hsp90、IgE 抗体、IL-12/IL-23、IL_lb、IL-5、IL-6 受体、整联蛋白 a-4/3-1、粘蛋白 16/CA-125、RANKL、TNF a、VEGF-A 和其它治疗有利的靶标。本文所述的一方面是在患有以癌抗原为特征的癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的本文所述的治疗用抗体。在某些实施方案中，所述患者是人。本文所述的一方面是在患有以免疫抗原为特征的免疫性疾病的患者中治疗免疫性疾病的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效的本文所述的多肽、抗体或蛋白。一方面是药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的本文所述的多肽和药学上可接受的载体。本文所述的一方面是多肽，所述多肽包含具有至少3个氨基酸取代的变体Fe区，并且其中所述多肽在介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)方面比野生型更有效。在某些实施方案中，所述包含变体Fe区的多肽在介导ADCC方面的有效性是野生型的大约I. 5至大约100倍。在某些实施方案中，所述包含变体Fe区的多肽在介导ADCC方面的有效性是野生型的大约2至大约50倍。本文所述的一方面是多肽，所述多肽包含具有至少3个氨基酸取代的变体Fe区，其中所述多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面比野生型更有效。在某些实施方案中，所述包含变体Fe区的多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面的有效性是野生型的大约2倍。在某些实施方案中，所述包含变体Fe区的多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面的有效性是野生型的大约10倍。在某些实施方案中，所述包含变体Fe区的多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面的有效性是野生型的大约50倍。在某些实施方案中，所述包含变体Fe区的多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面的有效性是野生型的大约100倍。本文还提供根据对Fe y RIIa、Fc Y RIIb和/或Fe Y RIIIa的计算的结合亲和力在计算机芯片上鉴定Fe变体多肽的方法。在某些实施方案中，在计算机芯片上鉴定Fe变体多肽的方法进一步在计算机芯片上计算所述Fe变体多肽的静电学、溶剂化、堆积、堆积密度、氢键合和熵效应。在某些实施方案中，在计算机芯片上鉴定Fe变体多肽的方法还包括构建经鉴定的Fe变体多肽并在哺乳动物细胞中以抗体形式表达所述多肽。本文所述的Fe多肽和蛋白可针对多种性能进行优化。可经优化的性能包括但不限于对Fe Y R的亲和力增加或降低。在一个优选的实施方案中，本文所述 的Fe蛋白经优化而对人活化Fe y RI、优选对 Fe y RII.Fc y RIIa,Fe y RIIc,Fe y RIIIa和 Fe y Rlllb、最优选对Fe YRIIIa具有增加的亲和力。在一个备选优选的实施方案中，Fe蛋白经优化而对人抑制性受体Fe y RIIb具有降低的亲和力。预期这些优选的实施方案提供在人中具有增加的治疗性能(例如增加的效应子功能和更大的抗癌效力)的抗体和Fe融合物。在一个备选实施方案中，本文所述的Fe蛋白经优化而对人Fe y RI具有降低的或消除的亲和力，所述人Fe y RI 包括但不限于 Fe y RH、Fe y RIIa, Fe y RIIb, Fe y RIIc, Fe y RIIIa 和 Fe y RIIIb0预期这些实施方案提供在人中具有增加的治疗性能(例如降低的效应子功能和降低的毒性)的抗体和Fe融合物。优选的实施方案包括Fe与人Fe Y R结合的优化，然而在备选实施方案中，本发明的Fe多肽和蛋白对来自非人类生物的Fe Y R具有增加或降低的亲和力，所述非人类生物包括但不限于小鼠、大鼠、兔和猴。针对与非人Fe Y R结合优化的Fe蛋白在实验中可找到用途。例如，小鼠模型可用于各种各样的疾病，这使得能够测试给定药物候选者的性能，例如功效、毒性和药物动力学。正如本领域已知，可将癌细胞移植或注射到小鼠，以模拟人类癌症，该过程称为异种移植。对包含针对一种或多种小鼠Fe y R优化的Fe蛋白的抗体或Fe融合物进行测试，可提供有关抗体或Fe融合物的功效、其作用机制等的有价值的信息。在某些实施方案中，本文所述的Fe多肽和蛋白以无糖基化形式(aglycosylatedform)针对增加的功能性和/或溶液性能进行优化。在一个示例性的实施方案中，本文所述的无糖基化的Fe蛋白以比亲本Fe多肽的无糖基化形式更高的亲和力与Fe配体结合。所述Fe配体包括但不限于Fe YR、Clq、FcRn和蛋白A和蛋白G，并且可来自任何来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔或猴，优选人。在一个备选优选的实施方案中，所述Fe蛋白经优化而比亲本Fe多肽的无糖基化形式更稳定和/或更可溶。经改造或预测展示任何前述优化性能的Fe蛋白在本文中称为“经优化的Fe蛋白”。在某些实施方案中，本文所述的Fe多肽和蛋白源自亲本Fe多肽，所述亲本Fe多肽本身来自广泛来源。在某些实施方案中，所述亲本Fe多肽基本上由来自任何生物体的一个或多个Fe基因编码，所述生物体包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、骆驼、美洲驼(llama)、单峰骆骑(dromedary)、猴,优选哺乳动物和最优选人和小鼠。在一个实施方案中,所述亲本Fe多肽包括抗体，称为亲本抗体。在某些实施方案中，所述亲本抗体是完全人的，其使用例如转基因小鼠(Bruggemann 等，1997，Curr Opin Biotechnol 8:455-458)或与选择方法偶联的人抗体文库(Griffiths 等，1998，Curr Opin Biotechnol 9:102-108)而获取。所述亲本抗体不必是天然存在的。在某些实施方案中，所述亲本抗体是工程抗体，其包括但不限于嵌合抗体和人源化抗体(Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402)。在某些实施方案中，所述亲本抗体是基本上由一个或多个天然抗体基因编码的抗体的经改造的变体。在一个实施方案中，如本领域已知，所述亲本抗体经亲和力成熟。或者，所述抗体以某些其它方式进行修饰，所述方式例如描述于2003年3月3日提交的美国顺序号10/339，788。在某些实施方案中，本文所述的Fe蛋白基本上由属于任何抗体类别的免疫球蛋白基因编码。在一个示例性的实施方案中，本文所述的Fe蛋白可用于抗体或Fe融合物，其包含属于抗体IgG类别的序列，所述IgG类别包括IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一个备选实施方案中，本文所述的Fe蛋白可用于抗体或Fe融合物，其包含属于抗体的IgA (包括亚类IgAl和IgA2)、IgD、IgE、IgG或IgM类别的序列。在某些实施方案中，本文所述的Fe蛋白包含不止一条蛋白链。也就是说，在某些实施方案中，本文所述的多肽可用于抗体或Fe融合物，其是单体或寡聚体，包括同型寡聚体或异型寡聚体。在某些实施方案中，本发明的抗体基于人类序列，因此人类序列用作“基础”序列，将其它序列例如大鼠、小鼠和猴的序列与人类序列进行比较。为了确立与一级序列或·结构的同源性，将前体或亲本Fe多肽的氨基酸序列与本文所概述的人Fe序列直接比较。序列比对之后，使用本领域已知的一个或多个同源性比对程序(例如使用在物种之间保守的残基)，允许必要的插入和缺失以便维持比对(即避免通过任意缺失和插入而消除保守残基)，确定等同于人Fe —级序列中的特定氣基酸的残基。保守残基的比对优选应保留100%的这类残基。然而，大于75%或小至50%的保守残基的比对也足以限定等同残基(equivalent residue)(有时称为“对应残基”)。也可通过在已测定其三级结构的Fe多肽的三级结构水平上测定同源性而限定等同残基。等同残基定义为在比对之后亲本或前体的特定氨基酸残基的两个或更多个主链原子的原子坐标(N在N、CA在CA、C在C以及0在0上)在0. 13 nm内和优选在0. I nm内的那些。在最佳模型被定向和定位以给出Fe多肽的非氢蛋白原子的原子坐标的最大重叠之后完成比对。在某些实施方案中，将本文所述的Fe多肽与其它Fe修饰组合，所述修饰包括但不限于改变效应子功能或者改变与一种或多种Fe配体的相互作用的修饰。在某些实施方案中，这些组合在抗体或Fe融合物中提供累加的性能、协同的性能等。在一个实施方案中，将本文所述的Fe蛋白与其它已知的Fe蛋白(Duncan等，1988，Nature 332:563-564 ;Lund等，1991，J Immunol 147:2657-2662 ;Lund 等，1992，Mol Immunol 29:53-59 ；Alegre等，1994，Transplantation 57:1537-1543 ;Hutchins 等，1995，Proc Natl Acad SciUSA 92:11980-11984 Jefferis 等，1995，Immunol Left 44:111-117 ;Lund 等，1995，Faseb J9:115-119 ;JefTeris 等，1996，Immunol Left 54:101-104 ;Lund 等，1996，JImmunol 157:4963-4969 ;Armour 等，1999，Eur J Immunol 29:2613-2624 ;Idusogie等，2000，J Immunol 164:4178-4184 ;Reddy 等，2000，J Immunol 164:1925-1933 ;Xu等，2000，Cell Immunol 200:16-26 ;Idusogie 等，2001，J Immunol 166:2571-2575 ；Shields 等，2001，J Biol Chem 276:6591-6604 Jefferis 等，2002，Immunol Lett82:57-65 ；Presta 等，2002， Biochem Soc Trans 30:487-490 ;Hinton 等，2004， JBiol Chem 279:6213-6216)(美国专利号 5，624，821 ;美国专利号 5，885，573 ;美国专利号 6，194，551 ；PCT WO 00/42072 ；PCT WO 99/58572 ；US 2004/0002587 Al)组合。在一个备选实施方案中，将本文所述的Fe蛋白掺入到包含一种或多种经改造的糖形的抗体或Fe融合物中。本文所用的“经改造的糖形”意指与Fe多肽共价连接的碳水化合物组分，其中所述碳水化合物组分在化学上不同于亲本Fe多肽。经改造的糖形可用于各种各样的目的，包括但不限于增加或降低效应子功能。经改造的糖形可通过本领域已知的多种方法产生(Umana 等，1999，Nat Biotechnol 17:176-180 ;Davies 等，2001，Biotechnol Bioeng74:288-294 ;Shields 等，2002，J Biol Chem 277:26733-26740 ;Shinkawa 等，2003，J Biol Chem 278:3466-3473);(美国专利号 6，602，684 ;美国顺序号 10/277，370 ;美国顺序号 10/113, 929 ；PCT WO 00/61739A1 ；PCT WO 01/29246A1 ；PCT WO 02/31140A1 ；PCT WO02/30954A1) ; (Potelligent 技术[Biowa, Inc. , Princeton, N.J.] ;GlycoMAb 糖基化改造技术[GLYCART bio technology AG, Zurich, Switzerland])。许多这样的技术是基于控制岩藻糖基化水 平和/或对分与Fe区共价连接的寡糖，例如通过在多种经改造或没有改造的生物体或者细胞系(例如Lec-13 CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞)中表达Fe多肽，通过调节参与糖基化途径的酶(例如FUT8 [a 1,6-岩藻糖基转移酶]和/或P 1_4_N_乙酰葡糖氨基转移酶III [GnTIII])，或通过在Fe多肽表达之后修饰碳水化合物。经改造的糖形通常是指不同碳水化合物或寡糖；因此Fe多肽，例如抗体或Fe融合物，可包含经改造的糖形。或者，经改造的糖形可指包含不同的碳水化合物或寡糖的Fe多肽。因此，考虑本文所述的Fe蛋白与其它Fe修饰以及未发现的Fe修饰的组合，目标是产生具有经优化性能的抗体或Fe融合物。在某些实施方案中，本文所述的变体Fe蛋白和多肽可用于抗体。本文所用的“本文所述的抗体”意指包含本文所述的Fe蛋白的抗体。事实上，本发明可用于包含Fe的任何蛋白，因此，本文所述的Fe多肽和蛋白的用途不限于抗体。本文所述的Fe蛋白可用于Fe融合物。本文所用的“本文所述的Fe融合物”是指包含本文所述的Fe蛋白的Fe融合物。Fe融合物可包含与以下成分可操作地连接的本文所述的Fe蛋白细胞因子、可溶性受体结构域、粘附分子、配体、酶、肽或其它蛋白或蛋白结构域，并且包括但不限于以下文献所述的Fe融合物:美国专利号5，843，725 ;美国专利号6，018，026 ;美国专利号6，291，212 ；美国专利号6，291，646 ;美国专利号6，300，099 ;美国专利号6，323，323 ；PCT WO 00/24782 ；和 Chamow 等，1996，Trends Biotechnol 14:52-60 ;Ashkenazi 等，1997，Curr OpinTmmunOI 9:195-200。几乎任何抗原都可被本文所述的蛋白和多肽靶定，包括但不限于以下蛋白列表、属于下列蛋白列表的亚基、结构域、基序和表位⑶2、⑶3、⑶3E、⑶4、⑶11、⑶11a、⑶14、CD16、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33 (p67 蛋白)、CD38、CD40、CD40L、CD52、CD54、CD56、CD80、CD147、GD3、IL-U IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5,IL-6、IL-6R、IL-8、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、干扰素 a、干扰素 ^、干扰素 y ；TNF-a、TNFP 2、TNFc、TNFa ^ 、TNF-RI、TNF-RII、FasL、CD27L、CD30L、4_lBBL、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、LIGHT、VEGI、0X40L、TRAIL 受体-I、Al 腺苷受体、淋巴毒素 P 受体、TACI、BAFF-R、EPO ;LFA-3、ICAM-U I CAM-3, EpCAM、整联蛋白 P I、整联蛋白 P 2、整联蛋白 a 4/￠7、整联蛋白a2、整联蛋白a3、整联蛋白a4、整联蛋白a5、整联蛋白a6、整联蛋白a V、a VP 3整联蛋白、FGFR-3、角质形成细胞生长因子、VLA_1、VLA_4、L-选择蛋白、抗Id、E-选择蛋白、HLA、HLA-DR、CTLA-4、T 细胞受体、B7_1、B7_2、VNR 整联蛋白、TGFP 1、TGF3 2、嗜酸性粒细胞趋化因子I、BLyS (B-淋巴细胞刺激物)、补体C5、IgE、因子VII、CD64、CBL、NCA 90、EGFR (ErbB-I)、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)、组织因子、VEGF, VEGFR、内皮素受体、VLA-4、半抗原NP-cap或NIP-cap、T细胞受体a / 0、E-选择蛋白、地高辛、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)和睾丸PLAP样碱性磷酸酶、转铁蛋白受体、癌胚抗原(CEA)、CEACAM5、HMFG PEM、粘蛋白MUCl、MUC18、肝素酶I、人心肌肌球蛋白、肿瘤相关糖蛋白-72 (TAG-72)、肿瘤相关抗原CA 125、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)、癌相关抗原、Gcoprotein Ilb/IIIa (GPIIb/IIIa)、表达肿瘤相关抗原的Lewis Y相关碳水化合物、人巨细胞病毒(HCMV) gH包膜糖蛋白、HIV gpl20、HCMV、呼吸道合胞病毒RSV F、RSVF Fgp、VNR整联蛋白、IL-8、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、H印Bgpl20、CMV、gpllbllla、HIV IIIB gpl20 V3 环、呼吸道合胞病毒(RSV) Fgp、单纯疱疹病毒(HSV) gD糖蛋白、HSV gB糖蛋白、HCMV gB包膜糖蛋白和产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)毒素。本领域技术人员将会理解，上述靶标列表不仅指具体的蛋白和生物分子，而且指包括它们的生化途径。例如，对作为靶抗原的CTLA-4的提及，暗示构成T细胞共刺激途径的配体和受体(包括CTLA-4、B7-1、B7-2、⑶28和与这些蛋白结合的任何其它未发现的配体或受体)也都是靶标。因此本文所用的靶不仅指特定的生物分子，而且指与所述靶标相互作用的蛋白和所述靶标所属的生物途径的成员的集合。本领域技术人员还将理解，任何上述靶抗原、与它们结合的配体或受体或它们相应生化途径的其它成员，都可与本文所述的Fe蛋白可操作地连接，以产生Fe融合物。因此，例如可通过将Fe蛋白与EGF、TGFa或者已发现或未发现的与EGFR结合的任何其它配体可操作地连接，而构建靶向EGFR的Fe融合物。因此，可将本文所述的Fe蛋白与EGFR可操作地连接，以产生Fe融合物，其与EGF、TGFa或者已发现或未发现的与EGFR结合的任何其它配体结合。因此几乎任何多肽，无论是配体、受体还是某些其它蛋白或蛋白结构域(包括但不限于上述靶标和组成它们相应生化途径的蛋白质)，都可与本文所述的Fe蛋白可操作地连接，以开发Fe融合物。已批准使用、处于临床试验中或正在开发之中的多种抗体和Fe融合物能从本文所述的Fe蛋白获益。所述抗体和Fe融合物在本文中称为“临床产品和候选者”。因此在一个优选的实施方案中，本文所述的Fe蛋白可用于各种临床产品和候选者。例如,革巴定CD20的多种抗体可从本文所述的Fe蛋白获益。例如本文所述的Fe蛋白可用于以下抗体 其基本上类似于利妥昔单抗(Rituxan , IDEC/Genentech/Roche)(参见例如美国专利号5，736，137),—种批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma)的嵌合抗⑶20抗体；HuMax-⑶20 (目前正由Genmab开发的一种抗⑶20)，美国专利号5，500, 362所描述的抗 CD20 抗体，AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics,Inc.)和HumaLYM (Intracel)。祀定表皮生长因子受体家族成员(包括EGFR (ErbB-I)、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4))的多种抗体，可从本文所述的 Fe蛋白获益。例如本文所述的Fe蛋白可用于以下抗体其基本上类似于曲妥珠单抗(赫赛汀 ，Genentech)(参见例如美国专利号5，677，171)，一种批准用于治疗乳癌的人源化抗Her2/neu抗体；培妥珠单抗(rhuMab_2C4, Omnitarg ),目前由Genentech开发；美国专利号4，753，894所描述的抗Her2抗体；西妥昔单抗(Erbitux )，Imclone)(美国专利号4，943，533屮(^ WO 96/40210)，一种处于各种癌症的临床试验中的嵌合抗EGFR抗体；ABX_EGF (美国专利号 6，235，883)，目前由 Abgenix/Immunex/Amgen 开发；HuMax_EGFr(美国顺序号 10/172，317)，目前由 Genmab 开发；425，EMD55900，EMD62000 和 EMD72000(Merck KGaA)(美国专利号 5，558，864 ；Murthy 等，1987，Arch Biochem Biophys.252(2) :549-60 ;Rodeck 等，1987，J Cell Biochem. 35 (4) : 315-20 ;Kettleborough 等，1991，Protein Eng. 4 (7):773-83) ；ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT WO95/20045 ;Modjtahedi 等，1993，J. Cell Biophys. 1993，22(1-3) :129-46 ；Modjtahedi等，1993，Br J Cancer. 1993，67 (2) : 247-53 ;Modjtahedi 等，1996，Br J Cancer,73(2) :228-35 ;Modjtahedi 等，2003，Int J Cancer, 105(2) :273-80) ；TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba (美国专利号5，891，996;美国专利号 6，506，883 ;Mateo 等，1997，Immunotechnology, 3(1) :71-81)；mAb-806 (Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth 等 2003，Proc Natl Acad Sci USA. 100 (2) : 639-44) ;KSB_102 (KSBiomedix) ;MR1_1 (IVAX, National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2);和 SClOO(Scancell) (PCT WO 01/88138)。在另一个优选的实施方案中，本文所述的Fe蛋白可用于阿伦珠单抗(Campath ，Millenium)，其是目前批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病的一种人源化单克隆抗体。本文所述的Fe蛋白可用于各种抗体或Fe融合物，其基 本上类似于其它临床产品和候选者，包括但不限于莫罗单抗-CD3 (Orthoclone 0KT3 )，由 Ortho Biotech/Johnson & Johnson 开发的一种抗 CD3 抗体；替伊莫单抗(Zevalin )，由IDEC/Schering AG开发的一种抗⑶20抗体；吉妥珠单抗奥佐米星(Mylotarg )，由Celltech/Wyeth开发的一种抗⑶33 (p67蛋白)抗体；阿来西普(Amevive )，由Biogen开发的一种抗LFA-3 Fe融合物；阿昔单抗(ReoPro )，由Centocor/Lilly开发；巴利昔单抗(Simulect )，由Novartis开发；帕利珠单抗(Synagis )，由MedImmune开发；英利昔单抗(Remicade )，由Centocor开发的一种抗TNF a抗体；阿达木单抗(Humira )，由Abbott开发的一种抗TNFa抗体；Humicade ，由Celltech开发的一种抗TNF a抗体；依那西普(EnbreI )，由 Immunex/Amgen 开发的一种抗 TNF a Fe 融合物；ABX_CBL，由 Abgenix 开发的一种抗⑶147抗体；ABX_IL8，由Abgenix开发的一种抗1L8抗体；ABX_MA1，由Abgenix开发的一种抗 MUC18 抗体；Pemtumomab (R1549， sup. 90Y-muHMFGl)，由 Antisoma 开发的一种抗 MUCl ；Therex (R1550)，由 Antisoma 开发的一种抗 MUCl 抗体；AngioMab (AS1405)，由 Antisoma 开发；HuBC-1,由 Antisoma 开发；Thioplatin (AS1407)，由 Antisoma 开发；Antegren )(那他珠单抗)，由 Biogen 开发的一种抗 ct -4__P -I (VLA-4)和 a -4__P _7抗体；VLA_1 mAb，由Biogen开发的一种抗VLA-1整联蛋白抗体；LTBR mAb，由Biogen开发的一种抗淋巴毒素 P 受体(LTBR)抗体；CAT_152，由 Cambridge Antibody Technology开发的一种抗 TGF. & 2 抗体；J695,由 Cambridge Antibody Technology 和 Abbott 开发的一种抗 IL-12 抗体；CAT_192，由 Cambridge Antibody Technology 和 Genzyme 开发的一种抗 TGF. & I 抗体；CAT_213，由 Cambridge Antibody Technology 开发的一种抗嗜酸性粒细胞趋化因子 I 抗体；LymphoStat_B ，由 Cambridge Antibody Technology 和 HumanGenome Sciences Inc.开发的一种抗 Blys 抗体；TRAIL-RlmAb，由 Cambridge AntibodyTechnology 和 Human Genome Sciences, Inc.开发的一种抗 TRAIL-Rl 抗体；Avastin (贝伐珠单抗，rhuMAb-VEGF)，由Genentech开发的一种抗VEGF抗体；由Genentech开发的一种抗!ER受体家族抗体；抗组织因子(ATF)，由Genentech开发的一种抗组织因子抗体；Xolair (奥马珠单抗)，由Genentech开发的一种抗IgE抗体；Raptiva (依法珠单抗)，由Genentech和Xoma开发的一种抗OHa抗体，MLN-O2抗体(先前为LDP-02),由Genentech 和 Millenium Pharmaceuticals 开发；HuMax CD4,由 Genmab 开发的一种抗 CD4抗体；HuMax_IL15,由 Genmab 和 Amgen 开发的一种抗 IL15 抗体；HuMax_Inflam,由 Genmab和 Medarex 开发；HuMax_Cancer,由 Genmab 和 Medarex 和 Oxford GcoSciences 开发的一种抗肝素酶 I 抗体；HuMax-Lymphoma,由 Genmab 和 Amgen 开发；HuMax-TAC,由 Genmab 开发；IDEC-131,由 IDEC Pharmaceuticals 开发的一种抗 CD40L抗体；IDEC_151 (克立昔单抗)，由 IDEC Pharmaceuticals 开发的一种抗 CD4 抗体；IDEC_114,由 IDEC Pharmaceuticals开发的一种抗CD80抗体；IDEC-152，由IDEC Pharmaceuticals开发的一种抗CD23 ;抗巨曬细胞迁移因子(MIF)抗体，由IDEC Pharmaceuticals开发；BEC2,由Imclone开发的一种抗独特型抗体；IMC-1C11,由Imclone开发的一种抗KDR抗体；DC101,由Imclone开发的一种抗flk-1抗体；抗VE I丐粘蛋白抗体，由Imclone开发；CEA_Cide (拉贝珠单抗)，由Immunomedics开发的一种抗癌胚抗原(CEA)抗体；LymphoCide (依帕珠单抗)，由Immunomedics 开发的一种抗 CD22 抗体；AFP_Cide,由 Immunomedics 开发；MyelomaCide,·由 Immunomedics 开发；LkoCide,由 Immunomedics 开发；ProstaCide,由 Immunomedics 开发；MDX_010,由Medarex开发的一种抗CTLA4抗体；MDX_060,由Medarex开发的一种抗CD30 抗体；MDX-070，由 Medarex 开发；MDX_018，由 Medarex 开发；0sidem (IDM-I)，和抗 Her2 抗体，由 Medarex 和 Immuno-Designed Molecules 开发；HuMax _CD4,由 Medarex和Genmab开发的一种抗CD4抗体；HuMax_IL15,由Medarex和Genmab开发的一种抗IL15抗体；CNTO 148，由 Medarex 和 Centocor/J&J 开发的一种抗 TNF. a 抗体；CNTO 1275，由Centocor/J&J开发的一种抗细胞因子抗体；M0R101和M0R102,由MorphoSys开发的抗胞间粘附分子-I (ICAM-I) (CD54)抗体；M0R201，由MorphoSys开发的一种抗成纤维细胞生长因子受体 3 (FGFR-3)抗体；Nuvion (visilizumab),由 Protein Design Labs 开发的一种抗⑶3抗体；HuZAF ,由Protein Design Labs开发的一种抗Y干扰素抗体；抗.正交(quadrature). 5.正交 I 整联蛋白，由 Protein Design Labs 开发；抗 IL-12,由 ProteinDesign Labs开发；ING_1,由Xoma开发的一种抗Ep-CAM抗体；和MLNOl,由Xoma开发的一种抗P 2整联蛋白抗体。Fe多肽、蛋白在上述抗体和Fe融合物临床产品和候选者中的应用并非意在限制于其具体的组成上。在某些实施方案中，将本文所述的Fe蛋白结合到上述临床候选者和产品中，或掺入到基本上类似于它们的抗体和Fe融合物中。在某些实施方案中，将本文所述的Fe蛋白掺入到经人源化、亲和力成熟、经改造或经某些其它方式修饰的上述临床候选者和产品的形式中。此外，上述临床产品和候选者的完整多肽不必用于限制掺入本文所述的Fe蛋白的新抗体或Fe融合物；例如可以使用临床产品或候选者抗体的仅仅可变区、基本类似的可变区、或可变区的经人源化、亲和力成熟、经改造或经修饰的形式。在另一个实施方案中，本文所述的Fe蛋白和多肽用于这样的抗体或Fe融合物其掺入与上述临床产品和候选者之一所掺入的相同的表位、抗原、配体或受体。一方面，本文所述的Fe多肽用于宽范围的抗体和Fe融合产物。在一个实施方案中，包含本文所述的Fe多肽或蛋白的抗体或Fe融合物是治疗试剂、诊断试剂或研究试剂，优选治疗试剂。在某些其它实施方案中，抗体和Fe融合物包含本文所述的基于Fe的多肽并用于农业或工业用途。在一个备选实施方案中，本文所述的Fe蛋白和多肽组成经实验筛选的文库。在某些实施方案中，该文库包括一列核酸或氨基酸序列。在某些其它实施方案中，所述文库是编码文库序列的核酸或多肽的物理组成。在某些实施方案中，所述Fe蛋白用于作为单克隆或多克隆的抗体组 成。本文所述的抗体和Fe融合物包括但不限于激动剂、拮抗剂、中和剂、抑制剂或刺激剂。在一个示例性的实施方案中，本文所述的抗体和Fe融合物用于杀伤携带靶抗原的靶细胞，例如癌细胞。在一个备选实施方案中，本文所述的抗体和Fe融合物用于阻断、拮抗或激动靶抗原，例如用于拮抗细胞因子或细胞因子受体。在一个备选实施方案中，本文所述的抗体和Fe融合物用于阻断、拮抗或激动靶抗原和杀伤携带靶抗原的靶细胞。在某些实施方案中，本文所公开的多肽可用于调节免疫应答，例如可用于抑制自身免疫性疾病或炎性疾病相关的免疫应答中。这样的多肽在治疗和/或预防自身免疫性疾病中具有治疗用途。可通过给予本文所公开的多肽而治疗的自身免疫性疾病的实例包括但不限于斑秃、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、自身免疫阿狄森病(autoimmuneAddison’s disease)、肾上腺自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少、贝切特病(Behcet’s disease)、大庖性类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻-皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、丘-施综合征(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病(Crohn’s disease)、盘状狼疮、特发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病(Graves’ disease)、格林-巴利症(Guillain-Barre)、桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、幼年型关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、梅尼尔氏病(Meniere’s disease)、混合性结缔组织病、多发性硬化、I型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、polychrondritis、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、银屑病、银屑病性关节炎、雷诺现象(Raynaud’s phenomenon)、莱特尔综合征(Reiter’s syndrome)、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、僵体综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎(temporal arteristis)/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、脉管炎例如疱疹样皮炎脉管炎、白癫风和韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)。炎性病症的实例包括但不限于哮喘、脑炎(encephilitis)、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、变应性疾病、脓毒性休克、肺纤维化、未分化的脊椎关节炎(undifferentitated spondyloarthropathy)、未分化的关节炎、关节炎、炎性骨质溶解和慢性病毒性或细菌性感染所致的慢性炎症。可按照本发明方法预防、治疗或控制的炎性病症的实例包括但不限于哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、变应性疾病、脓毒性休克、肺纤维化、未分化的脊椎关节炎、未分化的关节病、关节炎、炎性骨质溶解和慢性病毒性或细菌性感染所致的慢性炎症。本文所述的Fe多肽用于多种治疗目的。在某些实施方案中，将所述Fe多肽和蛋白给予患者，以治疗抗体相关病症。对于本文所述目的而言，“患者”包括人和其它动物，优选哺乳动物和最优选人。因此本文所述的抗体和Fe融合物具有人类治疗和兽医用途。在优选的实施方案中，所述患者是哺乳动物，在最优选的实施方案中，所述患者是人。本发明的术语“治疗”意在包括用于疾病或病症的治疗性治疗以及预防性或抑制性措施。因此，例如，在疾病发作之前成功给予抗体或Fe融合物导致对所述疾病的治疗。作为另一实例，在疾病临床表现之后为了抗击疾病症状而成功给予经优化的抗体或Fe融合物，包括对疾病的治疗。“治疗”也包括在疾病出现之后给予经优化的抗体或Fe融合蛋白以根除疾病。已经开发了在发作之后和临床症状之后药物的成功给予，临床症状的可能减轻和疾病的可能改善，包括治疗疾病。“需要治疗”的那些包括已患疾病或病症的哺乳动物，以及易患疾病或病症的那些，包括待预防疾病或病症的那些。本文的“抗体相关病症”或“抗体响应性病症”或“病况”或“疾病”意指可通过给予包含本文所述的抗体或Fe融合物的药物组合物改善的病症。抗体相关病症包括但不限于自身免疫性疾病、免疫性疾病、感染性疾病、炎性疾病、神经学疾病和肿瘤学疾病和瘤形成疾病(包括癌症)。本文的“癌症”和“癌的”是指或描述在哺乳动物中的通常以不受调节的细胞生长为特征的生理学病况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、雪旺氏瘤(schwanoma)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌 (例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤以及头颈癌。此夕卜，本文所述的Fe蛋白可用于治疗包括但不限于的病况充血性心力衰竭(CHF)、脉管炎、红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和其它心肌病况、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞和骨髓基质；骨丢失；佩吉特病(Paget’ s disease)、破骨细胞瘤；多发性骨髓瘤；乳癌；废用性骨质减少；营养不良、牙周病、高歇病(Gaucher’s disease)、郎格汉斯细胞组织细胞增生症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化、库欣综合征(Cushing’s syndrome)、单骨纤维性结构不良(monoostotic fibrous dysplasia)、多骨纤维性结构不良、牙周重建和骨折；结节病；多发性骨髓瘤；溶骨性骨癌、乳癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛控制、和体液恶性高钙血症、强直性脊椎炎和其它脊椎关节病；移植排斥、病毒性感染、血液学肿瘤和肿瘤样病况例如霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma);非霍奇金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤(Burkitt’ s lymphoma)、小淋巴细胞性淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病、蕈样真菌病、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、边缘带淋巴瘤、毛细胞性白血病和淋巴衆细胞性白血病(lymphoplamacytic leukemia)、淋巴细胞前体细胞肿瘤(包括B细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤和T细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、胸腺瘤)、成熟T和NK细胞肿瘤(包括外周T细胞白血病、成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大颗粒性淋巴细胞性白血病、郎格汉斯细胞组织细胞增生症、骨髓瘤形成例如急性髓细胞性白血病，包括成熟的AML、未分化的AML、急性前髓细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生病症，包括慢性髓细胞性白血病、中枢神经系统肿瘤(例如脑瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和视网膜母细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、和血管系统肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、骨质疏松症、肝炎、HIV、AIDS、脊椎关节炎、类风湿性关节炎、炎性肠病(IBD)、脓毒病和脓毒性休克、克罗恩病、银屑病、schleraderma、移植物抗宿主病(GVHD)、同种异体胰岛移植排斥、血液学恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓细胞性白血病(AML)、肿瘤相关炎症、周围神经损伤或脱髓鞘病。在一个实施方案中，将本文所述的抗体或多肽给予患有涉及蛋白不适当表达的疾病的患者。在本文所述的范围之内，这意在包括以异常蛋白为特征的疾病和病症，所述异常蛋白因例如存在的蛋白量的改变、突变蛋白的存在或这两者所致。过多可因任何原因所致，包括但不限于与正常相比在分子水平上的过量表达、在作用部位延长或积累的出现、或蛋白活性增加。包括在该定义之内的是以蛋白减少为特征的疾病和病症。这样的减少可因任何原因所致，包括但不限于与正常相比在分子水平上的表达减少、在作用部位上缩短或减少的出现、蛋白的突变形式或蛋白活性下降。可相对于蛋白的正常表达、出现或活性检测这类蛋白的过多或减少，并且所述检测可在本文所述的抗体和Fe融合物的开发和/或临床试验中起到重要作用。
在一个实施方案中,本文所述的抗体或多肽是给予患者的仅有的治疗活性剂。或者，本文所述的抗体或Fe融合物与一种或多种其它治疗剂联合给予，所述其它治疗剂包括但不限于细胞毒性剂、化疗药、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管生成齐U、保心药或其它治疗剂。这类分子在联用中适宜以对预期目的有效的量存在。有技术的医学从业人员可凭经验确定本文所用的其它治疗剂的合适剂量。本文所述的抗体和多肽可以与一种或多种其它治疗方案同时给予。例如，本文所述的抗体或多肽可与化疗、放疗或者化疗和放疗这两者一起给予患者。在一个实施方案中，本文所述的抗体或Fe融合物可与一种或多种抗体或多肽(其可包含或不含本文所述的Fe蛋白)联合给予。在一个实施方案中，将本文所述的抗体和多肽与化疗药一起给予。本文所用的“化疗药”意指用于治疗癌症的化合物。化疗药的实例包括但不限于烷化剂，例如塞替派和环磷酰胺(CYTOXAN );烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa);乙撑亚胺和氨基卩丫唳(methylamelamines),包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺(trietyIenephosphoramide)、三亚乙基硫代憐酉先胺(triethyIenethiophosphaoramide)和三轻甲蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氧化氮芥盐酸盐、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲(nitrosureas)例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、刺孢霉素、carabicin、caminomycin、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6- 二氮杂-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素(potfiromycin)、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢齐U，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟脲苷、5-FU;雄激素，例如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺剂，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂例如亚叶酸(frolinic acid);醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；安吖啶Aestrabucil ;比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；elformithine ;依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；轻基脲；香燕多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁 ；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；PSK ;雷佐生；西佐喃(sizofuran);锗螺胺；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌；2，2’，2’三氯三乙基胺；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烧；gacytosine ;阿拉伯糖苷("Ara-C");环磷酰胺；塞替派；紫杉烧类，例如紫杉醇(泰素 ，Bristol-Myers SquibbOncology, Princeton, N. J.)和多西他赛(泰索帝 ，Rhne-Poulenc Rorer, Antony,France);苯丁酸氮芥；吉西他滨；6_硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；钼类似物，例如顺钼和卡钼；长春碱；钼；依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C ;米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨基喋呤；希 罗达；伊班膦酸盐；CPT-11 ;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);视黄酸；esperamicins ;卡培他滨；胸苷酸合酶抑制剂(例如Tomudex) ;cox_2抑制剂、例如celicoxib (CELEBREX )或MK-0966(VIOXX );和上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物。还包括在该定义中的是抗激素剂(其作用是调节或抑制激素对肿瘤的作用)，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑类、4-轻基他莫昔芬、曲沃昔芬、凯奥昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和以上任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，给予作为前药的化疗药或其它细胞毒性剂。本文所用的“前药”意指药物活性物的前体或衍生物形式，其对肿瘤细胞的细胞毒性小于亲本药物并且能够经酶促活化或转化为更具活性的亲本形式。参见例如Wilman, 1986，Biochemical Society Transactions, 615th Meeting Belfast, 14:375-382 ;和 Stella等，〃Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, 〃 Directed DrugDelivery, Borchardt 等(编著)247-267，Humana Press, 1985。可用于本发明的前药包括但不限于含磷酸酯的前药、含硫代磷酸酯的前药、含硫酸酯的前药、含肽的前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化前药、含内酰胺的前药、含任选取代的苯氧基乙酰胺的前药或含任选取代的苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药，其可转化为更具活性的细胞毒性的游离药物。可衍生为用于与本文所述的抗体和Fe融合物一起使用的前药形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于任何上述化疗药。在某些实施方案中，本文所述的蛋白和多肽与其它治疗方案联合。例如，在一个实施方案中，待用所述抗体或Fe融合物治疗的患者也接受放疗。可按照本领域常用和技术人员已知的方案给予放疗。这样的治疗包括但不限于铯、铱、碘或钴辐射。在某些实施方案中，所述放疗是全身辐射，或局部定向到体内或体表的具体部位或组织，例如肺、膀胱或前列腺。通常，放疗在大约1-2周的时间周期内脉冲给予。在某些实施方案中，所述放疗在更长的时间周期内给予。在一个实施方案中，将放疗给予患有头颈癌的患者达大约6至大约7周。任选，以单剂量或多个序贯剂量给予放疗。熟练的医疗从业人员可凭经验确定可用于本文的合适的放疗剂量。依照本发明的另一个实施方案，将本文所述的抗体或Fe融合物以及一种或多种其它抗癌治疗用于离体治疗癌细胞。预期的是，这样的离体治疗可用于骨髓移植、尤其是自体骨髓移植。在某些实施方案中，在受体患者中的移植之前，将用抗体或Fe融合物以及一种或多种其它抗癌治疗(例如上述治疗)对含癌细胞的细胞或组织进行的治疗，用于耗尽或基本上耗尽癌细胞。在某些实施方案中，本发明的蛋白和Fe融合物用于与又另外的治疗技术例如手术联合。在一个备选实施方案中，将本文所述的抗体和多肽与细胞因子一起给予。本文所用的“细胞因子”意指由一种细胞群体所释放的、作为细胞间介导物而作用于另一种细胞的蛋白质的通用术语。这类细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体化激素(LH);肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-a和肿瘤坏死因子-3 ;缪勒管抑制物质；小鼠促性腺素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO);神经生长因子，例如NGF-P ;血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，例如TGF-a和TGF-P ;胰岛素样生长因子-I和-II ;红细胞生成素(EPO);骨诱导因子；干扰素,例如干扰素-a、-0和-Y ;集 落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF (M-CSF);粒细胞-巨噬细胞-CSF (GM-CSF);和粒细胞-CSF (G-CSF);白介素(IL)例如 IL-U IL-I a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6, IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-II、IL-12、IL-15 ;肿瘤坏死因子，例如 TNF-a 或 TNF-P ;和其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。本文所用的术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。各种各样的其它治疗剂可用于与本文所述的Fe变体蛋白和多肽一起给予。在一个实施方案中，将所述蛋白与抗血管生成剂一起给予。本文所用的“抗血管生成剂”意指阻断或在某种程度上干扰血管发育的化合物。抗血管生成因子可以是例如小分子或蛋白，例如抗体、Fe融合物或细胞因子，其与参与促进血管生成的生长因子或生长因子受体结合。本文优选的抗血管生成因子是与血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体。在一个备选实施方案中，将所述抗体或Fe融合物与诱导或增强适应性免疫应答的治疗剂一起给予，所述治疗剂例如靶定CTLA-4的抗体。在一个备选实施方案中，将所述抗体或Fe融合物与酪氨酸激酶抑制剂一起给予。本文所用的“酪氨酸激酶抑制剂”意指在某种程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。这样的抑制剂的实例包括但不限于喹唑啉，例如roi53035、4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶；嘧啶并嘧啶；吡咯并嘧啶，例如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706 ;吡唑并嘧啶、4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶；姜黄素(二阿魏酰甲烷、4，5-双(4-氟苯胺基)邻苯二甲酰亚胺)；含有硝基噻吩部分的酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostine) ；PD-0183805 (Warner-Lambert);反义分子(例如与 ErbB 编码核酸结合的那些)；喹喔啉(美国专利号5，804，396) ；tryphostins (美国专利号5，804，396) ；ZD6474(Astra Zeneca) ;PTK_787 (Novartis/Schering A G);泛-ErbB 抑制剂，例如 Cl-1033(Pfizer) ；Affinitac (ISIS 3521 ；Isis/Lilly);甲横酸伊马替尼(ST1571, Gleevec )；Novartis) ；PKI 166 (Novartis) ；GW2016 (Glaxo SmithKline) ;C1_1033 (Pfizer)；EKB-569 (Wyeth) ；Semaxinib (Sugen) ；ZD6474 (AstraZeneca) ;PTK_787 (Novartis/Schering AG) ;INC_1_C11 (Imclone);或如任何以下专利公布中所描述的抑制剂美国专利号 5，804，396 ;PCT WO 99/09016 (American Cyanimid) ；PCT WO 98/43960 (AmericanCyanamid) ；PCT WO 97/38983 (Warner-Lambert) ；PCT WO 99/06378 (Warner-Lambert)；PCT WO 99/06396 (Warner-Lambert) ；PCT WO 96/30347 (Pfizer, Inc) ；PCT WO 96/33978(AstraZeneca) ；PCT W096/3397 (AstraZeneca) ；PCT WO 96/33980 (AstraZeneca),吉非替尼(IRESSA , ZD1839, AstraZeneca),和 0SI-774 (Tarceva , OSI Pharmaceuticals/Genentech)。各种各样的接头可用于本发明，以产生多肽(参见以上定义)或抗体缀合物或多肽缀合物(参见以下定义)。本文的“接头”、“接头序列”、“间隔基”、“束缚序列(tetheringsequence) ”或其语法等同物意指连接两个分子并且通常用于使这两个分子处于优选构型的分子或分子组(例如单体或聚合物)。多种策略可用于将分子共价连接 在一起。这些包括但不限于蛋白或蛋白结构域的N-端和C-端之间的多肽键合，通过二硫键的键合，和通过化学交联试剂的键合。该实施方案的一方面，接头是肽键，其通过重组技术或肽合成而产生。就连接两条多肽链的具体情况而言，选择合适接头取决于多个参数，包括但不限于这两条多肽链的特性(例如它们是否自然地寡聚化)，待连接的N-端与C-端之间的距离(如果知道的话)，和/或接头对于蛋白水解和氧化作用的稳定性。此外，接头可含有提供柔性的氨基酸残基。因此，所述接头肽可主要包括以下氨基酸残基Gly、Ser, Ala或Thr0接头肽应具有足以以这样的方式连接两个分子的长度，所述方式使得它们采用相对于彼此的正确构象，使它们保留所需活性。为了该目的的合适长度包括至少I个和不超过30个氨基酸残基。优选地，接头长度为大约1-30个氨基酸，优选接头长度为1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20个氨基酸。另外，经选择用于包含在接头肽中的氨基酸残基应当具有不显著干扰多肽活性的特性。因此，所述接头肽大体上不应具会与多肽活性不一致的电荷，或干扰内部折叠，或与一个或多个单体中的氨基酸残基形成键或其它相互作用，其将严重阻碍受体单体结构域的结合。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n, (GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少为I的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性接头例如用于摇动性钾通道(shaker potassium channel)的束缚物(tether),和多种其它柔性接头，正如本领域人员将会知道的那样。优选甘氨酸-丝氨酸聚合物，因为这两种氨基酸的结构相对松散，因此可能能够作为各组分之间的中性束缚物。第二，丝氨酸是亲水性的，因此能够使可为球状甘氨酸链的物质溶解。第三，已经显示类似链有效连接重组蛋白例如单链抗体的亚基。合适接头也可通过筛选天然存在的基序的已知三维结构数据库而鉴定，所述基序可跨越两条多肽链之间的空隙。在一个优选的实施方案中，所述接头当给予人类患者时不具免疫原性。因此可选择接头，使它们具有低免疫原性或被认为具有低免疫原性。例如，可选择在人体内天然存在的接头。在一个优选的实施方案中，所述接头具有抗体铰链区序列，即连接抗体Fab区和Fe区的序列；或者所述接头具有包含部分铰链区的序列，或基本上类似于抗体铰链区的序列。获取合适接头的另一方式是通过随机诱变而优化简单接头，例如(Gly4Ser)n。或者，一旦限定合适的多肽接头，可产生额外的接头多肽，以选择与所连接的结构域更优化地相互作用的氨基酸。可用于本发明的其它接头类型包括人工多肽接头和内含肽。在另一个实施方案中，设计二硫键以连接两个分子。在另一个实施方案中，接头是化学交联剂。例如，可使用各种各样的双功能蛋白偶联剂，包括但不限于N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-I-羧酸酯、亚氨基硫代环戊烷(iminothiolane，IT)、双功能的亚氨酸酯衍生物(例如己二亚氨酸二甲酯HCL)、活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛类(例如戊二醛)、双-叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、双-重氮锡衍生物(例如双_(对重氮铺苯甲酰基)_乙二胺)、二异氰酸酯(例如2，6-二异氰酸甲苯(tolyene 2, 6-diisocyanate))和双活性氟化合物(例如1，5_ 二氟-2，4_ 二硝基苯)。例如，可如下列文献中所述地制备蓖麻毒蛋白免疫毒素Vitetta等，1971，Science238:1098。化学接头可使同位素的螯合成为可能。例如，碳-14-标记的I-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸(radionucleotide)与抗体缀合的示例性螯合剂(参见PCT WO 94/11026)。所述接头可为可裂解的，促进在细胞中释放细胞毒性药物。例如，可使用酸不稳定性接头、肽酶敏感性接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等，1992, Cancer Research 52: 127-131)。或者,各种各样的非蛋白聚合物(包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物)，可用作接头，即可用于将本文所述的Fe变体与融合配偶体连接以产生Fe融合物，或 将本文所述的抗体与多肽与缀合物连接。在一个实施方案中，将本文所述的抗体或多肽与在本文中称为缀合物的另一治疗性化合物缀合或可操作地连接。缀合物可以是细胞毒性剂、化疗药、细胞因子、抗血管生成齐U、酪氨酸激酶抑制剂、毒素、放射性同位素或其它治疗活性药剂。化疗药、细胞因子、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂和其它治疗剂在以上已经描述，所有这些上述治疗剂都可用作抗体或Fe融合物缀合物。在一个备选实施方案中，将抗体或Fe融合物与毒素缀合或可操作地连接，所述毒素包括但不限于细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素和酶活性毒素，包括其片段和/或变体。小分子毒素包括但不限于刺孢霉素、美登素(美国专利号5，208，020)、廿化110访6116和01065。在本发明的一个实施方案中，将抗体或多肽与一个或多个美登素分子缀合(例如每个抗体分子大约I至大约10个美登素分子)。美登素可转化为例如May-SS-Me，其可还原为May_SH3并与经修饰的抗体或Fe融合物反应(Chari等，1992，Cancer Research 52: 127-131)，从而产生美登木素生物碱-抗体或美登木素生物碱-Fe融合物缀合物。另一目标缀合物包括与一个或多个刺孢霉素分子缀合的抗体或Fe融合物。抗生素的刺孢霉素家族能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。多拉司他汀10类似物例如澳瑞他汀E (auristatinE, AE)和一甲基澳瑞他汀E (MMAE)可用作缀合物，用于本文所述的 Fe 变体(Doronina 等，2003，Nat Biotechnol 21 (7) : 778-84 ;Francisco 等，2003 Blood 102(4) :1458-65)。有用的酶活性毒素包括但不限于白喉A链(白喉毒素的非结合活性片段)，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白II A链、a-sarcin、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、垂序商陆iphytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制齐U、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酹霉素、依诺霉素和单端孢霉菌烯醇(tricothecenes)。参见例如PCT WO 93/21232。本发明还涵盖本文所述的抗体或Fe融合物与具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶例如脱氧核糖核酸酶(DNA酶)之间形成的缀合物或融合物。
在一个备选实施方案中，将本文所述的Fe变体蛋白与放射性同位素缀合或可操作地连接以形成放射性缀合物。各种各样的放射性同位素可用于产生放射性缀合物抗体和Fe 融合物。实例包括但不限于 At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 和 Lu 的放射性同位素。在再一个实施方案中，将本文所述的Fe变体与“受体”(例如链霉抗生物素)缀合，用于肿瘤的预靶向，其中将所述抗体-受体或Fe融合物-受体缀合物给予患者，然后用清除剂从循环中除去未结合缀合物，再给予“配体”(例如抗生物素蛋白)，其与细胞毒性剂(例如放射性核苷酸)缀合。在一个备选实施方案中，将抗体或Fe融合物与酶缀合或可操作地连接，以使用抗体依赖性酶介导的前药治疗(ADEPT)。可通过将所述抗体或Fe融合物与将前药(例如肽基化疗药，参见PCT WO 81/01145)转化为活性抗癌药的前药激活酶缀合或可操作地连接，而使用ADEPT。参见例如PCT WO 88/07378和美国专利号4，975，278。用于ADEPT的免疫缀合物的酶组分包括能够以使得将其转化为其更具活性的细胞毒性形式的方 式作用于前药的任何酶。可用于本发明方法的酶包括但不限于用于将含磷酸酯的前药转化为游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸酯的前药转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将含肽的前药转化为游离药物的蛋白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L);用于转化含有D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰羧肽酶；用于将糖基化前药转化为游离药物的碳水化合物裂解酶，例如￠-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将用a -内酰胺衍生的药物转化为游离药物的P -内酰胺酶；和用于将在其胺氮上分别用苯氧乙酰基或苯基乙酰基衍生的药物转化为游离药物的青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，具有酶活性的抗体(在本领域中也称为“抗体酶(abzyme)”)也可用于将本发明的前药转化为游离活性药物(参见例如Massey, 1987，Nature 328: 457-458)。可制备抗体-抗体酶和Fe融合物-抗体酶缀合物，用于将抗体酶递送到肿瘤细胞群体。Fe变体的其它修饰包括将所述蛋白或多肽与各种非蛋白聚合物之一连接，所述非蛋白聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。包括药物组合物，其中配制本文所述的Fe变体蛋白或多肽或Fe融合物以及一种或多种治疗活性剂。通过将具有所需纯度的本文所述抗体或Fe融合物与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences 第 16 版，Osol,A. Ed., 1980)混合，以冻干制剂或水性溶液剂的形式制备用于贮存的所述抗体和Fe融合物的制剂。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苯甲铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于大约10个残基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA ;糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；甜味剂和其它矫味剂；填充剂，例如微晶纤维素、乳糖、玉米淀粉和其它淀粉；结合剂；添加剂；着色剂；形成盐的反荷离子，例如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物);和/或非离子型表面活性剂，例如TWEEN , PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。在一个优选的实施方案中，包含本文所述抗体或Fe融合物的药物组合物呈水溶性形式，例如以药学上可接受的盐的形式存在，所述盐意在包括酸加成盐和碱加成盐。“药学上可接受的酸加成盐”是指这样的盐所述盐保留游离碱的生物有效性且非生物上或其它方面上不希望的，其用无机酸和有机酸形成，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。“药学上可接受的碱加成盐”包括衍生自无机碱的那些，例如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。尤其优选的是铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环胺和碱性离子交换树脂例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺的盐。用于体内给予的制剂优选是无菌的。这容易通过经由无菌滤膜过滤或其它方法完成。在某些实施方案中，将本文所公开的蛋白和多肽配制成免疫脂质体。脂质体是包 含不同类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂的小囊泡，其用于将治疗剂递送到哺乳动物。含有抗体或Fe融合物的脂质体通过本领域已知的方法来制备，所述方法例如描述于Epstein等，1985，Proc Natl Acad Sci USA, 82:3688 ;Hwang 等，1980，Proc Natl Acad SciUSA, 77:4030 ;美国专利号 4，485，045 ;美国专利号 4，544，545 ;和 PCT WO 97/38731。循环时间增加的脂质体公开于美国专利号5，013，556。脂质体的成分通常排列在双层结构中，类似于生物膜的脂质排列。尤其有用的脂质体可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反向蒸发方法产生。脂质体通过限定孔径的滤器挤出，产生具有所需直径的脂质体。化疗药或其它治疗活性剂任选包含在脂质体中(Gabizon 等，1989，J National Cancer Inst 81:1484)。在某些实施方案中，将所述抗体、多肽和其它治疗活性剂包入通过以下方法制备的微胶囊中，所述方法包括但不限于凝聚技术、界面聚合作用(例如使用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊，或聚_(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微型乳剂、纳米粒和纳米胶囊)和巨型乳剂(macroemulsion)。这些技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences 第 16 版，Osol, A.编辑，1980。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形制品形式例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚脂、水凝胶(例如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3，773，919)、L-谷氨酸和、乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物例如LUPRON DEPOT (其为由乳酸-羟基乙酸共聚体和乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成的注射用微球体)、聚-D-(-)_3-轻基丁酸和ProLease )(可市购自Alkermes),其是由掺入到DL-丙交酯-乙交酯共聚物(PLG)基质中的所需生物活性分子组成的基于微球体的递送系统。在实施方案中，本文所述的治疗活性抗体或多肽在制剂中的浓度范围为大约
0.1-100%(重量)。在一个实施方案中，所述抗体或多肽的浓度范围为0.003-1.0摩尔。为了治疗患者，可给予治疗有效剂量的本文所述的抗体或多肽。本文的“治疗有效剂量”意指对其所给予的对象产生作用的剂量。准确剂量将取决于治疗目的，并可由本领域技术人员使用已知技术来确定。剂量范围可为0.01-100 mg/kg体重或更高，例如0. I、I、10或50mg/kg体重，优选1-10 mg/kg。正如本领域所知，可能因以下因素而需要进行调整抗体或多肽的降解、系统递送对比局部递送和新蛋白酶合成率以及年龄、体重、一般健康、性别、饮食、给予时间、药物相互作用和病况的严重程度，并且这可由本领域技术人员用常规实验确定。呈无菌水性溶液剂形式的包含本文所述蛋白或多肽的药物组合物的给予，以多种方式进行，包括但不限于口服、皮下、静脉内、鼻内、耳内、透皮、局部(例如凝胶剂、药膏剂、洗剂、乳膏剂等)、腹膜内、肌内、肺内(例如可市购自Aradigm的AERx 吸入技术，或可市购自Inhale Therapeutics的Inhance 肺部递送系统)、阴道、胃肠外、直肠或眼内。在某些 情况下，例如对于伤口、炎症等的治疗，可作为溶液剂或喷雾剂直接施用所述抗体或多肽。正如本领域所知，可根据引入的方式相应地配制药物组合物。根据本文的教导，可用具有改进的或降低的ADCC活性的变体Fe区的制备多肽。这样的分子可用于治疗不同病症。在某些实施方案中，具有改进的ADCC活性的多肽变体用于治疗其中需要破坏或消除组织或外源微生物的疾病或病症。例如，所述多肽可用于治疗癌症；炎性病症；感染(例如细菌性、病毒性、真菌性或酵母性感染)；和其中需要除去组织的其它病况(例如甲状腺肿)等。当多肽变体具有降低的ADCC活性时，这样的变体用于治疗疾病或病症，其中需要具有长半衰期的含Fe区的多肽，但所述多肽优选没有不想要的效应子功能。例如，在一个实施方案中，所述含Fe区的多肽是抗组织因子(TF)抗体；抗IgE抗体；和抗整联蛋白抗体(例如抗a a 4 P 7抗体)。所述含Fe区的多肽的所需作用机制可以是阻断配体_受体结合对。此外，具有降低的ADCC活性的含Fe-区的多肽可以是激动剂抗体。一方面提供产生Fe蛋白的方法，所述蛋白随后经实验筛选而选出优化的Fe蛋白。抗体分子生物学、表达、纯化和筛选的通用方法描述于Harlow & Lane的Antibodies: ALaboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988。本文所述的一个实施方案涉及合理设计方法，以鉴定对Fe受体具有改善的选择性和结合亲和力的Fe蛋白。一方面，本发明包括对与驱动Fe与其受体之间的相互作用的动力学特性相关的结构特征的理解。本文所述的另一个实施方案提供根据与蛋白分子动力学特性相关的它们对Fe y RIIa, Fe y RIIb和Fe yRIIIa的结合亲和力、静电学、溶剂化、堆积、堆积密度、氢键合网络和熵效应，鉴定Fe蛋白多肽的方法。本发明的方法还提供通过例如定点诱变和/或从头合成而构建在计算机芯片上鉴定的突变体，和在哺乳动物细胞中表达用于体外证实。在本文所述的一个实施方案中，在计算机芯片上鉴定的Fe蛋白多肽经反向改造，产生编码成员序列的核酸，其然后可根据需要克隆到宿主细胞中，表达并测定。使用众所周知的方法进行这些实践。例如,可用于本发明的各种方法描述于Molecular Cloning-ALaboratory Manual,第3版.(Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork, 2001)。使用各种方法以及选择技术来筛选Fe蛋白，所述方法包括但不限于使用体外测定、体内和基于细胞测定的那些。自动化技术和高通量筛选技术可用于筛选程序。筛选可使用融合配偶体或标记。设计策略
进行了一种合理设计方法，以设计具有多个氨基酸取代的Fe蛋白，所述氨基酸取代协同地提供针对靶Fe受体的增强的选择性和结合亲和力。该方法的关键在于理解结构特征和驱动Fe与其受体间的相互作用的相关动力学特性。从Fe与Fe Y RIIIb之间已知的共复合(co-complex)结构开始,针对所述的受体构建了同源性模型FcyRlIa、Fe y RlIb和FcyRIIIa。采用在计算机芯片上基于结构和动力学的技术的专有套组(包括但不限于 ZymeCAD 和 ResidueNetworks (描述于 WO 2009/098596、US20070276791 和 US20080147360))，鉴定了关于这些蛋白-蛋白相互作用的结构-功能关 系的独特见识并导致提出独特的突变组合，其经预测优先结合不同Fe受体，并且在某些实例中，具有改进的结合强度。评价Fe蛋白的首要定量度量是结合能。然而，与蛋白分子动力学特性相关的多种其它参数例如在静电学、溶剂化、堆积和堆积密度、氢键合网络和熵效应方面的变化，亦用于选择有吸引力的Fe蛋白。WO 2009/098596提供根据对分子可用的构象空间的取样而测定生物聚合物特征和生物聚合物的结构单元(残基)间的关系的方法和系统。这些结构单元间的关系进一步用于寻找所述蛋白中的偶联残基网络。在一个实施方案中，在体外测定中筛选Fe蛋白的功能和/或生物物理特性。测定可使用各种检测方法，包括但不限于发色标记、荧光标记、发光标记或同位素标记。检测ADCC的测定包括但不限于ADCC报告物测定、细胞毒性测定、铬释放测定、铕释放测定、硫释放测定和流式细胞术。众所周知的测定的实例在本领域中可找到，例如可参见Stavenhagen等(2007) “Fe Optimization of Therapeutic Antibodies Enhances TheirAbility to Kill Tumor Cells In vitro and Controls Tumor Expansion In vivo vialow-affinity Activating Fe Y Receptors (治疗用抗体的Fe优化通过低亲和力激活Fe Y受体增强其在体外杀伤肿瘤细胞的能力并在体内控制肿瘤扩繁)，” Cancer Res.67:882和 Stavenhagen等(2008) “Enhancing the potency of therapeutic monoclonalantibodies via Fe optimization (通过Fe优化增强治疗用单克隆抗体的效力)，” Adv.Enzyme Regul. 48:152。包含本文所述的Fe蛋白的抗体和多肽的生物性能可在细胞、组织和完整生物体的实验中表征。经常在动物(包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪和猴)中测试药物，以测定药物治疗疾病或疾病模型的功效，或测定药物的药物动力学、毒性和其它性能。经常在小鼠中测试治疗药，所述小鼠包括但不限于裸小鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲入和敲出小鼠)。通过参考以下实施例将会更完全地理解本发明。然而，它们不得视为限制本发明的范围。本文所提及的所有文献和专利引用都通过引用明确结合。实施例I:具有针对产生所选Fe Y R结合特征而选择的突变组合的多肽的合适设计的阐明
靶定HER2/neu受体的抗体
人表皮生长因子受体(HER)是埋置在细胞膜中的蛋白质并传递来自胞外的分子信号到胞内，并开启和关闭基因。!ER蛋白调节细胞生长、存活、粘附、迁移和分化，这些功能在癌细胞中被扩增或弱化。“人表皮生长因子受体2”是表皮生长因子受体家族成员，是在乳癌中产生更高侵袭性的蛋白。HER2/neu也被称为CD340。大约15-20%乳癌具有HER2/neu基因扩增或其蛋白产物的过量表达。该受体在乳癌中的过量表达与疾病复发的增加和更差的预后相关。因为它的预测作用以及它预测对曲妥珠单抗的反应的能力，所以常规地检查乳腺肿瘤ffiR2/neu的过量表达。过量表达也在其它癌症中发生，例如卵巢癌、胃癌以及子宫癌的生物侵袭性形式，例如子宫浆液性子宫内膜癌。曲妥珠单抗是与HER2/neu受体胞外区段的结构域IV结合的人源化单克隆抗体。经曲妥珠单抗治疗的细胞停止在细胞周期的Gl期，所以减少增殖。已经提出曲妥珠单抗通过下调HER2/neu导致破坏受体二聚化和通过下游PI3K级联的信号转导，而诱导其某些效应。然后P27Kipl不磷酸化并能够进入核，抑制cdk2活性，引起细胞周期停止。另外，曲妥珠单抗通过诱导抗血管生成因子和抑制促血管生成因子两者而抑制血管生成。据认为在癌症中观察到的未受调节的生长的原因可归结于ffiR2/neu的蛋白水解裂解，其导致释放胞外结构域。已经显示曲妥珠单抗在乳癌细胞中抑制HER2/neu的胞外结构域裂解。 包含产生所选Fe YR结合特征的修饰组合的多肽的设计:
根据所选氨基酸取代对蛋白相互作用和动力学的影响(其分别表明焓和熵的改变)，设计本文所公开的某些蛋白和多肽。可优化蛋白结合特征的相对变化，尤其是与野生型系统相比的相对变化。在本实施例中，设计多肽，目标是选择以下氨基酸突变，其与野生型抗体(曲妥珠单抗/赫赛汀 )相比增加对FcYRIIIa受体的结合选择性。所进行的合理设计产生四重变体(S239E/S298A/K326A/A327H)。在以下实施例中，强调了引入Fe Y RIIIa特异性静电相互作用以及添加对Fe y RIIa和Fe y RIIb受体两者的空间排斥的主要策略，使得选择性设计目标得以实现。在某些情况下，在Fe的一条链上突变对结合的作用不同于另一条链，并且这些链特异性作用也已证明。讨论了作为四重突变的每一个的结果的对结合的具体作用，其中Fe变体的结合特征是结构和动力学变化的总体协同组合。作为空间诜择件驱动物的A327H-
His327与野生型丙氨酸相比是大得多的基团并且该取代是主要选择性驱动物，其对Fe yRIIIa受体影响最小，而对Fe y RIIa和Fe y RIIb有害。如图I所示，与野生型Fe相比，随着His327的添加，与Fe Y RIIIa的结合界面和蛋白_蛋白相互作用被保留，这表明这两个配偶体之间的结合将不会受到影响。界面稳定的主要因素是因为在Fe Y RIIIa中存在来自Tyrl32的侧链羟基。这个非保守部分在Fe y RIIa中不存在，因此添加His327导致结合界面的严重不稳定性，最显著的是对受体的邻近Hisl34残基观察到的快速动力学(图I)。预期与IIa受体的结合将被严重破坏。Fe Y RIIIa和Fe Y RIIa共享保守Hisl34残基(其受到向Fe添加His327的差异影响)，而Fe Y RIIb含有甚至更大的Argl34。尽管该残基也受到Hisl34突变的扰动，然而，它能采取假有利的构象(pseudo-favorable conformation),其因Fe上的丝氨酸侧链而稳定(图I)。预期Fe与IIb受体的结合因为稳定的Arg旋转异构体(rotomer)所致将减少，但不会消除。作为静电通用稳定剂和诜择件驱动物的S239E:突变S239E显示出与受体的Fe链特异性相互作用，因此促进它作为通用稳定突变以及作为Fe YRIIIa受体的选择性驱动物的双重作用。在Fe B链上的Glu239 (图I)是跨越所有3个受体的通用稳定残基，因为它能与保守Lysl20残基形成氢键。通用稳定残基在蛋白变体设计中是有益的，因为它们确保在限定区域内引入大量突变时结合界面的完整性得以维持。S239E突变当引入Fe A链时(图2)，对于改进Fe Y RIIIa结合而言是选择性驱动物，因为它能与非保守Lysl61形成分叉静电相互作用，而在Fe y RIIa受体和Fe y RIIb受体中用Thrl61却不可能有增强的结合相互作用。既作为空间诜择件驱动物又作为静电诜择件驱动物的S298A
野生型抗体Fe中的Ser298残基与Fe Y RIIa受体和Fe Y RIIb受体中的Ser 129通过氢键合相互作用，而受体的Lysl28在分子内稳定并且不参与任何结合相互作用(图3) A298A突变除去了 Fe与受体之间的一个关键的静电结合配偶体，因此有望极大降低与Fe Y RIIa受体和Fe y RIIb受体的结合。野生型Fe采用不同机制与Fe YRIIIa受体结合，其相互作用由Fe上的Ser298的主链羰基与受体的Lysl28介导，Lysl28能部分地占据结合界面。使用分子动力学模拟证明了该相互作用所需的侧链柔性和运动(图3)。当将S298A突变引入Fe时，Fe Y RIIIa的Lysl28被“锁定”和预先定位在结合构象中。突变的协同组合
通过将以上计算见识和结构见识结合到Fe设计方法中，本公开内容提供新变体，相对于野生型Fe而言，所述新变体具有改进的Fe YRIIIa结合，同时对Fe y RIIb的结合下降，而对Fe Y RIIa的结合则基本上消除。如通过体外结合测定所阐明的，所得结合特征示于图4。这些结果也证明这些突变的意料之外的协同特性(图4)。在单一 S239E突变时，显示变体不能清楚区分高度同源受体间的结合。当添加S298A/K326A/A327H突变组合时，改进了 Fe Y RIIIa选择性。实施例2
经设计抗体的体夕卜矛口离体验证
一旦在计算机芯片上设计后，按照以下文献所述方法测试各个抗体Stavenhagen等(2007) Cancer Res. 67:882 和 Stavenhagen 等(2008)，Adv. Enzyme Regal. , 48:152。简而言之，通过标准化学合成，使用例如曲妥珠单抗IgGl作为野生型构架，构建各突变体的基因。在克隆到合适载体之后，突变的Fe多肽在哺乳动物HEK293细胞中表达。Fe y RIIa, Fe y RIIb和Fe y RIIIa也在HEK293细胞中克隆和表达。然后通过表面等离子体共振测定抗体对这3种受体的每一种的结合亲和力。表面等离子体共振分析:通过SPR (表面等离子体共振)，使用ProteOn XPR36系统(来自BI0-RAD)测定Fe y受体对抗体Fe的亲和力。通过胺偶联将含HER-2的缓冲液(10 mM Hepes pH 6. 8)固定在CM5芯片，直到3000 RU。将含抗HER2 F(ab)2的抗体形式的Fe变体固定在HER-2表面，直到300 RU。运行缓冲液和表面活性剂维持在pH 6.8。将纯化的分析物FcR在其运行缓冲液中稀释并以20-30 mul/min的流速注射2分钟，然后再解离4分钟。一式三份分析开始于20 nM的每种抗体的5次两倍稀释液。将传感图总体拟合到1:1 Langmuir结合模型。所有实验都在室温下进行。经SPR测定的每种变体的体外结合Kd不于表I。抗体依赖性细胞毒性分析:在这些实验中SKBR-3细胞用作靶细胞。将冷冻保存的SKBR3细胞的新鲜小瓶融化并建立稳健培养物。将SKBR3细胞维持在富含10%胎牛血清和1% PenStrep的McKoy氏培养基中。在达到 75%汇合时(大约每3-4天)将细胞有规律地传代。为了证实变体抗体与靶细胞(SKBR3)的结合，获取所有变体和阳性对照(赫赛汀)的结合曲线。SKBR-3细胞用PBS洗涤并重悬于FACS (荧光激活细胞分选)管中，浓度为每管100 u I体积PBS/1%BSA中含2xl05个细胞。将抗体加入管内，达到0. I、I和10U g/ml终浓度，将细胞在冰上孵育I小时，用1% BSA/PBS洗涤并重悬于FITC-缀合的抗人IgG的1:200稀释液中。将细胞在冰上再孵育40 min，再次洗涤并重悬于200 u I PBS0将10 Ul 10 mg/ml碘化丙啶加入各管，然后通过FACS分析样品。设置FACS门控以排除死细胞(PI+)。测定各样品的平均荧光强度(“MFI”)。用第二抗体而非第一抗体染色的细胞用作阴性对照。如根据平均荧光强度(“MFI”)的倍数差异所测量的，所有变体都显示出与赫赛汀可比的结合水平。·
为了确定效应器靶细胞(E:T)之比和达到合适细胞杀伤的孵育持续时间，使用赫赛汀作为阳性对照进行了初步的ADCC实验。在实验前一天，将SKBR-3细胞接种到平底96孔板，浓度为每孔200 u I培养基中含2xl04个细胞。使用Ficoll梯度离心将PBMC从5个不同供体的新鲜的血沉棕黄层中纯化出，用PBS洗涤3次并重悬于含10%热灭活FBS和10 ng/ml IL-2的RPMI中。24小时之后，含SKBR-3细胞的3个孔经胰酶水解，以核实细胞计数并测定达到想要的E:T之比所需的PBMC的准确数量。在临测定之前，靶细胞用10U g/ml CFSE标记。将抗体(赫赛汀)以I和10 u g/ml加入到细胞中，并孵育15 min。然后，将10:1、50:1和100:1效应器:靶(E:T)之比的PBMC加入到相应孔中，并将各板以低RPM快速离心以将细胞浓缩在孔底部。然后将各板在标准组织培养箱中孵育4、8和24小时。处理之后，收获细胞并加入到含生存力染剂碘化丙啶(“PI”)的400 u I PBS中，然后立即通过FACS分析。通过将PI+绿色细胞(杀死的靶)的频率测定为总靶细胞(PI_和PI+绿色细胞)的分数来确定ADCC活性程度。试验性ADCC实验证明赫赛汀在SKBR3细胞中具有明显的ADCC活性。在24小时，更高E:T之比(50:1和100:1)似乎导致某些抗体非依赖性细胞死亡。因为在抗体浓度为I和10 u g/ml时的细胞杀伤无法辨别，所以ADCC活性似乎在I U g/ml以上饱和。用10:1的E:T之比在24小时观察到最佳结果。对于后续ADCC实验，使用Ficoll梯度离心从5个血沉棕黄层中纯化PBMC。离心和洗涤之后，将细胞重悬于100 ml预热的RPMI中。进行细胞计数，并通过锥虫蓝排除法测定生存力。将每个供体的细胞等分试样冷冻保存用于以后使用。细胞的另外等分试样用于针对158V/F CD16多态性的基于FACS的基因分型，其使用双抗体染色方案并与使用对V等位基因的亲和力低于对F等位基因的亲和力的MEM-154抗CD16抗体的染色进行比较来进行，所述方案利用以下事实G38抗CD16抗体以相同的亲和力与V和F这两个等位基因结合(S. Bottcher 等，2005，Journal of Immunological Methods,第 306 卷，第 1-2 期，第128-136页)。根据CD16基因分型结果，选择在F/V方面杂合、高细胞生存力和无内源性细胞杀伤的来自3个供体的样品。在一式三份的孔中获取所有数据点，将各供体的生存力针对与同一供体的PBMC孵育、但没有试验抗体的SKBR-3细胞的生存力进行标准化。这些样品的平均ADCC结果概述于表I。如表I所示，离体ADCC测定表明经设计的变体比野生型抗体具有显著更低的ADCC。这表明本文所述的变异可用于调节ADCC。表I :不同的经设计抗体的SPR和ADCC测定结果。
权利要求
1.一种包含变体Fe区的多肽，其中所述变体Fe区与野生型Fe区相比包含3个或更多个氨基酸修饰，并且相对于包含野生型Fe区或者仅具有所述3个或更多个氨基酸修饰中的I个的变体Fe区的多肽而言具有改变的效应；其中所述3个或更多个修饰中的至少2个与所述至少2个位置的单一位置修饰相比提供协同效应，因此表现出对Fe y受体的经选择的结合特征。
2.权利要求I的多肽，其中所述氨基酸修饰产生氨基酸相互作用和动力学，其导致与缺乏所述至少3个或更多个氨基酸修饰的多肽相比对第一 Fe y受体的结合亲和力和/或特异性增加，而对第二 Fe y受体的结合亲和力和/或特异性降低。
3.权利要求2的多肽，其中第一Fe Y受体是Fe Y RIIIa受体，第二 Fe Y受体是Fe Y RIIa 或 Fe Y RIIbo
4.权利要求I的多肽，其中所述氨基酸修饰产生有利的Fey RIIIa-特异性相互作用和/或与Fe y RIIa受体和/或Fe Y RIIb受体不利的相互作用。
5.权利要求I的多肽，其中所述氨基酸修饰对FeY RIIIa受体具有最小影响，而对所述多肽与Fe Y RIIa和/或Fe Y RIIb的结合产生有害效应。
6.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含修饰S239E/D265S/I332E。
7.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含修饰H268D/E269L/S298A/K326A/A327H。
8.权利要求2的多肽，其中第一Fe Y受体是Fe YRIIa受体，第二 Fe Y受体是Fe Y RIIIa 或 Fe Y RIIb。
9.权利要求I的多肽，其中所述氨基酸修饰产生有利的Fey RIIa-特异性相互作用和/或与Fe YRIIIa受体和/或Fe Y RIIb受体不利的相互作用。
10.权利要求I的多肽，其中所述氨基酸修饰对FeYRIIa受体具有最小影响，而对所述多肽与Fe Y RIIIa和/或Fe Y RIIb的结合产生有害效应。
11.权利要求2的多肽，其中第一Fe Y受体是Fe YRIIb受体，第二 Fe Y受体是Fe y RIIIa 受体或 Fe y RIIa 受体。
12.权利要求I的多肽，其中所述氨基酸修饰产生有利的Fey RIIb-特异性相互作用和/或与Fe Y RIIIa受体和/或Fe Y RIIa受体不利的相互作用。
13.权利要求I的多肽，其中所述氨基酸修饰对FeYRIIb受体具有最小影响，而对所述多肽与Fe Y RIIIa和/或Fe Y RIIa的结合产生有害效应。
14.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含修饰D265E/S267D/A330S。
15.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含修饰G237F/A327L/A330I。
16.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含修饰G237F/S239E/H268D。
17.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含修饰S239E/S267E/H268D。
18.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含修饰S239E/S298A/K326A/A327H。
19.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含修饰G237F/S298A/A330L/I332E。
20.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含修饰G237F/S239E/A327H。
21.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含修饰L235A/S239E/D265E/A327H。
22.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含修饰G237F/S239E/D270N。
23.权利要求I的多肽，其中包含野生型Fe区的多肽与Fey受体的结合可通过体外测定而检测。
24.权利要求I的多肽，其中所述3个或更多个修饰包含突变S239E，其中所述多肽与缺乏S239E突变的多肽相比在与Fe YRIIIa受体的结合方面具有更高选择性。
25.权利要求I的多肽，其中所述3个或更多个修饰包含突变S298A，其中所述多肽与缺乏S298A突变的多肽相比对Fe y RIIa受体和Fe y RIIb受体具有降低的结合亲和力。
26.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含氨基酸修饰S298A/K326A/A327H，其中所述多肽与缺乏S298A/K326A/A327H修饰的多肽相比对Fe y RIIIa受体具有改进的结合选择性。
27.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含氨基酸修饰S239E/S298A/K326A/A327H，其中所述多肽与缺乏S239E/S298A/K326A/A327H修饰的多肽相比对Fe y RIIIa受体具有改进的结合选择性。
28.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含氨基酸修饰G236A/S239D/D270L/I332E，其中所述多肽与缺乏G236A/S239D/D270L/I332E修饰的多肽相比对Fe Y RIIIa受体具有改进的结合选择性。
29.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含3个氨基酸修饰，所述突变选自D270L/Y300L/A330K、G237F/S267G/N325F、G237F/V266L/S267D、L234F/S267G/N325L 和 L234F/S267E/N325L。
30.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含至少3个氨基酸修饰，所述修饰选自G237F/S239E/A327H、G237F/A327L/A330I、S239E/A327L/A330I、S239E/S267E/H268D、G237F/S239E/D270N、G236E/G237F/S239E、S239E/D265S/I332E、G237F/S239E/D265E、G237F/S239E/H268D、H268E/D270E/S267G、H268D/K326A/A327H、D265E/S267D/A330S、L235A/S239E/D265E、A327H/E269L/K236A、G237F/D270Q/S239E、A330V/I332L/K326 和 G236S/A327H/A330I。
31.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含至少4个氨基酸的同时修饰，所述修饰选自 L235A/S239E/D265E/A327H、S239E/D265S/H268D/I332E、S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E 和 G236E/D270N/A327V/I332E 和G236A/S239D/D270L/I332E。
32.权利要求I的多肽，其中所述多肽包含氨基酸修饰H268D/E269L/S298A/K326A/A327H。
33.权利要求1-32中任一项的多肽，其中所述多肽包含抗体曲妥珠单抗或其抗原结合部分。
34.权利要求I的多肽，其中一个或多个氨基酸修饰位于按照EU索引的位置234-330之间。
35.权利要求I的多肽，其中至少3个氨基酸修饰选自L234Q、L234N、L235A、G236E、E236L、E236D、G237F、G237N、S239E、S239D、D265E、D265S、S267E、S267D、S267G、H268D、H268E、E269L、E269L、D270N、D270I、D270E、S298A、K326A、K326D、A327H、A327V、A327L、A327T、A330V、A330L、A330W、A330I、A330S、I332L、I332D 和 I332E。
36.权利要求I的多肽，其中所述变体Fe区包含氨基酸修饰组合，其中所述组合选自L235A/S239E/D265E ；L235A/G237F/D265E ；S239E/E269D/A327H ；S239E/G237N/A327H ；S239E/G237F/A327V ；G237F/D270I/S239E ；G237F/A327L/S239E ；A327H/E269L/K326A ；A330V/I332L/S239E ；A327T/E269L/K326A ；D270N/A327T/K326A ；A330V/I332L/S239E ；A330W/I332D/S239E ；G236E/D265E/A327H/A330I ；D270N/S298A/A327V ；G236E/D265E/D270N/A327H/A330I ；G236E/D270N/A327H/A330I ；G236E/D270N/A327V/I332E ；G236E/D270N/A327V/G237F ；L234N/S239E/A330I/I332E ；L234Q/S239E/A330I/I332E；L234Q/S239E/A330I/I332E/S298A ；G237F/S239D/D265E/D270N/S298A；G237F/S239E/D270N/A330L/I332E ；G237F/S239E/D270N/A330L/I332E/S298A ；S239E/G237F/A327H ；G237F/A327L/A330I ；S239E/A330I/A327L ；D265E/S239E/L235A/A327H ；S267E/S239E/H268D ；G237F/D270N/S239E ；S239E/G237F/G236E ；I332E/D265S/S239E/H268D ；I332E/D265S/S239E ；D265E/S239E/G237F ；S239E/H268D/G237F ；S298A/D265S/S239D/I332E ；S298A/K326A/A327H/S239E ；S298A/G2 37F/A3330L/I332E ；H268E/D270E/S267G ；H268D/K326A/A327H ；H268D/K326A/A327H/E269L/S298A ;和 A330S/D265E/S267D。
37.权利要求I的多肽，其中所述变体Fe区包含氨基酸修饰组合，其中所述组合选自S239E/S267E/H268D ；S237F/S239E/D265E 和 H268E/D270/E/S267G。
38.权利要求I的多肽，其中所述变体Fe区包含氨基酸修饰H268D，而不包含修饰S267E。
39.权利要求I的多肽，其中所述亲本多肽的Fe区是人IgGFe区。
40.权利要求39的多肽，其中所述人IgGFe区是人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的Fe区。
41.权利要求I的多肽，其中所述多肽是抗体。
42.权利要求41的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、人源化抗体或人抗体。
43.—种核酸,其包含编码权利要求I的多肽的核苷酸序列。
44.一种载体，其包含权利要求43的核酸。
45.一种制备权利要求I的多肽的方法，所述方法包括(i)在适合所述多肽表达的条件下，在培养基中培养包含编码所述多肽的核酸的宿主细胞；和(ii)从所述培养基中回收所述多肽。
46.一种与癌靶抗原特异性结合的治疗用抗体，所述治疗用抗体包含权利要求I的变体Fe区。
47.权利要求46的治疗用抗体，其中所述治疗用抗体选自阿巴伏单抗、阿达木单抗、阿伦珠单抗、aurograb、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐珠单抗、briakinumab、卡那单抗、卡妥索单抗、培舍珠单抗、西妥昔单抗、达克珠单抗、地舒单抗、依法珠单抗、力口利昔单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、戈利木单抗、替伊莫单抗、英利昔单抗、伊匹木单抗、鲁昔单抗、美泊利单抗、莫他珠单抗、莫罗单抗、mycograb、那他珠单抗、尼妥珠单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、培妥珠单抗、雷珠单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗、替利珠单抗、托珠单抗/atlizumab、托西莫单抗、曲妥珠单抗、ProxiniumTM、RencarexTM、优特克单抗、扎芦木单抗和任何其它抗体。
48.权利要求46的治疗用抗体，其中所述靶抗原选自IL-2R的a-链(CD25)、淀粉状蛋白 3、抗 EpCAM X 抗 CD3、BLyS (或 BAFF)、CDl I a、CD20、CD22、CD23、CD3、CD4、CD52、CD80、CTLA-4、EGFR、EpCAM, RSV 的 F 蛋白、G250、糖蛋白 Ilb/IIIa R、HER2、HER2/neu R、Hsp90、IgE 抗体、IL-12/IL-23、IL_lb、IL-5、IL-6 受体、整联蛋白 a-4/3-I、粘蛋白 16/CA-125、RANKL, TNF a、VEGF-A和其它治疗有利的靶标。
49.一种在患有以癌抗原为特征的癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的权利要求46的治疗用抗体。
50.权利要求49的方法，其中所述患者是人。
51.—种在患有以免疫抗原为特征的免疫性疾病的患者中治疗免疫性疾病的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的权利要求46的治疗用抗体。
52.一种药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的权利要求I的多肽和药学上可接受的载体。
53.权利要求I的多肽，其中所述包含变体Fe区的多肽在介导ADCC方面比野生型更有效。
54.权利要求53的多肽，其中所述包含变体Fe区的多肽在介导ADCC方面的有效性是野生型的大约I. 5至大约100倍。
55.权利要求53的多肽，其中所述包含变体Fe区的多肽在介导ADCC方面的有效性是野生型的大约2至大约50倍。
56.权利要求I的多肽，其中所述包含变体Fe区的多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面比野生型更有效。
57.权利要求56的多肽，其中所述包含变体Fe区的多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面的有效性是野生型的大约2倍。
58.权利要求56的多肽，其中所述包含变体Fe区的多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面的有效性是野生型的大约10倍。
59.权利要求56的多肽，其中所述包含变体Fe区的多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面的有效性是野生型的大约50倍。
60.权利要求56的多肽，其中所述包含变体Fe区的多肽在介导对炎性免疫应答的抑制方面的有效性是野生型的大约100倍。
61.一种基于对Fe y RIIa、Fc Y RIIb和/或Fe Y RIIIa的计算的结合亲和力在计算机芯片上鉴定Fe变体多肽的方法。
62.权利要求61的方法，所述方法还包括在计算机芯片上计算所述Fe变体多肽的静电学、溶剂化、堆积、堆积密度、氢键合和熵效应。
63.权利要求61的方法，所述方法还包括构建所述Fe变体多肽并在哺乳动物细胞中以抗体形式表达所述多肽。
64.权利要求I的多肽，其中氨基酸修饰不包含在按照EU索引的位置317和353的同时修饰。
65.权利要求I的多肽，其中氨基酸修饰不包含在按照EU索引的位置332的取代。
全文摘要
本发明提供经合理设计的抗体和多肽，其包含协同地提供针对靶Fc受体的增强的选择性和结合亲和力的多个Fc区氨基酸取代。所述多肽在多个位置上突变，使其当掺入抗体治疗药中时比具有野生型Fc组分的那些更有效。
文档编号C07K16/00GK102971340SQ201180026665
公开日2013年3月13日 申请日期2011年3月28日 优先权日2010年3月29日
发明者I.德安吉洛, D.布莱勒, S.A.L.汤姆-尤, E.埃斯科巴-卡雷拉, P.I.拉里奥, A.奥尔恩, D.K.Y.潘, S.B.迪克西特 申请人:酵活有限公司