生产异源多聚体蛋白质的制作方法

专利名称：生产异源多聚体蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生产异源多聚体蛋白质(heteromultimeric proteins)的方法。
背景技术：
IgG类单克隆抗体包含两个相同的抗原结合臂和一个恒定区(Fe)。具有不同特异性的结合臂的抗体通常不天然存在，因此，必须利用化学工程(例如化学交联等)、重组DNA和/或细胞融合技术来制备。 双特异性抗体能够同时结合两个不同的抗原。该特性可以用于开发不能以常规单克隆抗体进行的治疗策略。已经开发的大量富于想象力的双特异性抗体形式反映了对这些分子的强烈兴趣。见 Berg J, Lotscher E, Steimer KS,等，“Bispecific antibodiesthat mediate killing of cells infectedwith human immunodeficiency virus of anystrain，” Proc Natl Acad SciUSA (1991) 88 (I I) : 4723-4727 以及 Fischer N 和 Leger 0·，iiBiospecificAntibodies:Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies, Tathobiology(2007)74:3-14o另一类多特异性分子是重组融合蛋白。由免疫调节蛋白的胞外结构域和免疫球蛋白(Ig)的恒定区(Fe)组成的重组融合蛋白代表了一类不断增长的人类治疗剂。免疫粘附素将蛋白质序列的结合区域(具有所需特异性)与抗体的效应结构域组合在一起。免疫粘附素具有两个对其作为治疗剂的潜力而言有意义的重要特性靶标特异性和药代动力学稳定性(体内半衰期和抗体的相当)。免疫粘附素可用作拮抗剂来抑制或阻断有害的相互作用，或作为激动剂来模拟或增强生理反应。见Chamow SM, Zhang DZ, Tan XY,等，“Ahumanized, bispecific immunoadhesin-antibody that retargetsCD3+effeetors tokill HIV-l-infected cells,”J Hematother 1995;4(5):439-446。其它文献中讨论了其它的多特异性分子。例子包括但不限于Fisher等，Pathobiology (2007) 74:3-14(对多种双特异性形式的评论);美国专利号6，660，843，2003年12月9日授予Feige等(肽体p印tibodies);美国专利公开号2002-004587，2002年I月10日公开(多特异性抗体)；美国专利号7612181,2009年11月3日授予Wu 等(双可变区形式)；美国专利号 6，534，628，Nord K 等，Prot Eng(1995)8:601-608，Nord K 等，Nat Biotech (1997) 15:772-777 和Griinwall等，Biotechnol Appl Biochem.(2008)Jun;50 (Pt 2):97-112(亲合体(Affibodies)) ；Martens 等，Clin CancerRes (2006)，12:6144-6152 和 Jin 等，Cancer Res (2008) 68 (11) :4360-4368 (单臂抗体)；Bostrom等，Science (2009) 323:1610-1614 (双功能Fab、aka混合价抗体)。其它形式为本领域技术人员所知。对于上述多特异性分子，制备临床级别的材料仍是一个挑战。如以上所指出的，存在许多途径可以生产具有混合结合臂(即互相不同的结合臂)的分子。这些方法每个都具有其自身的缺陷。化学交联是费力的，因为可能还需要将目的物从同二聚体和其它不需要的副产物中纯化出来。此外，化学修饰步骤可以改变蛋白质的完整性，从而导致差的稳定性。因此，该方法常常是低效的并可能导致抗体活性的丢失。细胞融合技术(例如,杂种杂交瘤)表达两种重链和两种轻链,这两条重链和两条轻链随机组装，导致产生10种抗体组合。所需要的异源多聚体抗体仅占这样产生的抗体的一小部分。对所需异源多聚体蛋白质的纯化显著地降低了生产产量和增加制备成本。重组DNA技术已被用来产生多种异源多聚体形式，例如单链Fv、双抗体(diabodies)等，它们不包含Fe区。这类抗体分子的主要缺陷是缺乏Fe区和由此缺乏抗体引发效应子功能(例如，补体激活、Fe受体结合等)的能力。因此，需要包含功能性Fe区的双特异性抗体。·
重组DNA技术也已被用来产生“knob into hole”双特异性抗体。见美国专利申请20030078385 (Arathoon等-Genentech)。该策略的一个局限性是两个亲本抗体的轻链必须相同，以防止由于它们在相同的细胞中表达而错配和形成不需要和/或无活性的分子。因此，仍然需要生产异源多聚体蛋白质的可供选择的方法。本文中描述的本发明提供了这样的方法。从本文提供的对本发明的描述，本发明的这些和其它方面以及优势将是显而易见的。发明简述使用目前的技术生产异源多聚体蛋白质(例如，多特异性抗体)具有缺陷，所述缺陷包括产生产品的混合物、降低的产量和效应子功能的降低/消失等。因此，需要高效和高水平生产异源多聚体蛋白质。通过各种手段生产抗体分子被广泛熟知。例如，美国专利6331415 (Cabilly等)描述了重组生产免疫球蛋白的方法，其中重链和轻链从单个载体或从位于单个细胞中的两个分开的载体同时表达。Wibbenmeyer 等(1999, Biochim Biophys Acta 1430 (2) : 191-202)以及Lee和Kwak (2003，J. Biotechnology 101:189-198)描述了使用在分开的大肠杆菌培养物中表达的质粒，从分开产生的重链和轻链生产单克隆抗体。在例如Harlow等，ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL, Cold Spring HarborLaboratory 出版社，ColdSpring Harbor, N. Y.，(1988)和W02006028936中描述了多种其它关于抗体生产的技术。然而，这些方法的每一种都具有例如产量低、使用化学试剂等缺陷。本发明方法提供在分开的宿主细胞中表达包含铰链的异源多聚体蛋白质的每一个成分，例如抗体的一个臂，和在不添加还原剂的情况下组装该含铰链的异源多聚体蛋白质，例如多特异性抗体。本发明提供了容易和高效的生产程序/方法，其允许经济地生产异源多聚体蛋白质，例如多特异性抗体。本发明提供了生产多特异性免疫球蛋白复合物(例如多特异性抗体)和其它多聚体蛋白质(在本文中统称为异源多聚体蛋白质)的高效和新颖的方法，所述方法克服了传统方法的局限性。根据本发明的方法，异源多聚体蛋白质，例如双特异性抗体，可以以高度同质的异源多聚体多肽形式提供。此外，本文中提供的方法不依赖于添加还原剂来实现在异源多聚体蛋白质中至少I个、至少2个、至少3个、至少4个链间二硫键的形成。在第一方面，本文中描述的方法允许制备异源多聚体蛋白质，所述异源多聚体蛋白质包含具有第一异源二聚化区域的第一含铰链的多肽、和具有第二异源二聚化区域的第二含铰链的多肽，其中第二异源二聚化区域与第一异源二聚化区域相互作用，且其中第一和第二含铰链的多肽通过至少一个链间二硫键连接，所述方法包括以下步骤(a)培养包含编码第一含铰链的多肽的第一核酸的第一宿主细胞，其中在表达该含铰链的多肽的条件下进行该培养；(b)培养包含编码第二含铰链的多肽的核酸的第二宿主细胞，其中在表达该含铰链的多肽的条件下进行该培养；
(C)破坏细胞膜，以使第一和第二含铰链的多肽释放到胞外环境中，其中第一和第二宿主细胞已在单个悬浮液中组合在一起；和(d)回收异源多聚体蛋白质，其中所述方法不需要添加还原剂。在第二方面，本发明涉及制备异源多聚体蛋白质的方法，所述异源多聚体蛋白质包含具有第一异源二聚化区域的第一含铰链的多肽、和具有第二异源二聚化区域的第二含铰链的多肽，其中第二异源二聚化区域与第一异源二聚化区域相互作用，且其中第一和第二含铰链的多肽通过至少一个链间二硫键连接，所述方法包括以下步骤(a)提供纯化的具有第一异源二聚化区域的第一含铰链的多肽；(b)提供纯化的具有第二异源二聚化区域的第二含铰链的多肽；(C)将第一和第二含铰链的多肽组合；(d)使第一含铰链的多肽与第二含铰链的多肽重折叠；和(e)回收异源多聚体蛋白质复合物。在第三方面，本文中提供的方法涉及制备异源多聚体蛋白质的方法，所述方法包括孵育第一对免疫球蛋白重链和轻链多肽和第二对免疫球蛋白重链和轻链多肽，其中孵育条件允许该第一对和第二对多肽多聚化以形成基本同质的抗体群体，其中该条件不包括添加还原剂；其中第一对多肽能够结合第一靶标；其中第二对多肽能够结合第二靶标分子；其中第一重链多肽的Fe多肽与第二重链多肽的Fe多肽在交界面上相遇，第二 Fe多肽的界面包含突起，所述突起可置入第一 Fe多肽界面的腔洞中。在第四方面，本发明提供了产生异源多聚体蛋白质的组合文库的方法，所述异源多聚体蛋白质包含具有第一异源二聚化区域的第一含铰链的多肽、和具有第二异源二聚化区域的第二含铰链的多肽，其中第二异源二聚化区域与第一异源二聚化区域相互作用，且其中第一和第二含铰链的多肽通过至少一个链间二硫键连接，所述方法包括以下步骤(a)培养第一宿主细胞和至少两种另外的宿主细胞，其中a.所述第一宿主细胞包含第一核酸，所述第一核酸编码包含第一异源二聚化区域的多肽；和b.所述另外的宿主细胞包含核酸，所述核酸编码包含第二异源二聚化区域的多肽，(b)将第一宿主细胞和该至少两种另外的宿主细胞混合；(C)处理细胞，以使包含第一和第二异源二聚化区域的多肽释放到胞外环境中；和(d)回收异源多聚体蛋白质，其中所述方法不需要添加还原剂。在第五方面，本发明提供了通过本文中描述的方法产生的异源多聚体蛋白质。应理解的是，本发明的方法可以包括对起始和/或完成本文所描述的本发明方法所包括的步骤而言显而易见的其它步骤，这些步骤通常是常规步骤。例如，在一个实施方案中，于本发明方法的步骤(a)之前加上一个步骤，在该步骤中，将编码第一含铰链的多肽的核酸引入到第一宿主细胞中，和将编码第二含铰链的多肽的核酸引入到第二宿主细胞中。在一个实施方案中，本发明的方法另外还包括纯化异源多聚体蛋白质的步骤，所述异源多聚体蛋白质具有与至少两个不同靶标的结合特异性。在一个实施方案中，在纯化异源多聚 体蛋白质步骤之前，不超过约10%、15%或20%的分离的多肽以单体或重链-轻链二聚体的形式存在。在一个实施方案中，第一和/或第二含铰链的多肽是抗体重链。在另一个实施方案中，抗体重链与抗体轻链配对形成重链-轻链对。在一些实施方案中，重链-轻链对是共价连接的。在另一个实施方案中，重链-轻链对规定靶标结合臂。在一些实施方案中，靶标结合臂是相同的。在一些实施方案中，靶标结合臂各自识别两个不同的靶标。在一些实施方案中，第一和/或第二含铰链的多肽包含Fe区。在另一个实施方案中，第一和/或第二含铰链的多肽包含至少一个重链恒定区。在另一个实施方案中，第一和/或第二含铰链的多肽包含重链可变区。在另一个实施方案中，第一和/或第二含铰链的多肽包含受体结合结构域。在另一个实施方案中，第一和/或第二含铰链的多肽是基本相同的(即，异源二聚化区域可以是不同的，而异源二聚化区域以外的区域是相同的)。在一些实施方案中，第一和/或第二含铰链的多肽是不同的。在一些实施方案中，异源多聚体蛋白质选自抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、单臂抗体、单特异性单价抗体、多特异性单价抗体、双特异性maxibody、monobody、免疫粘附素、肽体(peptibody)、双特异性肽体、单价肽体、亲和体(affibody)和受体融合蛋白。在一些实施方案中，所述异源多聚体蛋白质包含铰链区，所述铰链区具有通常能够形成重链间二硫键的半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基为至少I个、至少2个、至少3个、至少4个、或任何整数个(多达所有)。在一些实施方案中，铰链区中已经引入了额外的半胱氨酸。本发明的异源多聚体蛋白质也可以是抗体片段，例如Fe或Fe融合多肽，只要其包含免疫球蛋白的铰链区即可。Fe融合多肽通常包含与异源多肽序列(例如抗原结合结构域)融合的Fe多肽(或其片段)，例如受体胞外结构域(ECD)与免疫球蛋白Fe多肽融合(例如，Flt受体E⑶与IgG2Fc融合)。例如，在一个实施方案中，Fe融合多肽包含VEGF结合结构域，所述VEGF结合结构域可以是VEGF受体，包括flt、flk等。本发明的异源多聚体蛋白质通常包含重链恒定区和轻链恒定区。在一个实施方案中，本发明的异源多聚体蛋白质包含用于形成重链间二聚体化或多聚体化的修饰(例如但不限于，插入一个或多个氨基酸，以例如形成二聚体化序列例如亮氨酸拉链等)。在一些实施方案中，本发明的异源多聚体可以缺失Fe多肽的部分(但不是全部)，条件是其保留免疫球蛋白的铰链区。在一些这样的实施方案中，Fe多肽的缺失序列是 2和/*CH3结构域的部分或全部。在这样的实施方案的一些中，异源多聚体蛋白质包含，例如与重链片段的C末端融合的，二聚体化结构域(例如亮氨酸拉链序列)。在这些实施方案的一些中，异源多聚体蛋白质包含二聚体化结构域，所述二聚体化结构域包含突变以提供“knob into hole”二聚体化结构域(下文中进一步定义)。在本发明的方法和异源多聚体蛋白质的一些实施方案中，含铰链的多肽具有至少一个这样的特征，所述特征促进第一和第二含铰链的多肽的异源多聚体化而最大程度降低同源二聚体化(例如，在重链的Fe多肽之间)。这样的特征提高通过本文中描述的本发明方法可以得到的异源多聚体蛋白质群体的产量和/或纯度和/或同质性。在一个实施方案中，第一含铰链的多肽和第二含铰链的多肽的Fe多肽在界面处相遇/相互作用。在一些实施方案中，其中第一和第二含铰链的多肽的Fe多肽在界面上相遇，第二 Fe多肽的界面包含突起，所述突起可置入第一 Fe多肽界面的腔洞中。在一个实施方案中，第一 Fe多肽相对于模板/原始多肽已经被改变以编码腔洞，或第二 Fe多肽相对于模板/原始多肽已经被改变以编码突起，或者两者均发生。在一个实施方案中，第一 Fe多肽相对于模板/原始多肽已经被改变以编码腔洞，且第二 Fe多肽相对于模板/原始多肽已经被改变以编码突起，或者 两者均发生。在一个实施方案中，第二 Fe多肽的界面包含突起，所述突起可置入第一 Fe多肽界面的腔洞中，其中该腔洞或突起或两者是分别已经引入到第一和第二 Fe多肽的界面中的。在一些实施方案中，其中第一和第二 Fe多肽在界面上相遇，第一 Fe多肽的界面包含突起，所述突起可置入第二 Fe多肽界面的腔洞中。在一个实施方案中，第二 Fe多肽相对于模板/原始多肽已经被改变以编码腔洞，或第一 Fe多肽相对于模板/原始多肽已经被改变以编码突起，或两者均发生。在一个实施方案中，第二 Fe多肽相对于模板/原始多肽已经被改变以编码腔洞，且第一 Fe多肽相对于模板/原始多肽已经被改变以编码突起，或两者均发生。在一个实施方案中，第一 Fe多肽的界面包含突起，所述突起可置入第二 Fe多肽界面的腔洞中，其中该突起或腔洞或两者是分别已经引入到第一和第二 Fe多肽的界面中的。在一个实施方案中，突起和腔洞都包含天然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中，通过将模板/原始多肽界面的原始残基替代为比原始残基具有大的侧链体积的输入残基，产生包含突起的Fe多肽。在一个实施方案中，通过包括以下步骤的方法来产生包含突起的Fe多肽，在所述步骤中，所述多肽界面的原始残基的编码核酸，用具有比原始残基大的侧链体积的输入残基的编码核酸替代。在一个实施方案中，原始残基是苏氨酸。在一个实施方案中，输入残基是精氨酸(R)。在一个实施方案中，输入残基是苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，输入残基是酪氨酸(Y)。在一个实施方案中，输入残基是色氨酸(W)。在一个实施方案中，输入残基是R、F、Y或W。在一个实施方案中，通过置换模板/原始多肽中的两个或更多个残基来产生突起。在一个实施方案中，包含突起的Fe多肽包含以色氨酸对位置366的苏氨酸的取代,氨基酸编号根据Kabat等(Sequences of proteins of immunologicalinterest,第 5 版，卷 I (1991;NIH, Bethesda, MD)中第 688-696 页)的 EU 编号方案进行。在一些实施方案中，通过以比原始残基具有小的侧链体积的输入残基置换模板/原始多肽界面中的原始残基，产生包含腔洞的Fe多肽。例如，可以通过包括这样的步骤的方法来产生包含腔洞的Fe多肽，在所述步骤中，以比原始残基具有小的侧链体积的输入残基的编码核酸，置换所述多肽界面的原始残基的编码核酸。在一个实施方案中，原始残基是苏氨酸。在一个实施方案中，原始残基是亮氨酸。在一个实施方案中，原始残基是酪氨酸。在一个实施方案中，输入残基不是半胱氨酸(C)。在一个实施方案中,输入残基是丙氨酸(A)。在一个实施方案中,输入残基是丝氨酸(S)。在一个实施方案中,输入残基是苏氨酸(T)。在一个实施方案中，输入残基是缬氨酸(V)。可以通过置换模板/原始多肽的一个或多个原始残基来产生腔洞。例如，在一个实施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含对两个或更多个原始氨基酸的置换，所述原始氨基酸选自苏氨酸、亮氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含两个或更多个输入残基，所述输入残基选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含对两个或更多个原始氨基酸的置换，所述原始氨基酸选自苏氨酸、亮氨酸和酪氨酸，且其中以选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸的输入残基置换所述原始氨基酸。在一个实施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含以丝氨酸对366位的苏氨酸的置换，氨基酸编号根据Kabat等(同上引文)的EU编号方案进行。在一个实施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含以丙氨酸对第368位的亮氨酸的置换，氨基酸编号根据Kabat等(同上)的EU编号方案进行。在一个实施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含以缬氨酸对第407位的酪氨酸的置换，氨基酸编号根据Kabat等(同上)的EU编号方案进行。在一个实施方案中，包含腔洞的Fe多肽包含两个或多个氨基酸置换，所述置换选自T366S、L368A和Y407V，氨基酸编号根据Kabat等(同上)的EU编号方案进行。在 这些抗体片段的一些实施方案中，包含突起的Fe多肽包含以色氨酸对第366位的苏氨酸的置换，氨基酸编号根据Kabat等(同上)的EU编号方案进行。在多个实施方案中，第一和第二重链多肽的Fe多肽可以相同或可以不同，条件是它们能够二聚体化形成Fe区域(如本文中定义的)。第一 Fe多肽通常在单个多肽中与免疫球蛋白重链的一个或多个结构域毗邻连接，例如与铰链区、恒定区和/或可变区序列连接。在一个实施方案中，第一 Fe多肽包含铰链序列的至少一部分(包括全部)、Ch2结构域的至少一部分(包括全部)和/或Ch3结构域的至少一部分(包括全部)。在一个实施方案中，第一 Fe多肽包含免疫球蛋白的铰链序列以及Ch2和Ch3结构域。在一个实施方案中，第二 Fe多肽包含铰链序列的至少一部分(包括全部)、G2结构域的至少一部分(包括全部)和/或Ch3结构域的至少一部分(包括全部)。在一个实施方案中，第二 Fe多肽包含免疫球蛋白的铰链序列以及Ch2和Ch3结构域。在一个实施方案中，本发明的抗体包含第一和第二 Fe多肽，其各自包含至少一个抗体恒定区的至少一部分。在一个实施方案中，该抗体恒定区是Ch2和/或(^3结构域。在包含恒定区的本发明抗体的任何实施方案中，抗体恒定区可以来自任何类型的免疫球蛋白，例如IgG。该免疫球蛋白来源可以为任何合适的物种来源(例如，IgG可以是人IgG1)或可以是合成的。在一个实施方案中，分别在本发明抗体的第一和第二靶标分子结合臂中的第一轻链多肽和第二轻链多肽包含不同/截然不同的抗原结合决定簇(例如，不同/截然不同的可变区序列)。在一个实施方案中，分别位于本发明抗体的第一和第二靶标分子结合臂中的第一轻链多肽和第二轻链多肽包含相同的(即，共同的)抗原结合决定簇(例如，相同的可变区序列)。本发明的方法能够产生高同质性的异源多聚体分子。据此，本发明提供了这样的方法，其中至少约 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的多肽是包含第一重链和轻链多肽对和第二重链和轻链多肽对的复合物。在一个实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中约60至99%、70至98%、75至97%、80至96%、85至96%、或90至95%的多肽是包含第一重链和轻链多肽对和第二重链和轻链多肽对的复合物。在一个实施方案中，本发明的抗体选自IgG、IgE、IgA、IgM和IgD。在一些实施方案中，本发明抗体的铰链区优选是选自IgG、IgA和IgD的免疫球蛋白的。例如，在一些实施方案中，抗体或抗体的铰链区是IgG的，在一些实施方案中是IgGl或IgG2(例如IgG2a或IgG2b)。在一些实施方案中，本发明的抗体选自IgG、IgA和IgD。在一个实施方案中，抗体是人、人源化的、嵌合的或非人(例如鼠)来源的。本发明的异源多聚体蛋白质通常能够与抗原结合，优选特异性结合。这样的抗原包括例如肿瘤抗原、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化相关(例如，已知或推测在功能上起作用)的分子、细胞表面分子、淋巴因子、细胞因子、涉及细胞周期调控的分子、涉及脉管发生的因子和与血管发生相关(例如，已知或推测在功能上起作用)的分子。能够与本发明的异源多聚体蛋白质结合的抗原可以是上述类别之一的子类的成员，其中所述类别的其它子类包括具有不同特征(相对于目的抗原而言)的其它分子/抗原。目的抗原也可以被认为属于两个或更多个类别。在一个实施方案中，本发明提·供了结合，优选特异性结合，肿瘤抗原的异源多聚体蛋白质，所述肿瘤抗原不是细胞表面分子。在一个实施方案中，肿瘤抗原是细胞表面分子，例如受体多肽。在另一个实例中，在一些实施方案中，本发明的异源多聚体蛋白质结合，优选特异性结合，肿瘤抗原，所述肿瘤抗原不是分化群因子。在另一个实例中，本发明的异源多聚体蛋白质能够结合，优选特异性结合，分化群因子，所述分化群因子在一些实施方案中不是例如CD3或CD4。在一些实施方案中，本发明的异源多聚体蛋白质是抗VEGF抗体。在一些实施方案中，本发明的异源多聚体蛋白质是双特异性抗体，选自 IL-I a/IL-I β、IL-12/IL-18 ;IL-13/IL_9 ;IL-13/IL_4 ；IL-13/IL-5 ；IL-5/IL-4 ;IL-13/IL_1β ;IL-13/IL_25 ;IL_13/TARC;IL_13/MDC ;IL_13/MEF ；IL-13/TGF-^ ;IL_13/LHR 激动剂；IL-12/TWEAK, IL-13/CL25 ;IL_13/SPRR2a ;IL_13/SPRR2b ;IL-13/ADAM8、IL-13/PED2、IL17A/IL17F、CD3/CD19、CD138/CD20 ；CD138/CD40 ；CD19/CD20 ;CD20/CD3 ;CD38/CD138 ;CD38/CD20 ;CD38/CD40 ;CD40/CD20 ;CD-8/IL_6 ；CD20/BR3、TNFa /TGF-β、TNFa /IL-I β ;TNFa /IL-2、TNFa /IL-3、TNFa /IL-4、TNFa /IL-5、TNFa /IL6、TNFa /IL8、TNFa /IL-9、TNFa /IL-10、TNFa /IL-IU TNFa /IL-12、TNF a /IL-13、TNF a /IL-14、TNF a /IL-15、TNF a /IL-16、TNF a /IL-17、TNF a /IL-18、TNF a /IL-19、TNF a /IL-20、TNF a /IL-23、TNF a /IFN a , TNF a /CD4、TNF a /VEGF、TNF a /MIF、TNF a /ICAM-I、TNF a /PGE4、TNF a /PEG2、TNF a /RANK 配体、TNF a /Te38 ；TNF a /BAFF ；TNF a /CD22 ;TNFa /CTLA-4 ；TNFa /GP130 ;TNF a /IL_12p40 ;VEGF/HER2、VEGF-A/HER2、VEGF-A/PDGF、HER1/HER2、VEGF-A/VEGF-C、VEGF-C/VEGF-D、HER2/DR5、VEGF/IL-8、VEGF/MET、VEGFR/MET 受体、VEGFR/EGFR、HER2/CD 64、HER2/CD3、HER2/CD16、HER2/HER3 ；EGFR/HER2、EGFR/HER3、EGFR/HER4、IL-13/CD40L、IL4/CD40L、TNFR1/IL-1R、TNFR1/IL-6R、TNFR1/IL-18R、EpCAM/CD3、MAPG/CD28、EGFR/CD64、CSPGs/RGM A ;CTLA_4/BTN02 ；IGF1/IGF2 ；IGFl/2/Erb2B ；MAG/RGM A ；NgR/RGM A ；NogoA/RGMA ；0MGp/RGM A ;PDL-I/CTLA_4 JPRGM A/RGM B、ILlβ /1L18,NRPI/VEGFA,VEGFA/NRP2,cMET/EGFR,ALKI/BMP9,VEGFA/a 5 β UHERl/HER3-BU和CMV。在一些实施方案中，本发明的异源多聚体蛋白质与至少两个靶标分子结合，所述靶标分子选自α 5β 1、ALK1、BMP9、IL-1 a ,IL-I β、TARC、MDC、MEF、TGF-β、LHR 激动剂、TWEAK、CL25、SPRR2a、SPRR2b、ADAM8、PED2、CD3、CD4、CD16、CD19、CD20、CD22、CD28、CD40、CD38、CD64、CD138、CD-8, BR3、TNFa、TGF-β、IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-17A、IL-17F、IL-18,IL-19、IL-20、IL-23、IL-25、IFN a、MIF、ICAM_1、PGE4、PEG2、RANK 配体、Te38、BAFF、CTLA_4、GP130、IL-12p40、VEGF、VEGF-A, PDGF, HER1、HER2、HER3、HER3-BU、HER4、VEGF-C, VEGF-D,DR5、cMET、MET、MET 受体、VEGFR、EGFR、CD40L、TNFRl、IL-1R、IL-6R、IL-18R、EpCAM、MAPG、CSPGs, BTN02、IGFl、IGF2、IGF1/2、Erb2B、MAG、NgR、NogoA、NRP1、NRP2、OMGp, PDL-I, RGMA和RGM B0在一些实施方案中，本发明的异源多聚体蛋白质与⑶3和至少一个另外的靶标分子结合，所述另外的靶标分子选自BLR1、BR3、CD19、CD20、CD22、CD72、CD79A、CD79B、CD180 (RP105)、CR2、FcRHl、FcRH2、FcRH5、FCER2、FCRL4、HLA-DOB 和 NAG14。可以在任何允许目的多肽表达和分离的环境下培养本发明方法的第一和第二宿主细胞。例如，在一个实施方案中，本发明方法的第一宿主细胞和第二宿主细胞作为分开的细胞培养物来生长。在另一个实施方案中，本发明方法的第一宿主细胞和第二宿主细胞作为包含这两种宿主细胞的混合培养物来生长。 在一些实施方案中，至少I种、至少2种、至少3种或更多种表达另外的含铰链多肽的宿主细胞可以与第一和/或第二含铰链的宿主细胞，在相同的或分开的培养物中生长。在一些实施方案中，另外的含铰链多肽包含与第一含铰链多肽相同的异源二聚化区域。在一些实施方案中，另外的含铰链多肽包含与第二含铰链多肽相同的异源二聚化区域。可以对异源多聚体蛋白质进行修饰以增强和/或添加另外所需特性。这样的特性包括生物学功能，例如免疫效应子功能、期望的体内半衰期/清除率、生物利用度、生物分布或其它药代动力学特性。这样的修饰在本领域公知，也可以凭经验来确定，其可以包括通过可以基于肽或不基于肽的结构部分进行的修饰。例如，抗体可以是糖基化或非糖基化的，这通常至少部分取决于宿主细胞的性质。优选，本发明的抗体是非糖基化的。通过本发明方法产生的非糖基化抗体随后可以例如使用本领域公知的体外糖基化方法进行糖基化。如上文所述，可以在原核细胞例如大肠杆菌中生产本发明的异源多聚体蛋白质。大肠杆菌产生的异源多聚体蛋白质通常是非糖基化的，缺乏与哺乳动物宿主细胞(例如CH0)产生的异源多聚体蛋白质中的糖基化谱通常相关的生物学功能。本发明还提供了免疫缀合物，所述免疫缀合物包含与异源部分缀合的本发明的异源多聚体蛋白质。任何异源部分，只要其与抗体的缀合不显著降低抗体的所需功能和/或特性，都将是适宜的。例如，在一些实施方案中，免疫缀合物包含细胞毒性剂作为异源部分。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂选自放射性同位素、化学治疗剂和毒素。在一些实施方案中，所述毒素选自加利车霉素(calichemicin)、美登素(maytansine)和单端孢素(trichothene)。在一些实施方案中，免疫缀合物包含的异源部分是可检测标记。在一些实施方案中，所述可检测标记选自放射性同位素、配体-受体对的成员、酶-底物对的成员和荧光共振能量转移对的成员。在一个方面，本发明提供了组合物，所述组合物包含本发明的异源多聚体蛋白质和载体，所述载体在一些实施方案中是药学上可接受的。在另一个方面，本发明提供了组合物，所述组合物包含本文中描述的免疫缀合物和载体，所述载体在一些实施方案中是药学上可接受的。在一个方面，本发明提供了组合物，所述组合物包含本发明的多特异性异源多聚体蛋白质群体。对本领域技术人员显而易见的是，通常，这样的组合物不会是完全(即100%)同质的。然而，如本文中所描述的，本发明的方法能够生产基本同质的多特异性异源多聚体蛋白质群。例如，本发明提供了组合物，所述组合物包含异源多聚体蛋白质，其中所述异源多聚体蛋白质的至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%,99%是本文中描述的本发明的多特异性抗体(例如双特异性抗体等)。在一个方面，本发明提供了细胞培养物，所述细胞培养物包含第一宿主细胞和第二宿主细胞的混合物，其中第一宿主细胞包含第一含铰链多肽的编码核酸，第二宿主细胞包含第二含铰链多肽的编码核酸，其中这两对多肽具有不同的靶标结合特异性。在一个方面，本发明提供了细胞培养物，所述细胞培养物包含第一宿主细胞和第二宿主细胞的混合物，其中第一宿主细胞表达第一对重链和轻链多肽，第二宿主细胞表达第二对重链和轻链多肽，其中这两对多肽具有不同的靶标结合特异性。在另一个方面，本发明提供了制品，所述制品包括容器和其中包含的组合物，其中 组合物包含本发明的异源多聚体蛋白质(例如抗体)。在另一个方面，本发明提供了制品，所述制品包括容器和其中包含的组合物，其中组合物包含本文中描述的免疫缀合物。在一些实施方案中，这些制品还包括使用所述组合物的说明书。在另一个方面，本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明的异源多聚体蛋白质。在另一个方面，本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码本文中描述的免疫缀合物。在一个方面，本发明提供了用于表达本发明分子(例如抗体)的重组载体。在另一个方面，本发明提供了用于表达本发明的免疫缀合物的重组载体。多种宿主细胞都可以用于本发明方法中。这样的宿主细胞在本领域已知(本文中描述了其中的一些)，或可以经验性地使用本领域已知的常规技术就其用于本发明方法的适宜性进行确定。在一个实施方案中，宿主细胞是原核的。在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(E. coli)。在一些实施方案中，大肠杆菌是脂蛋白缺陷型(AlPP)菌株。在一些实施方案中，大肠杆菌宿主细胞的基因型缺乏degP和prc基因，携带突变spr基因。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸或重组载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞，其在一些实施方案中是大肠杆菌。本发明的宿主细胞可以还包含编码这样的分子的多核苷酸或重组载体，所述分子在宿主细胞中的表达增强本发明方法中异源多聚体蛋白质的产量。例如，这样的分子可以是伴侣蛋白。在一个实施方案中，所述分子是原核多肽，其选自DsbA、DsbC、DsbG和FkpA。在一些实施方案中，所述多核苷酸或重组载体编码DsbA和DsbC两者。在一些实施方案中，大肠杆菌宿主细胞是内源蛋白酶活性缺陷型菌株。在一些实施方案中，大肠杆菌宿主细胞的基因型是缺乏degP和prc基因并携带突变的spr基因的大肠杆菌菌株的基因型。在一些实施方案中，大肠杆菌宿主细胞的基因型是Λ1ΡΡ。本发明的异源多聚体蛋白质具有用于多种情况中的多种用途。在一个实例中，本发明的异源多聚体蛋白质是治疗性抗体。在另一个实例中，本发明的异源多聚体蛋白质是激动剂抗体。在另一个实例中，本发明的异源多聚体蛋白质是拮抗剂抗体。本发明的异源多聚体蛋白质也可以是诊断性抗体。在另一个实例中，本发明的异源多聚体蛋白质是封闭抗体。在另一个实例中，本发明的异源多聚体蛋白质是中和抗体。在一个方面，本发明提供了治疗或延缓受试者疾病的方法，所述方法包括给所述受试者施用本发明的异源多聚体蛋白质。在一个实施方案中，所述疾病是癌症。在另一个实施方案中，所述疾病与血管发生的失调相关。在另一个实施方案中，所述疾病是免疫失调，例如类风湿性关节炎、免疫性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮等。在一个方面，本发明提供了本发明的异源多聚体蛋白质(例如，抗体)在制备药物中的应用，所述药物用于疾病的治疗和/或预防，所述疾病例如癌症、肿瘤、细胞增殖失调、免疫(例如自身免疫)失调和/或血管发生相关失调。在一个方面，本发明提供了本发明的核酸在制备药物中的应用，所述药物用于疾病的治疗和/或预防，所述疾病例如癌症、肿瘤、细胞增殖失调、免疫(例如自身免疫)失调和/或血管发生相关失调。在一个方面，本发明提供了本发明的表达载体在制备药物中的应用，所述药物用于疾病的治疗和/或预防，所述疾病例如癌症、肿瘤、细胞增殖失调、免疫(例如自身免疫)失调和/或血管发生相关失调。在一个方面，本发明提供了本发明的宿主细胞在制备药物中的应用，所述药物用于疾病的治疗和/或预防，所述疾病例如癌症、肿瘤、细胞增殖失调、免疫(例如自身免疫)失调和/或血管发生相关失调。在一个方面，本发明提供了本发明的制品在制备药物中的应用，所述药物用于疾病的治疗和/或预防，所述疾病例如癌症、肿瘤、细胞增殖失调、免疫(例如自身免疫)失调和/或血管发生相关失调。在一个方面，本发明提供了本发明的套盒在制备药物中的应用，所述药物用于疾病的治疗和/或预防，所述疾病例如癌症、肿瘤、细胞增殖失调、免疫(例如自身免疫)失调和/或血管发生相关失调。 通过以下详细描述，本发明的其它目的、特征和优势将变得显而易见。然而，应理解的是，该详细描述和具体实例，尽管指出本发明的优选实施方案)，但仅作为举例说明性目的而提供，本领域技术人员从该详细描述将明了落入本发明的范围和精神内的各种改变和变化。附图简述图IA图示完全氧化的半抗体。没有显示“鼓突”(knob)或“洞”(hole)或其它异源二聚化区域。该图中描述的半抗体是IgGl同种型。本领域技术人员将明了，可以将其它免疫球蛋白同种型看成具有相应的链间和链内键的半抗体。在完整的Ab中，铰链半胱氨酸将形成链间二硫键。图IB图示全长双特异性抗体。没有描绘铰链区中重链间二硫键。图2A和B分别图示编码鼓突和洞半抗体的质粒。图3A图示使用共同轻链方法生产异源多聚体蛋白质，例如双特异性抗体。所生产的BsAb具有两条不同的重链，每条重链分别与共同轻链配对。图3B图示使用分开构建和表达的半抗体生产异源多聚体蛋白质，例如双特异性抗体。所生产的BsAb典型地具有两条不同的重链，每条重链各自与其关联(cognate)轻链配对。在该方法中，各半抗体的各轻链不必相同。图4A是使用分开构建和表达的半抗体生产双特异性抗体的流程图。在该方法中，使用了氧化还原化学。图4B显示了考马斯染色的凝胶。通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下分析两个半抗体。在非还原条件下，主要级分是每个半抗体的75kD轻链-重链对。在还原条件下(例如，以DTT处理)，每条链作为分开的条带可见。图4C显示，在用和不用ImM N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理时，半抗体的ESI-TOF质谱结果。在用NEM处理后，没有观察到半抗体质量的改变，表明所有的半胱氨酸被完全氧化。在所描述的氨基酸序列中，将氧化的铰链半胱氨酸表示为环状二硫键。半抗体的预期质量是72，548道尔顿，这也是通过质谱观察到的，表示没有共价加合物。·
图4D显示抗EGFR/抗c_met双特异性抗体产生的羧甲基(CM)色谱、SDS-PAGE凝胶照片和去褶合后的质量。CM色谱产生单个峰，随后以SDS-PAGE对该峰进行分析。凝胶上的主要条带是全长(即，完整的)双特异性抗体。在75kD处也可以看见弱带。随后以质谱对主要条带进行分析，表明该唯一的可检测完整抗体产物与抗EGFR/抗c-met双特异性抗体的理论丽一致。图5A是使用分开构建和表达的半抗体大规模生产双特异性抗体的流程图。图5B是凝胶照片，其显示纯化的半抗体在非还原条件下主要是约75kD物质。在还原条件下(即，以DTT处理)，每条链作为分开的条带可见。图5C显示在去除聚集物后纯化的双特异性抗体的SDS-PAGE分析结果，表明主要物是在150kD的完整双特异性抗体。也显示了在还原条件下的相同样品，其表明，所有分离的产物是抗体轻链或重链。图6A图示在TF-2细胞增殖试验中抗体的生物学活性，所述试验检查对细胞因子IL-4和IL-13的中和作用。该图显示，双特异性抗体具有与一起或分开添加的两个由哺乳动物生产的全长抗体相同的活性。图6B是一组3个图，其显示，对于野生型Fe和突变Fe，通过ELISA测定的食蟹猴(cynomologous monkey)中抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体的药代动力学(PK)性质。第一图显示，对于野生型Fe，在2mg/kg剂量的PK特性。中间的图显示在20mg/kg剂量的PK特性，也针对野生型Fe。最后一个图显示，对于突变Fe，在20mg/kg剂量的PK特性。在测试的动物中，双特异性抗体表现出预期的双室清除。封闭的符号表示雌性，开放的符号表示雄性。在三个动物中，观察到了抗治疗剂反应，表现为在第21天血清中测量到的抗体的急剧降低。图7是聚丙烯酰胺凝胶照片。在裂解前，以变化的比率混合全发酵肉汤。在裂解后，提取蛋白质，并在非还原条件下上样到凝胶上。在该过程中形成的纯化的双特异性抗体作为在凝胶顶部的条带可见。图8A是两块聚丙烯酰胺凝胶的照片，其比较了在将表达半抗体的细胞分开培养和共培养时双特异性抗体的产生。在共培养条件下，完整的双特异性抗体的形成水平要高得多。当将半抗体分别表达和纯化后再混合时，半抗体形成低于5%的完整双特异性抗体。在共培养条件下，使用Li-Core蛋白质测定法，按照150kD/(150kD+75kD)进行测定，高于40%的是完整的双特异性抗体。
图8B是改变起始接种的细胞群体的共培养实验示意图。在图的底部显示了所使用的比率和全长双特异性抗体的相对量。图8C是针对I: I细胞比率的抗EGFR和抗c_Met的3个分开的10升发酵反应的凝胶图。每个反应均产生全长双特异性抗体作为主产物，表明该过程的可重复性。图8D是用于生产异源多聚体蛋白质例如双特异性抗体的共培养方法的流程图。图8E是280nm处UV吸收色谱，其鉴定出了在滞留时间91. 79和102. 35处的两个显著的峰。随后的质谱分析表明，完整的双特异性抗体与过量的半抗体有效地分开。图8F显示通过SDS-PAGE和质谱对来自图8E的峰91. 79进行的分析。质谱数据的去褶合产生在146，051. 89道尔顿处的单个峰，这与双特异性抗体的预期质量一致。没有检测到污染的同二聚体种类。图SG比较用于异源多聚体蛋白质的独立生产和共培养生产的工作流程。图9A显示3个色谱图。顶部的色谱图显示在不含EDTA的样品洗脱期间无吸收峰。中间的色谱图显示含EDTA的样品具有明显的洗脱峰，从该峰中回收了约I. 5mg蛋白质。底部的色谱图显示以EDTA和Mg处理的样品也表现出类似的洗脱峰，从该峰中回收了 I. Img蛋白质。在还原和非还原条件下，以SDS-PAGE，分析了从EDTA样品、EDTA加Mg样品回收的蛋白质、以及来自未EDTA处理的样品的相同滞留时间的级分的合并物。图9B是图9A中所描述的SDS-PAGE凝胶的照片。以EDTA处理的样品产生了完整的双特异性抗体，所述抗体已经被释放到了培养基中。图9C-1、图9C-2和图9C-3显示图9A中回收和描述的样品的质谱图。含EDTA的样品显示出了双特异性抗体的预期质量和过量的半抗体的质量。图9D是所指条带的SDS-PAGE凝胶图和质谱图。第I泳道是MW标记，第2泳道是独立表达的抗IL-13，第3泳道是独立表达的抗IL-4，第4泳道是两种细胞的共培养。所有三个样品的质谱分析显示，共培养产生完整的双特异性抗体和过量的一种半抗体，抗IL-4。这表明抗IL-13半抗体是化学计量限制性的。当将半抗体分别表达和纯化后再混合，半抗体形成约2%(抗IL-13)和3%(抗IL-4)的完整双特异性抗体。在共培养条件下，使用Li-Core蛋白质测定法，以150kD/(150kD+75kD)测定，约60%为完整的双特异性抗体。图9E-1和图9E-2显示在起始发酵接种物中具有所示不同细胞比率的两个共培养物的两个HIC色谱。观察到了产物的明显不同，这反映了起始接种物的比率。使用该方法，显而易见的是，可以通过改变起始接种物的比率来实现异源多聚体蛋白质的最优生产。图9F是一组4个图片，其显示在还原和非还原条件下，对通过本文中描述的共培养方法生产的8个不同的双特异性抗体，进行的SDS-PAGE分析。没有显示抗⑶3/抗⑶19异源多聚体蛋白质在非还原条件下的凝胶。箭头指示完整的双特异性抗体。

图10是筛选异源多聚体蛋白质的矩阵方法的示意图。图11的两个图显示使用本文中描述的方法生产的双特异性抗体的体外活性。图12图示抗EGFR/抗c-met双特异性抗体在KP4胰腺异种移植物体内模型中拥有抗肿瘤活性。图13图示抗EGFR/抗c-met双特异性抗体在A431鳞状细胞癌异种移植物体内模型中拥有抗肿瘤活性。
图14显示A)组装前鼓突、B)组装前洞、C)组装后双特异性抗体的HIC。图14D是组装前的每个臂的凝胶。图15显示组装后物质的电泳图，表明86%的物质是完全氧化的。图16 :对组装的双特异性抗体的表征。A)退火的(annealed)双特异性抗体的HIC色谱，其表明物质中多于90. 5%的是双特异性抗体，B)最终样品的质谱去褶合，C)纯化后的物质的凝胶图，和D)理论质量表。图17是氧化还原程序(有加热)的示意图a)将样品加热I小时以允许二硫键环化，b)然后冷却和使用2mM DTT还原半胱氨酸2小时，和c)然后浓缩和通过室温进行透
析来空气氧化半胱氨酸。图18是氧化还原程序(无加热)的示意图a)将样品混合2个小时，b)使用2mM DTT还原半胱氨酸2小时，和c)然后浓缩、和通过室温进行透析来除去EDTA，同时空气氧化
半胱氨酸。图19 :对组装的双特异性抗体的分析，A)使用有加热步骤的氧化还原程序的HIC色谱，B)使用无加热步骤的氧化还原程序的HIC色谱。缩略词ADCC=抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(Antibody-dependentcelInediatedcytotoxicity)API=抗病原体免疫粘附素(Anti-pathogen immunoadhesins)BPI=杀细菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability-increasingprotein)Clq=补体因子 Iq (Complement factor lq)CD=分化群 Cluster of Differentiation)CDC=补体依赖性细胞毒性 Complement-dependent cytotoxicity)CHl 或 ChI=重链第 I 恒定区(Heavy chain first constant domain)CH2 或 Ch2=重链第 2 恒定区(Heavy chain second constant domain)CH3 或 CH3=重链第 3 恒定区(Heavy chain third constant domain)CH4 或 CH4=重链第 4 恒定区(Heavy chain fourth constant domain)CL 或 C1=轻链恒定区(Light chain constant domain)CTLA=细胞毒性 T 淋巴细胞相关分子(Cytotoxic Tlymphocyte-associatedmolecule)Fc=可结晶片段(Fragment crystallizable)Fe γ R=IgG 的 Fe 部分的 Y 受体(Receptor gamma for the Fe portion of IgG)HIV=人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)ICAM=细胞间粘附分子(Intercellular adhesion molecule)BsAb=双特异性抗体(Bispecific antibody)BsDb=双特异性双抗体(Bispecific diabody)dsFv= 二硫键稳定的 Fv(Disulde-stabilized Fv)Fc=抗体的恒定片段(Constant fragment of an antibody)Fd=抗体的 VH+CH1 (VH+CHlof an antibody)FcR=Fc 受体(Fe receptor)
Fv=抗体的可变片段(Variable fragment of an antibody)IgG=免疫球蛋白 G(Immunoglobulin G)mAb=单克隆抗体(Monoclonal antibody)PBL=外周血淋巴细胞(Peripheral blood lymphocyte)scDb=单链双抗体(Single-chain diabody)scFv=单链 Fv (Single-chain Fv)(scFv) 2=scFv-scFv 串联物(scFv-scFv tandem)Tandab=串联双抗体(Tandem diabody) VH 或 Vh =抗体重链的可变区(Variable domain of the heavy chain ofanantibody )VL 或 V1=抗体轻链的可变区(Variable domain of the light chain ofanantibody)发明详述现使用以下定义和实施例，以举例说明的方式，详细描述本发明。通过参考引用的方式明确地并入本文所提及的所有专利和出版物，包括这些专利和出版物中公开的所有序列。除非在本文中另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域中技术人员所通常理解的含义。Singleton等，Dictionary ofMicrobiology andMolecular Biology, 2d Ed. , John Wiley 和 Sons, NewYork (1994)，以及Hale和Marham, TheHarper Collins Dictionary ofBiology, Harper Perennial, NY(1991)为技术人员提供了有关本发明使用的许多术语的一般词典。本文描述了优选的方法和材料，但在实施或测试本发明中可以使用与本文中所描述的方法和材料类似或相同的任何方法和材料。数值范围涵盖定义该范围的数值。除非另有说明，核酸按5’至3’方向从左到右书写；氨基酸按氨基至羧基方向从左到右书写。关于本领域的定义和术语，实施者尤其可以参考Samtoook等，1989，和Ausubel FM等，1993。应理解的是，本发明不限于所描述的具体方法、操作程序和试剂，因为它们是可以改变的。数值范围涵盖定义该范围的数值。除非另有说明，核酸按5’至3’方向从左到右书写；氨基酸按氨基至羧基方向从左到右书写。对于本发明的各个方面和实施方案，本文中提供的标题并不对其构成限制，而是可以参考说明书整体而获得。因此，以下定义的术语通过参考说明书整体，获得更全面的定义。I.定义“异源多聚体”、“异源多聚体复合物”或“异源多聚体蛋白质”指包含至少第一含铰链的多肽和第二含铰链的多肽的分子，其中第二含铰链的多肽与第一含铰链的多肽在氨基酸序列上至少有一个氨基酸残基的不同。异源多聚体可以包括由第一和第二含铰链的多肽形成的“异源二聚体”，或在除了第一和第二含铰链的多肽之外还存在其它多肽时，可以形成更高级的三级结构。异源多聚体的多肽可以通过非肽共价键(例如二硫键)和/或非共价相互作用(例如，氢键、离子键、范德华力和/或疏水性相互作用)而在彼此之间发生相互作用。本文中所使用的“异源多聚化结构域”指，对生物学分子进行改变和添加，以促进异源多聚体的形成和阻碍同源多聚体的形成。具有强烈的形成异二聚体而非同二聚体的倾向的任何异源二聚化结构域均涵盖在本发明范围内。举例说明性例子包括但不限于，例如美国专利申请20030078385 (Arathoon等-Genentech;描述了鼓突位于洞中)；W02007147901 (Kjaergaard等-Novo Nordisk:描述了离子相互作用)；WO 2009089004 (Kannan等-Amgen:描述了静电引导效应)；美国临时专利申请61/243, 105 (Christensen 等-Genentech;描述了卷曲螺旋)。也见，例如 Pa ck, P.和Plueckthun, A. , Biochemistry 31, 1579-1584 (1992)描述了亮氨酸拉链，或 Pack 等,Bio/Technology 11, 1271-1277(1993)描述了螺旋-转角-螺旋基序。在本文中，表述“异源多聚化结构域”和“异源二聚化结构域”可互换使用。本文中使用的短语“含铰链的多肽”指这样的多肽，其包含相应于本领域中所理解的免疫球蛋白铰链区的区域，例如重链ChI和Ch2区之间的区域。本文中使用的“铰链区”、“铰链序列”和它们的变体包括本领域已知的含义，该含义在例如Janewayj s Immunobiology, (Garland Science,Taylor& Francis Group, LLC, NY)(第 7 版，2008);Bloom 等，Protein Science (1997), 6:407-415;Humphreys 等，J.Immunol. Methods (1997)，209:193-202 中进行了说明。也见，例如 Burton, Molec.Immunol. 22:161-206 (1985)以及 Papadea,C.和 I·J.Check (1989) “Humanimmunoglobulin Gand immunoglo bulin G su bclasses:biochemical, genetic,andclinicalaspects. 〃Crit Rev Clin Lab Sci 27(1):27_58。本领域技术人员知道，氨基酸的数量以及可用于形成链间二硫键的半胱氨酸残基的数量在不同类和同种型的免疫球蛋白之间是不同的。所有这些铰链区均可以用于含铰链的多肽中，落入本发明范围内。本文中的术语“抗体”按最广义使用，指包含两个重链和两个轻链的任何免疫球蛋白(Ig)分子，以及其任何片段、突变体、变体或衍生物，只要该片段、突变体、变体或衍生物表现出所需要的生物学活性(例如，表位结合活性)即可。抗体的例子包括本文中描述的单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。作为一个参考，本文中使用的抗体指免疫球蛋白G(IgG)的结构。然而，本领域技术人员将理解/认识到，任何免疫球蛋白类别的抗体都可以用于本文中描述的本发明方法中。清楚地讲，IgG分子包含一对相同的重链(HCs)和一对相同的轻链(LCs)。每个LC具有一个可变区(\)和一个恒定区(Cl)，而每个HC具有一个可变区(Vh)和3个恒定区(CH1, Ch2和Ch3)。ChI和Ch2区通过铰链区相连接。该结构在本领域公知。参见图IB。本文中使用的“半抗体”指与一个免疫球蛋白轻链结合的一个免疫球蛋白重链。图IA中描绘了示例性半抗体。本领域技术人员将容易理解，半抗体也可以具有由单个可变区组成的抗原结合区。术语“maxibody”指包含与Fe多肽融合的scFv的融合蛋白。参见W02009089004的图8a。关于双特异性maxibody，参见WO 2009089004的图2。根据EU编号系统，术语人IgG Fe区的“Ch2区”通常从IgG的约231位残基延伸到约340位残基。该(^2区是独特的，因为其不与别的区域紧密配对。相反地，两个N连接的分支碳水化合物链介于完整的天然IgG分子的两个CH2区之间。具推测，该碳水化合物可能提供对结构域-结构域配对的替代，和帮助稳定Ch2区。Burton, Molec.Immunol. 22:161-206(1985)。术语“Ch3区”包括Fe区中位于Ch2区C端的该残基链(即，根据EU编号系统，从IgG的约第341位氨基酸残基至约第447位氨基酸残基)。本文中使用的术语“Fe区”通常指包含免疫球蛋白重链C端多肽序列的二聚体复合物，其中C端多肽序列是可通过以木瓜蛋白酶消化完整的抗体而获得的多肽序列。Fe区可以包含天然的或变异的Fe序列。尽管免疫球蛋白重链的Fe序列的界限可以变化，人IgG重链Fe序列通常被定义为从约位置Cys226或从约位置Pro230的氨基酸残基延伸到Fe序列的羧基末端。除非本文另有说明，Fe区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统来进行的，EU编号系统也称为EU索引，其描述于Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第 5版.Public HealthService, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD, 1991中。免疫球蛋白的Fe序列通常包含两个恒定区，即CH2区和CH3 区，和可选地包含(^4区。本文中，“ Fe多肽”意指组成Fe区的多肽之一，例如单体Fe。Fe多肽可以从任何合适的免疫球蛋白例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚类，IgA、IgE、IgD或IgM获得。Fe区包含通过二硫键而被抓在一起的两个H链的羧基端部分。抗体的效应子功能由Fe区中的序列决定；该区也是存在于某些类型细胞中的Fe受体(FcR)所识别的部分。在一些实施方案中，Fe多肽(通常在其N端)包含野生型铰链序列的部分或全部。在一些实施方案中，Fe多肽不包含功能性或野生型铰链序列。“功能性Fe区”拥有天然序列Fe区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括Clq结合；CDC; Fe受体结合；ADCC;吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调，等。这样的效应子功能通常需要Fe区与结合区(例如抗体可变区)组合，并可以使用例如在本文的定义中公开的多种测定试验来进行评估。“天然序列Fe区”包含与天然发现的Fe区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fe区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；和天然序列人IgG4Fc区，以及它们的天然存在的变体。“变体Fe区”包含由于至少一个氨基酸的改变，优选一个或多个氨基酸置换，而与天然序列Fe区不同的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fe区或亲本多肽的Fe区相比较，变体Fe区具有至少一个氨基酸置换，例如在天然序列Fe区或亲本多肽的Fe区中约I个至约10个氨基酸置换，优选约I个至5个氨基酸置换。本文中的变体Fe区与天然序列Fe区和/或与亲本多肽的Fe区优选具有至少约80%的同源性，和更优选具有至少约90%的同源性，更优选具有至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%的同源性。本文中使用的“Fe组分”指Fe区的铰链区、Ch2区或CH3区。在某些实施方案中，含铰链的多肽包含IgG Fe区，优选来自野生型人IgG Fe区。“野生型”人IgG Fe意指在人类群体内天然存在的氨基酸序列。当然，正如Fe序列在个体间可以稍微不同一样，对野生型序列可以进行一个或多个改变而仍然落入本发明的范围内。例如，Fe区可以包含与本发明不相关的另外改变，例如糖基化位点的突变或非天然氨基酸的纳入。术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别以％和'表示)通常具有相似的结构，每个结构域包含4个保守的构架区(FRs)和3个超变区(HVRs)。见例如，Kindt等.KubyImmunology,第 6 版，W. H. Freeman andCo.，第 91 页(2007)。单个 Vh 或 Vl 区足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL区，分别筛选互补的VL或VH区的文库,分离结合特定抗原的抗体。见例如,Portolano等，J. Immunol. 150:880-887 (1993);Clarkson 等，Nature 352:624-628 (1991)。本文中使用的术语“Fab”指抗体的抗原结合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段，即“Fab”片段，和残余的“Fe”片段(即Fe区，同上)。Fab片段由一条完整的L链与一条重链的可变区和该H链(Vh)的第一恒定区(ChI)组成。本文中使用的短语“抗原结合臂”、“靶标分子结合臂”、“靶标结合臂”以及它们的变体，指本发明的异源多聚体蛋白质的组成部分，其具有特异性结合目的靶标的能力。通常和优选地，抗原结合臂是免疫球蛋白多肽序列，例如免疫球蛋白轻链和重链的CDR和/或可变区序列，的复合物。·“靶标”或“靶标分子”指异源多聚体蛋白质的结合臂所识别的结构部分。例如，如果异源多聚体蛋白质是抗体，则根据情况，靶标可以是单个分子上或不同分子上的表位、或病原体或肿瘤细胞。类似地，如果异源多聚体蛋白质是受体-Fe融合蛋白，则靶标将是该受体的关联结合配偶体。本领域技术人员知道，靶标由靶标结合臂的结合特异性决定，不同的靶标结合臂可以识别不同的靶标。靶标优选以高于IuM Kd的亲和力(根据斯卡查德(scatchard)分析)，与本发明的异源多聚体蛋白质结合。靶标分子的实例包括但不限于血清可溶性蛋白质和/或它们的受体，例如细胞因子和/或细胞因子受体、粘附素、生长因子和/或它们的受体、激素、病毒颗粒(例如，RSV F蛋白、CMV、StaphA、流感病毒、C型肝炎病毒)、微生物(例如，细菌细胞蛋白、真菌细胞)、粘附素、CD蛋白和它们的受体。“完整”或“全长”抗体的一个例子是包含抗原结合臂以及Q和至少重链恒定区
的抗体。这些恒定区可以是天然序列恒定区(例如人天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。本文中使用的术语“偶联”指，将第一和第二含铰链的多肽彼此连接起来，例如形成共价键，所需要的步骤。这样的步骤可以包括对第一和第二含铰链的多肽中的半胱氨酸残基进行的还原、退火和/或氧化，以形成链间二硫键。偶联可以通过化学交联或使用氧化还原体系来实现。见例如，Humphreys 等,J. Tmmunol. Methods (1998) 217:1-10 和 Zhu等，CancerLett.，(1994)86:127-134。术语“多特异性抗体”按其最广义使用，尤其涵盖具有多表位特异性的抗体。这样的多特异性抗体包括但不限于包含重链可变区(Vh)和轻链可变区(')的抗体，其中该Vh'单元具有多表位特异性；具有两个或多个\和Vh区的抗体，每个Vh'单元与不同的表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的表位结合；全长抗体，抗体片段，例如Fab、Fv、dsFv、scFv,双抗体(diabodies),双特异性双抗体和三抗体(triabodies),已共价或非共价连接在一起的抗体片段。“多表位特异性”指与相同或不同靶标上的两个或更多个不同的表位特异性结合的能力。“单特异性”指仅与一个表位结合的能力。根据一个实施方案，多特异性抗体是IgG抗体，其与每个表位以5μ M至O. OOlpM、3 μ M至 O. 001ρΜ、1 μ M 至 O. 001ρΜ、0· 5 μ M至 O. ΟΟΙρΜ、或 O. I μ M 至 O. OOlpM 的亲和力结合。
图IB提供了双特异性的示意图。“抗体片段”包括完整抗体的部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’ )jPFv片段；双抗体(Db);串联双抗体(taDb);线性抗体(例如美国专利号 5，641，870; Zapata 等，Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 (1995));单臂抗体；单可变区抗体；微型抗体；单链抗体分子；以及从抗体片段形成的多特异性抗体(例如，包括但不限于 Db-Fc、taDb-Fc、taDb_CH3 和(scFV) 4_Fc)。表述“单域抗体”(sdAbs)或“单可变区(SVD)抗体”通常指其中的单个可变区(Vh或')能够赋予抗原结合的抗体。换句话说，单可变区不需要通过与另一个可变区相互作用来识别靶标抗原。单域抗体由每个抗原结合臂上的单个单体可变抗体区(％或\)组成。单域抗体的实例包括那些源自驼科动物(美洲驼和骆驼)和软骨鱼(例如护士鲨)的抗体和那些通过重组方法来自人和小鼠抗体的抗体(Ward等，Nature (1989) 341:544-546; Dooley 和 Flajnik,Dev Comp Immunol(2006) 30:43-56;MuyIdermans 等,TrendBiochemSci(2001) 26:230-235;Holt 等，Trends Biotechnol (2003) :21 :484-490;WO2005/035572; WO 03/035694; Davies 和 Riechmann, Febs Lett (1994) 339:285-290; W000/29004;WO 02/051870)。单可变区抗体可以和其它不是单域抗体的可变区或可变结构域一起存在于抗原结合臂中(例如，同源或异源多聚体)。表述“线性抗体”通常指描述于 Zapata 等，Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 (1995)中的抗体。简单地说，这些抗体包含一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。本文中所提及的术语“鼓突入洞”(“knob-into-hole”)或“KnH”技术指，在体外或体内引导两个多肽配对到一起的技术，其通过在两多肽相互作用的界面上，将突起(鼓突)弓丨入到一个多肽中和将腔(洞)引入到另一多肽中而实现。例如，已经将KnHs引入到了抗体的Fe:Fe 结合界面、Cl:ChI 界面或 Vh/\界面中(例如，US2007/0178552, WO 96/027011, WO98/050431 和 Zhu 等·(1997)Protein Science 6:781-788)。这对于在多特异性抗体的制备过程中促使两个不同的重链配对到一起特别有用。例如，在其Fe区具有KnH的多特异性抗体可以进一步包括与每个Fe区连接的单可变区，或进一步包括与类似的或不同的轻链可变区配对的不同重链可变区。KnH技术也可以用于将两个不同的受体胞外区配对到一起或使包含不同靶标识别序列的任何其它多肽序列(例如，包括亲和体、肽体和其它Fe融合体)配对。“Fv”为一个重链可变区和一个轻链可变区以紧密、非共价结合的方式形成的二聚体。由这两个区域的折叠生出6个超变环(3个环来自H链，3个环来自L链)，所述超变环贡献用于抗原结合的氨基酸残基和赋予抗体对抗原的结合特异性。然而，即使是单可变区(或包含仅3个对抗原特异的CDRs的Fv的一半，)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其通常以比完整结合位点低的亲和力进行结合。“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接到单个多肽链中的Vh和Vl抗体区的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含VH和VL区之间的多肽接头，所述接头使sFv形成用于抗原结合所需的结构。关于sFv的综述,参见Pluckthun, The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,第 113 卷,Rosenburg 和 Moore 编辑,Springer-Verlag, NewYork,第 269-315 页(1994) ;Malmborg 等，J. Immunol. Methods 183:7-13,1995。术语“双抗体”(“diabodies”)指小的抗体片段，其通过构建在VH和VL区之间具有短接头(约5-10个残基)的sFv片段(见上述段落)来制备，其中该短接头使得所述V区发生链间而不是链内配对，从而形成二价片段，即具有两个抗原结合位点。双特异性双抗体是两个“交叉” sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL区存在于不同的多肽链上。双抗体更详细地描述于例如EP 404, 097; WO 93/11161;和Hollinger等，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)中。术语“单臂抗体”指这样的抗体，其包含(I)通过肽键与包含CH2区、CH3区或CH2-CH3区的多肽连接的可变区，和⑵第二 CH2、CH3或CH2-CH3区，其中可变区与包含第二CH2XH3或CH2-CH3区的多肽不通过肽键连接。在一个实施方案中，单臂抗体包含3个多肽(I)包含可变区(例如VH)、CH1, CH2和CH3的第一多肽，⑵包含可变区(例如Vl)和Q区的第二多肽，以及(3)包含CH2和CH3区的第三多肽。在另一个实施方案中，单臂抗体具有部分铰链区，所述铰链区包含两个半胱氨酸残基，它们形成连接恒定重链的二硫键。在一个 实施方案中，单臂抗体的可变区形成抗原结合区。在另一个实施方案中，单臂抗体的可变区是单可变区，其中每个单可变区都是抗原结合区。在另一个实施方案中，单臂抗体是单可变区抗体。本发明的抗体可以是“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与来自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源；本发明的抗体可以是这样的嵌合抗体的片段，只有它们表现出所需的生物学活性(美国专利号4，816，567;和Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。本文中有用的嵌合抗体包括含有来自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变区抗原结合序列和人恒定区序列的灵长类化抗体。非人(例如啮齿类动物)抗体的“人源化”形式是包含来自非人抗体的最小量序列的嵌合抗体。就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的超变区的残基被具有所需抗体特异性、亲和力和能力的来自小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类动物等非人物种的抗体(供体抗体)的超变区的残基置换。在一些例子中，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可以包含受体抗体和供体抗体中没有的残基。进行这些改变以进一步精细化抗体的性能。一般来说，人源化抗体将包含至少一个和通常两个可变区的基本上全部，其中所有或基本上所有的超变环对应于非人免疫球蛋白的，而所有或基本上所有的FRs是人免疫球蛋白序列的。人源化抗体可选地还可以包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多详情见Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann 等,Nature 332:323-329 (1988);和 Presta, Curr.Op.Struct.Biol. 2:593-596(1992)。“肽体”指随机产生的肽与Fe区的融合体。见美国专利号6，660，843，2003年12月9日授予Feige等(就其全部内容通过参考引用的方式并入本文)。它们包括一个或多个肽连接到N末端、C末端、氨基酸侧链或这些位点的多个上。肽体技术使得能够设计并入了靶向一个或多个配体或受体的肽、肿瘤导航肽(tumor-homing peptide)、膜转运肽等的治疗齐U。已证明肽体技术在许多这样的分子的设计中有用，包括线性和二硫键约束的肽、“串联肽多聚体”(即，多个肽在Fe区的单链上)。见例如，美国专利号6，660，843;美国专利申请号2003/0195156, 2003 年 10 月 16 日公布(对应于 W002/092620, 2002 年 11 月 21 日公布)；美国专利申请号2003/0176352，2003年9月18日公布(对应于WO 03/031589，2003年4月17日公布);美国系列号09/422，838，1999年10月22日串请(对应于WO 00/24770，2000年5月4日公布);美国专利申请号2003/0229023，2003年12月11日公布；W003/057134, 2003年7月17日公布；美国专利申请号2003/0236193，2003年12月25日公布(对应于PCT/US04/010989，2004年4月8日申请)；美国系列号10/666，480, 2003年9月18日申请(对应于WO 04/026329，2004年4月I日公布)，其每一项均就其全部内容通过参考引用的方式并入本文。“亲和体”指使用通过肽键与Fe区连接的蛋白质，其中蛋白质用作支架以提供靶标分子的结合表面。所述蛋白质通常是天然存在的蛋白质，例如葡萄球菌A蛋白或IgG结合性B结构域，或来自它们的Z蛋白(见Nilsson等(1987), Prot Eng I, 107-133,和美国专利号5，143，844)或它们的片段或衍生物。例如，可以从具有改变的靶标分子结合亲和力的Z蛋白变体来产生亲和体，其中通过随机诱变，对Z蛋白的一段进行突变，以产生能够结合靶标分子的变体的文库。亲和体的实例包括美国专利号6，534，628，Nord K等，Prot·Eng 8:601-608(1995)和 Nord K 等，Nat Biotech 15:772-777 (1997) · Biotechnol ApplBiochem. 2008Jun;50(Pt 2):97_112。本文中使用的术语“免疫粘附素”指这样的分子，其组合了异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性和免疫球蛋白恒定区的效应子功能。在结构上，免疫粘附素包含具有所需结合特异性的氨基酸序列与免疫球蛋白恒定区序列(例如，IgG的CH2和/或CH3序列)的融合，其中所述氨基酸序列不是抗体的抗原识别和结合位点(即，其与抗体的恒定区是“异源的”)。示例性粘附素序列包括这样的连续氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与目的蛋白质结合的受体或配体的一部分。粘附素序列也可以是与目的蛋白质结合的序列但不是受体或配体序列(例如，肽体中的粘附素序列)。可以通过多种方法选择或鉴定这样的多肽序列，所述方法包括噬菌体展示技术和高通量分选技术。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区可以获自任何免疫球蛋白，例如IgGU IgG2、IgG3或IgG4亚类，IgA(包括IgAl和IgA2)、IgE、IgD 或 IgM0本文中使用的“复合物”或“复合的”指两个或更多个分子的缔合，其中这些分子通过不是肽键的键和/或作用力(例如，范德华力、疏水作用力、亲水作用力)彼此发生相互作用。在一个实施方案中，复合物是异源多聚体。应理解的是，本文中使用的术语“蛋白质复合物”或“多肽复合物”包括这样的复合物，在该蛋白质复合物中具有与蛋白质缀合的非蛋白质实体(例如，包括但不限于，化学分子，例如毒素或检测试剂)。“与目的抗原结合”的本发明异源多聚体蛋白质是这样的蛋白质，其与靶标以足够的亲和力结合，以致于该异源多聚体蛋白质可以用作诊断和/或治疗剂以靶向蛋白质或表达该靶标的细胞或组织，而不显著地与其它蛋白质交叉反应。在这样的实施方案中，在通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀法(RIA)或ELISA进行测定时，异源多聚体蛋白质与“非靶标”蛋白质结合的程度将低于抗体与其特定靶标蛋白质的结合的大约10%。关于异源多聚体蛋白质与靶标分子的结合，术语“特异性结合”、“特异地结合至”、或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位，是指该结合与非特异相互作用(例如，非特异性相互作用可以是与牛血清白蛋白或酪蛋白的结合)具有测量上的差异。可以例如通过测定分子的结合并与对照分子的结合相比较来测定特异性结合。例如，可以通过与类似靶标的对照分子(例如过量的非标记靶标)的竞争来测定特异性结合。在这样的情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的非标记靶标竞争性抑制，则表明特异性结合。本文中使用的术语“特异性结合”、“特异地结合至”、或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位，可以例如表现为分子对靶标具有至少约200nM的KcU或者至少约150nM、或者至少约ΙΟΟηΜ、或者至少约60nM、或者至少约50nM、或者至少约40nM、或者至少约30nM、或者至少约20nM、或者至少约ΙΟηΜ、或者至少约8nM、或者至少约6nM、或者至少约4nM、或者至少约2nM、或者至少约InM或更高的KcL在一个实施方案中，术语“特异性结合”指这样的结合，其中异源多聚体蛋白质与特定多肽或特定多肽上的表位结合，而基本上不与任何其它多肽或多肽表位结合。“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单个结合位点和其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和力量。除非另有说明，本文中使用的“结合亲和力”指内在的结合亲和力，其反映了结合对(例如抗体和抗原)成员之间1:1的相互作用。通常可以 用解离常数(Kd)来表示分子X与其配偶体Y的亲和力。例如，Kd可以是约200nM、150nM、ΙΟΟηΜ、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、InM、或更强。可以通过本领域已知的普通方法来测定亲和力，所述方法包括本文中描述的那些方法。低亲和力的抗体通常与抗原结合缓慢并倾向于易于解离，而高亲和力的抗体通常与抗原结合更快并倾向于较长时间保持结合。本领域已知多种测量结合亲和力的方法，为本发明目的，可以使用任何这些方法。在一个实施方案中，使用BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ)，利用表面等离子体共振测定法，以约10个反应单位(RU)，以固定的靶标(例如抗原)CM5芯片，在25° C测定根据本发明的“Kd”或Kd值。简言之，根据供应商的说明书，以N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore公司)。以IOmM乙酸钠(pH 4. 8)将抗原稀释到5 μ g/ml (约O. 2 μ Μ)后以5 μ 1/min的流速进行注射，以获得约10个反应单位(RU)的偶联蛋白质。在注射抗原后，注射IM乙醇胺以封闭未反应的基团。为了进行动力学测量，在25° C，以约25 μ 1/min的流速，注射在含O. 05%吐温20的PBS (PBST)中两倍系列稀释的Fab (例如，0. 78nM至500nM)。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore评估软件第3. 2版)，计算结合速率(km)和解离速率(Iitff)。平衡解离常数(Kd)计算为 koff/kon。见例如 Chen 等，J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。如果通过以上表面等离子体共振测定法测得的结合速率超过IO6M4S'则可以使用荧光淬灭技术来测定结合速率，所述荧光淬灭技术是在25。C，在存在递增浓度的抗原时，以分光计测量于PBS (pH7. 2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发=295nm;发射=340nm, 16nm带通)的增加或降低,所述分光计例如装备了停流(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有揽拌比色杯(stirredcuvette)的 8000 系列 SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)。除非另有说明，就本发明的异源多聚体蛋白质例如抗体、其片段或衍生物而言，“生物学活性的”、“生物学活性”和“生物学特性”，意指具有与生物分子结合的能力。
当用来描述各种异源多聚体多肽时，“分离的”意指异源多聚体已从表达它的细胞或细胞培养物中分离和/或回收。其天然环境中的污染成分是干扰异源多聚体的诊断或治疗用途的物质，可以包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。在某些实施方案中，异源多聚体将被纯化至(I)以Lowry方法测量，蛋白质的95%以上重量，最优选99%以上重量，(2)足以通过旋杯测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE、使用考马斯蓝或优选地银染确定的同质。然而，通常，通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。通常，本发明的异源多聚体被纯化至基本上同质。短语“基本上同质”、“基本上同质的形式”用来表示，产物基本上没有源自不需要的多肽组合的副产物(例如同源多聚体)。以纯度来表述，基本上同质意指副产物的量按重量计不超过10%、9%、8%、7%、6%、4%、3%、2%或1%，或按重量计低于1%。在一个实施方案中，副产物低于5%。“生物分子”指核酸、蛋白质、碳水化合物及其组合。在一个实施方案中，生物分子 天然存在。本文中使用的“连接”意指第一和第二氨基酸序列之间直接的肽键连接，或涉及第三氨基酸序列的连接，所述第三氨基酸序列是位于第一和第二氨基酸序列之间并与它们键接的肽。例如，与一个氨基酸序列的C末端以及另一个氨基酸序列的N末端键接的接头肽。本文中使用的“接头”意指两个或更多个氨基酸长度的氨基酸序列。接头可以由不带电荷的极性氨基酸或非极性氨基酸组成。接头可以长例如2至100个氨基酸，例如长2至50个氨基酸，例如长3、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。接头可以是“可切割的”，例如自我切割或酶促或化学切割。氨基酸序列中的切割位点、以及在这样的位点上切割的酶和化学试剂在本领域公知并也描述于本文中。本文中使用的“系链”(tether)意指连接两个其它氨基酸序列的氨基酸接头。本文中描述的系链可以将免疫球蛋白重链可变区的N端和免疫球蛋白轻链恒定区的C端连接起来。在特定的实施方案中，系链长约15至50个氨基酸，例如长约20至26个氨基酸(例如长20、21、22、23、24、25或26个氨基酸)。系链可以是“可切割的”，例如自我切割，或使用本领域的标准方法和试剂进行酶促或化学切割。“接头”或“系链”的酶促切割可以涉及使用内肽酶，例如Lys-C、Asp-N, Arg-C,V8、Glu-C、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶、Genenase、Xa因子、TEV(烟草蚀刻病毒半胱氨酸蛋白酶)、肠激酶、HRV C3(人鼻病毒C3蛋白酶)、激肽原酶以及枯草杆菌蛋白酶样蛋白原转化酶(例如Furin (PCl)、PC2或PC3) /或N-精氨酸二元转化酶(N-arginine dibasic convertase)。化学切割可以涉及使用例如轻胺、N-氯代琥拍酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺或溴化氰。本文中使用的“Lys-C内肽酶切割位点”是可以在C端一侧被Lys-C内肽酶切割的氨基酸序列中的赖氨酸残基。Lys-C内肽酶在赖氨酸残基的C端一侧进行切割。“离液剂”意指这样的水溶性物质，其通过干扰起稳定作用的分子内相互作用(例如，氢键、范德华作用力或疏水效应)，破坏蛋白质(例如抗体)的三维结构。示例性离液剂包括但不限于尿素、胍-HC1、高氯酸锂、组氨酸和精氨酸。“温和洗涤剂”意指这样的水溶性物质，其通过干扰起稳定作用的分子内相互作用(例如，氢键、范德华作用力或疏水效应)，破坏蛋白质(例如抗体)的三维结构，但其不永久地破坏蛋白质结构以导致生物学活性丢失(即，不变性蛋白质)。示例性温和洗涤剂包括但不限于，吐温(Tween)(例如吐温20)、Triton (例如Triton X-100)、NP-40 (壬基酹聚氧乙烯醚)、Nonidet P-40 (辛基酹聚氧乙烯醚)和十二烧基硫酸钠(SDS)。抗体“效应子功能”指归因于抗体的Fe区(天然序列Fe区或氨基酸序列变体Fe区)的生物学活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指一种形式的细胞毒性，其中分泌的Ig与存在于某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fe受体(FcRs)结合，使这些细胞毒性效应细胞能特异地与携带抗原的靶细胞结合，并随后以细胞毒性物杀死该靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，其对于这种杀伤作 用是绝对需要的。用于介导ADCC的原代细胞、NK细胞仅表达Fe Y RIII，而单核细胞表达Fe Y RI> Fe Y RII和Fe y RIII FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-92(1991)第464页的表3中。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行例如美国专利号5，500, 362或5，821，337中描述的体外ADCC测定。用于这样的测定的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选地或此外，可以在例如 Clynes 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中，对目的分子的ADCC活性进行体内评估。“Fe受体”或“FcR”指与抗体的Fe区结合的受体。优选的FcR是人FcR。此夕卜，优选的FcR是结合IgG抗体的FcRU受体)，其包括Fe yRI、FcyRII和FcyRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。Fe Y RII受体包括Fe Y RIIA( “激活性受体”)和FcyRIIB( “抑制性受体”)，它们具有类似的氨基酸序列，主要差异在于其胞质区。激活性受体Fe Y RIIA在其胞质区包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体Fe Y RIIB在其胞质区包含免疫受体酪氨酸抑制基序(Ι Μ)(见M. DaerOIl, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997)的综述)。Ravetch 和 Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492(1991);Capel 等，Immunomethods 4:25-34(1994);和 de Haas等,J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)中对 FcRs 进行了综述。本文中的术语“FcR”涵盖其它FcRs，包括以后将被鉴定出的FcRs。该术语也包括新生儿受体FcRn，其负责将母体的IgGs转运到胎儿中(Guyer等,J. Immunol. 117:587 (1976)和Kim等,J.Immunol. 24:249(1994))。“人效应细胞”是表达一个或多个FcRs和执行效应子功能的白细胞。优选地，该细胞表达至少Fe Y RIII和执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单个核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；优选PBMCs和NK细胞。可以从天然来源例如血液中分离效应细胞。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指靶细胞在补体存在时的裂解。经典补体途径的活化起始于补体系统的第一成分(Clq)与结合到关联抗原上的抗体(适当的亚类)的结合。为了评估补体的激活，可以进行例如Gazzano-Santoro等，J. Immunol. Methods202:163(1996)中描述的CDC测定试验。
术语“治疗有效量”指可以治疗受试者的疾病或失调的抗体、抗体片段或衍生物的量。在肿瘤(例如，癌性肿瘤)的情况下，抗体或抗体片段(例如，多特异性抗体或抗体片段)的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；缩小原发瘤的大小；抑制(即在一定程度上减缓和优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓和优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与失调相关的一个或多个症状。如果抗体或抗体片段可以阻止已存在的癌细胞的生长和/或将其杀死，则其可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，可以例如通过评价存活持续时间，到达疾病进展的时间(TTP)、反应率(RR)、反应持续时间和/或生活质量,测量体内功效。“减少或抑制”意指，导致优选20%或更高、更优选50%或更高、和最优选75%、85%、90%、95%或更高的总体降低的能力。减少或抑制可以针对所治疗的失调的症状、转移灶的存在或大小、原发瘤的大小、或血管发生失调中血管的大小或数量。术语“癌”和“癌性”指或描述哺乳动物的生理状况，其典型地具有不受控制的细胞生长/增殖的特征。该定义包括良性和恶性癌。癌(cancer)的实例包括但不限于上皮 癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这些癌症的更具体实例包括，鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌，包括肠胃癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳房癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(例如，肾细胞癌)、肝癌、前列腺癌、夕卜阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤，以及各种类型的头颈癌。“早期癌症”意指不具侵略性或转移性的癌症或分类为第0、1或II阶段的癌症。术语“癌前”指典型地在癌症之前或发展为癌症的状况或生长。“非转移性的”意指癌是良性的或保留在原发位置而没有透入淋巴或血管系统或除了原发位置以外的其它组织中。通常，非转移性癌是任何第O、I或II阶段的癌症，和偶尔是第III阶段的癌症。本文中，“变应性或炎性疾病”是由个体的免疫系统过度激活引起的疾病或失调。示例性变应性或炎性疾病包括但不限于，哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、特应性皮炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、湿疹、器官移植、年龄相关性黄斑变性、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、嗜酸细胞性食管炎、和与炎症相关的自身免疫性疾病。本文中，“自身免疫病”是指，由个体自身组织引起并对抗该组织的疾病或失调、或与其共分离的状况或其表现形式、或由其导致的状况。自身免疫疾病或失调的实例包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎，例如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎症性关节炎、退行性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、脊椎关节炎、和少年发病类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎、关节炎畸形、原发性慢性多关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎)，炎性过度增生性皮肤病，银屑病例如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲银屑病，皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎，X-连锁高IgM综合症，荨麻疹例如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，幼年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化症例如系统性硬化病，多发性硬化(MS)例如spino-optical MS、原发进行性MS (PPMS)和复发缓解型MS (RRMS)，进行性系统性硬化病，动脉粥样硬化，动脉硬化，弥漫性硬化(sclerosis disseminate)和共济失调硬化(ataxic sclerosis),炎性肠病(IBD)(例如，克罗恩氏病、自身免疫介导性胃肠疾病，结肠炎例如溃疡性结肠炎、colitis ulcerosa,显微镜性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎、透壁性结肠炎和自身免疫性炎症性肠病)，坏疽性脓皮症，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，巩膜外层炎，呼吸窘迫综合征，包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，葡萄膜的全部或部分的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫血液学紊乱，类风湿性脊柱炎，突发性耳聋，IgE介导的疾病例如过敏反应、变应性和特异反应性鼻炎，脑炎例如Rasmussen脑炎和边缘性脑炎和/或脑干脑炎，眼色素层炎例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫葡萄膜炎，伴有和无肾病综合征的肾小球肾炎(GN)，例如慢性或急性肾小球肾炎例如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性增生性GN(MPGN)，包括I型和II型，和急进性GN，变应性病状，变应性反应，湿疹，包括变应性或特应性湿疹，哮喘，例如支气管哮喘、自身免疫哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病状，慢性肺炎疾病，自身免疫心肌炎，白细胞粘附缺陷病，系统性红斑狼疮(SLE)例如皮肤型SLE、亚急性皮肤型红斑狼疮、新生儿期狼疮综合征(NLE)、播散性红斑狼疮，狼疮(包括肾炎、脑炎、小儿、非肾性、肾外、盘状、脱发)，幼年型(I型)糖尿病，包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、成人型糖尿病(II 型糖尿病)、自身免疫性糖尿病，特发性尿崩症，与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫反应，结核，结节病，肉芽肿病，包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳肉芽肿病，粒细胞缺乏症，血管炎病，包括脉管炎(大血管的血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(Takayasu’ s)动脉炎)、中型血管的血管炎(包括Kawasaki病和结节性多动脉炎)、显微型多动脉炎、CNS脉管炎，坏死性、皮肤性或超敏性脉管炎，系统性坏死性血管炎，和ANCA相关血管炎例如Churg-Strauss血管炎或综合征(CSS)，颞动脉炎,再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，库氏试验阳性贫血，Diamond Blackfan贫血，溶血性贫血，或免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血(anemia perniciosa)，Addison病，纯红细胞贫血或再生障碍(PRCA)，VIII因子缺乏症，血友病A，自身免疫性中性粒细胞减少，全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞渗出的疾病，中枢神经系统炎症疾病，多脏器损伤综合征例如继发于败血症、创伤或大出血的那些，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，Bechef s或Behcet’ s病，Castleman，s 综合征，Goodpasture’ s 综合征，ReynaudJ s 综合征，Sjogren’ s 综合征，Stevens-Johnson综合征,类天疱疮例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮,天疱疮(包括寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、天疱疮黏膜类天疱疮、和红斑性天疱疮)，自身免疫多内分泌腺病，Reiter’s病或综合征，免疫复合物性肾炎，抗体介导的肾炎，视神经脊髓炎，多发性神经病，慢性神经病例如IgM多发性神经病或IgM介导的神经病，血小板减少症(例如，心肌梗死患者产生的)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫性或免疫性血小板减少症，例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP，睾丸和卵巢自身免疫性疾病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退，甲状旁腺机能减退，自身免疫性内分泌疾病，包括甲状腺炎例如自身免疫性甲状腺炎、Hashimoto’ s病、慢性甲状腺炎(Hashimoto’ s甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺病，特发性甲状腺机能减退，Grave’ s病，多腺体综合征例如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)，副肿瘤综合征，包括神经学副肿瘤综合征，例如Lambert-Eaton肌无力综合征或Eaton-Lambert综合征，僵人综合征，脑脊髓炎例如变态反应性脑脊髓炎或变应性脊髓炎和试验性变应性脑脊髓炎(EAE)，重症肌无力例如胸腺瘤相关重症肌无力，小脑退化，神经性肌强直，视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病，多灶性运动神经病，Sheehan’ s综合征，自身免疫性肝炎，慢性肝炎，狼疮样肝炎，巨细胞性肝炎，慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，淋巴间质性肺炎，闭塞性细支气管炎(非移植)对NSIP，Guillain-Barre综合征,Berger’s病(IgA肾病),特发性IgA肾病,线性IgA皮肤病,原发性胆汁性肝硬化，肺硬化，自身免疫性肠病综合征，乳糜泻，乳糜泄，口炎性腹泻(麸质性肠病)，难治性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋白血症，肌萎缩性侧索硬化症(ALS; LouGehrig’ s病)，冠心病，自身免疫性耳病例如自身免疫性内耳病(AIED)，自身免疫性听力损失，视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，多软骨炎例如顽固性或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，淀粉样变性，巩膜炎，非癌性淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多，包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如，良性单克隆丙种球蛋白病和意义不明性单克隆丙种球蛋白病，MGUS),周围神经病，副肿瘤综合征,通道病(channelopathy)例如癫痫、偏头痛、心律失常、肌疾病、耳聋、目盲、周期性瘫痪、和中枢神经系统的通道病，孤独症，炎性肌病，局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝失调，纤维性肌痛(fibromyalgia),多内分泌功能衰竭，Schmidt’ s综合征，肾上腺炎，胃萎 缩，早老性痴呆，脱髓鞘疾病例如自身免疫性脱髓鞘疾病，糖尿病性肾病，Dressier’ s综合征，斑秀，CREST综合征(韩质沉着症、Raynaud’ s现象，食道运动功能障碍、指端硬化和毛细血管扩张)，男性和女性自身免疫性不孕，混合性结缔组织病，Chagas ^病，风湿热，习惯性流产，农民肺，多形红斑，心切开术后综合征，Cushing’ s综合征，养鸟者肺，变应性肉芽肿性血管炎，良性淋巴细胞血管炎，Alport’ s综合征，肺泡炎例如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风病，痕疾，利什曼病，kypanosomiasis,血吸虫病,蛔虫病，曲霉病，Sampterj s综合征，Caplan’ s综合征,登革热,心内膜炎,心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，间质性肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久性隆起性红斑，胎儿成红细胞增多，嗜酸性筋膜炎，ShulmanJ s综合征，Feltyj s综合征,丝虫病(flariasis)，睫状体炎(cyclitis)，例如慢性睫状体炎、异色性睫状体炎、虹膜睫状体炎或Fuch’ s睫状体炎,过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura),人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，艾柯病毒感染，心肌病，Alzheimer’ s病，细小病毒感染，风疹病毒感染，免疫接种后综合征，先天性风疫感染，Epstein-Barr病毒感染,腿腺炎，Evan’ s综合征，自身免疫性性腺衰竭，Sydenham舞蹈症,链球菌感染后肾炎，闭塞性血栓性血管炎(thromboangitisubiterans)、甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞多肌痛，内分泌性眼病，慢性超敏性肺炎，干燥性角结膜炎，流行性角结膜炎，特发性肾炎综合征，微小病变性肾病，良性家族性和缺血再灌注损伤，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道疾病，硅肺病，口疮，口疮性口炎，动脉硬化病，aspermiogenese,自身免疫性溶血，Boeck’ s病，冷球蛋白血症，DupuytrenJ s 挛缩，晶状体过敏性眼内炎(endophthalmia phacoanaphylactica),变应性小肠炎，麻风结节性红斑，特发性面瘫，慢性疲劳综合征，风湿热(febrisrheumatica),Ha_an-Rich’ s病，感觉神经性耳聋，阵发性血红蛋白尿，性腺机能减退，区域性回肠炎，白细胞减少症，传染性单核细胞增多症，横贯性脊髓炎，原发性特发性粘液性水肿，肾变病，交感性眼炎(ophthalmiasymphatica),肉芽肿性睾丸炎、胰腺炎，急性多神经根炎(polyradiculitisacuta),坏疽性脓皮症，QuervainJ s甲状腺炎,获得性脾萎缩，由抗精子抗体引起的不育，非恶性的胸腺瘤，白癜风，SCID和Epstein-Barr病毒相关的疾病，获得性免疫缺损综合征(AIDS)，寄生虫病例如利什曼原虫，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的疾病，白细胞粘附缺陷病，与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫反应，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，变应性神经炎，自身免疫性多内分泌腺病，卵巢炎，原发性黏液水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿性疾病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌缺陷，周围神经病，I类自身免疫性多腺体综合征，成人发作特发性甲状旁腺机能减退(AOIH)，全秃，扩张性心肌病，获得性大疱性表皮松解(EBA)，血色沉着病，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，脓性或非脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦炎、上颌窦炎、或蝶窦炎，嗜酸性粒细胞相关疾病例如嗜酸性粒细胞增多、嗜酸性粒细胞增多性肺浸润，嗜酸性粒细胞增多-肌痛综合征，Loffler’ s综合征，慢性嗜酸性肺炎，热带肺嗜酸细胞增多症，支气管肺炎曲霉病，曲霉肿，或包含嗜酸性粒细胞的肉芽肿，过敏反应,血清阴性脊柱关节病(seronegative spondy loarthr it ides),多内分泌自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜炎、巩膜外层炎，慢性皮肤粘膜念珠菌病，Bruton’ s综合征，婴儿期短暂性低丙种球蛋白血症，Wiskott-Aldrich综合征，共济失调性毛细血管扩张症，与胶原病 相关的自身免疫性疾病，风湿病，神经病，缺血再灌注障碍，血压降低反应，血管功能障碍，antgiectasis，组织损伤，心血管缺血，痛觉过敏，脑缺血，伴随血管化的疾病，变应性超敏疾病，肾小球肾炎，再灌注损伤，心肌或其它组织的再灌注损伤，具有急性炎症成分的皮肤病，急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎症疾病，眼及眼眶炎性疾病，粒细胞输血相关综合征，细胞因子诱导的毒性，急性严重炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，肺硬化，糖尿病视网膜病，糖尿病大动脉障碍，动脉内膜增生(endarterialhyperplasia),胃溃瘍,心瓣炎以及子宫内膜异位。本文中使用的术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞的功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P32,和Lu的放射性同位素)，化疗剂例如甲氨蝶呤、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春花新碱、长春花碱、依托泊式)，阿霉素(doxorubicin),美法仑,丝裂霉素C,苯丁酸氮芥，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂，酶和其片段例如核溶解酶，抗生素，以及毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促激活毒素，包括其片段和/或变体，和本文中公开的各种抗肿瘤、抗癌和化疗试剂。本文描述了其它细胞毒性剂。杀肿瘤剂导致肿瘤细胞破坏。“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，例如噻替派和CYTOXAN 环磷酰胺；烷基磺酸盐例如白消安、英丙舒凡(impiOsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙唳类例如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa ；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺(triethyIenephosphoramide)、乙胺硫磷和三轻甲蜜胺；番蒸枝内酯类(acetogenins)(特别是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone)) ； δ-9-四氢大麻醇(屈大麻酹(Dronabinol XjVlARUNOL. ) ;β-拉帕醌(β-lapachone);拉帕醇(Iapachol)；秋水仙素类；桦木酸；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康(HYCAMTIN )，CPT-Il (依立替康，CAMPTOSAR )，乙酰基喜树碱，莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱；苔藓抑制素；callystatin ;CC_1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesi n)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼白毒素；鬼白酸；替尼泊苷(Teniposide);念珠藻环肽类(cryptophycins)(特别是念珠藻环肽I和念珠藻环肽8);多拉司他汀(dolastatin);倍癌霉素(包括合成的类似物、KW-2189和CB1-TM1);软珊瑚醇；水鬼蕉碱(pancratistatin);葡枝珊瑚醇；海绵抑制素；氮芥例如苯丁酸氣芥，蔡氣芥(Chlornaphazine), cholophosphamide，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥，盐酸氧化氮芥，美法仑，新氮芥(novembichin)、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、尿啼P定氮芥(uracil mustard);亚硝基服类(nitrosureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine);抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素Y I (见例如Agnew，Chem Intl.Ed. Engl. 33:183-186(1994));达内霉素(dynemicin),包括达内霉素A ;埃斯波霉素(esperamicin);以及新抑癌蛋白生色团(neocarzinostatin chromophore)和相关的生色蛋白烯二炔抗生素生色团类)；阿克拉霉素(aclacinomysins)，放线菌素(actinomycin)，authramycin，偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、cactinomycin、卡柔 t匕星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、口誉癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素 D (dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detOTubicin)、6_重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN 多柔比星(包括吗啉代-多柔比星，氰基吗啉代-多柔比星，2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)，表柔比星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马赛罗霉素(marcel Iomycin)、丝裂霉素例如丝裂霉素C，麦考酌■酸(mycophenolicacid)、nogalarnycin、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、P票罗霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，例如，甲氨蝶呤(Methotrexate)和5_氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin),甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);P票呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6_巯票呤、硫咪票呤(thiamiprine)、硫鸟_呤(thioguanine);啼卩定类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(fIoxuridine);雄激素类，例如，卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睾内酉旨(testolactone);抗肾上腺素类(anti-adrenals)，例如，氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充物，例如，亚叶酸(frolinicacid);醋葡醒内酯(aceglatone);醒憐酸胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酸丙酸(aminolevulinic acid);恩尿啼 P定(eniluracil);安卩丫 P定(amsacrine) jbestrabucil;比生群(bisantrene) ; edatraxate; defofamine;秋水仙胺(demecolcine);地口丫酉昆(diaziquone);依氟鸟氨酸(elfornithine);依利醋铵(elliptinium acetate);埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid);硝酸镓；轻基脲；香燕多糖；氯尼达明(Ionidainine);美登木素生物碱，例如美登素和美坦西醇类；米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol) ; 二胺硝 B丫唆(nitraerine);喷司他丁 (pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);卩比柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(Iosoxantrone) ;2_乙基酰肼；丙卡巴餅(procarbazine); PSK 多糖复合物(JHS Natureal Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);利索新(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);错螺胺(spriogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone) ; 2，2’，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素，verracurin A,杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine) (ELDISINE , FILDESIN );达卡巴嚷(DACARBAZINE);甘露莫司汀(mannomustine) ; 二漠甘露醇(mitobronitol) ; 二漠卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烧(pipobroman) ; gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C ");噻替派(thiotepa);紫杉烧类(taxoids)例如 TAXOL· 紫杉醇(Bristol-MyersSquibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANETM Cremophor-free,紫杉醇的白蛋白改造纳·米粒(AmericanPharmaceutical Partners, Schaumberg, IL),和 TAXOTERE 紫杉職(Rhone -Poulenc Rorer, Antony,法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(GEMZAR );6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；钼类似物，例如顺钼和卡钼；长春碱(VELBAN );钼；依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(ONCOVIN );奥沙利钼；亚叶酸(Ieucovovin);长春瑞滨(NAVELrBINE );诺安托(novantrone);依达曲沙(edatrexate);柔红霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类视黄醇例如视黄酸；卡培他滨(XELODA );以上任何物质的药学可接受的盐、酸或衍生物；以及以上两个或多个的组合，例如CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松龙组合疗法的缩写)，和FOLFOX (奥沙利钼(ELOXATINTM)结合5-FU和Ieucovovin的治疗方案的缩写)。该定义还包括抗激素剂，其通过调节、降低、阻碍或抑制能够促进癌生长的激素的效应来起作用，并常为系统性或全身性治疗形式。它们可以自身就是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，包括，例如它莫西芬(包括NOLVADEX 它莫西芬)，EVISTA 雷洛西芬(raloxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基它莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene), keoxifene, LY117018,奥那司丽(onapristone)和FARESTON 托瑞米芬(toremifene);抗孕酮类(anti-progesterones);雌激素受体下调剂(ERDs);起作用而抑制或关闭卵巢的药物，例如黄体生成素释放激素(LHRH)激动剂，例如；LUPRON 和 ELIGARD 醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate),醋酸性瑞林(goserelin acetate),醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(tripterelin);其它抗雄激素类例如氟他米特(fIutamide),尼鲁米特(niIutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide);和抑制芳化酶的芳化酶抑制剂，其调节肾上腺中雌激素的产生，例如4(5)-咪唑类，氨鲁米特，MEGASE 醋酸甲地孕酮，AROMASIN 依西美坦，formestanie,法倔唑(fadrozole), RIVISOR 伏氯唑(vorozole),FEMARA 来曲唑(Ietrozole)和ARIMIDEX 阿纳托挫(anastrozole)。此外，化疗剂的该定义包括二膦酸盐，例如氯屈膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOS 或OSTAC )，DIDROCAL 依替膦酸钠(etidronate)，NE-58095, ZOMETA 唑来勝酸(zoledronic acid/zoledronate) , FOSAMAX 阿仑唑奈(alendronate),AREDIA 帕米膦酸(pamidronate), SKEUD 替鲁膦酸盐(ti Iudronate)或ACTONEL 利塞膦酸盐(risedronate);以及曲沙他滨(troxacitabine) (1，3_ 二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制异常细胞增殖所涉及的信号途径中的基因，例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)，表达的反义寡核苷酸；疫苗例如THERATOPE 疫苗和基因治疗疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗，LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；LURTOTECAN 拓扑异构酶I抑制剂；ABARELIX rmRH ;二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate) (ErbB-2 和 EGFR 双酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016);和以上任何的药学可接受盐、酸或衍生物。当在本文中使用时，“生长抑制剂”指在体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著减少S期细胞的百分比的药剂。生长抑制剂的实例包括(在S期以外的位置)阻碍细胞周期进程的试剂，例如诱导Gl停滞和M-期停滞的 试剂。典型的M-期阻滞剂包括长春花生物碱(例如长春新碱和长春碱)，紫杉烷类和拓扑异构酶II抑制剂例如阿霉素，表柔比星，柔红霉素，依托泊甙和博来霉素。停滞Gl的试剂也可以溢出到S-期停滞，例如DNA烷化剂，例如它莫西芬，泼尼松，达卡巴嗪，氮芥，顺钼，氨甲蝶呤，5-氟尿卩密唳和ara-C。更多信息可见于The MolecularBasis of Cancer中，Mendelsohn 和 Israel 编辑，第 I 章，标题为 〃Cell cycleregulation, oncogenes, andantineoplastic drugs", Murakami 等著(WBSaunders:Philadelphia, 1995),特别是第 13页。紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛)是都源自紫杉树的抗癌药物。来自欧洲紫杉的多西他赛(TAXOTERE , Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇的半合成类似物(TAXCXL ,Bristol-Myers Squibb)。紫杉醇和多西他赛促进自微管蛋白二聚体组装成微管和通过阻止解聚来稳定微管，这导致抑制细胞有丝分裂。本文中使用的“抗癌疗法”指减轻或抑制受试者癌症的治疗。抗癌疗法的实例包括细胞毒性放射疗法以及给受试者施用治疗有效量的细胞毒性剂、化疗剂、生长抑制剂、癌症疫苗、血管发生抑制剂、前体药物、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、免疫抑制剂、镇吐药、抗体或抗体片段、或镇痛剂。本申请中使用的术语“前体药物”指，药学上有效物质的前体或衍生物形式，与母体药物相比，其对肿瘤细胞的毒性较低，能够被酶促激活或被转化为更活跃的母体形式。见例如，Wilman, “Prodrugs in CancerChemotherapy^BiochemicalSociety Transactions, 14,第 375-382 页，615th Meeting Belfast(1986)和 Stella等,“Prodrugs:A Chemical Approachto Targeted Drug Delivery,，，Directed DrugDelivery, Borchardt 等,(ed.),第 247-267 页,Humana Press (1985)。前体药物包括但并不限于，含磷酸盐的前体药物、含硫代磷酸盐的前体药物、含硫酸盐的前体药物、含肽的前体药物、经D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化的前体药物、含β-内酰胺的前体药物、含可选取代的苯氧基乙酰胺的前体药物、或含可选取代的苯乙酰胺的前体药物、可以被转化为更活跃的无细胞毒性药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前体药物。能够被衍生为用于本发明的前体药物形式的细胞毒性药物的例子，包括但不限于上述那些化疗剂。
术语“细胞因子”是由一个细胞群体释放并作为细胞间调节物对另一个细胞起作用的蛋白质的通称。这样的细胞因子的实例有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素例如人生长激素(HGH)、N-甲硫氨酰人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如促滤泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成素(LH);表皮生长因子(EGF);肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子(FGF);催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子α和β ;苗勒抑制物质(mullerian-inhibiting substance);小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO);神经生长因子例如NGF- α ;血小板生长因子；转化生长因子(TG Fs)例如TGF-α和TGF-β ;胰岛素样生长因子I和II ;红细胞生成素(EPO);骨诱导因子；干扰素例如干扰素α、β和γ ;集落刺激因子(CSFs)例如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF);白细胞介素(ILs)例如 IL-UIL-I α、IL-I β、IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7、IL-8, IL-9, IL-10, IL-IUIL-12、IL-18 ;肿瘤坏死因子例如TNF- α或TNF- β ；以及其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。本文中使用的术语细胞因子包括，来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等效物。“细胞因子拮抗剂”意指部分或完全阻断、抑制或中和至少一种细胞因子的生物学活性的分子。例如，细胞因子拮抗剂可以通过抑制细胞因子的表达和/分泌，或通过与细胞因子或细胞因子受体结合，从而抑制细胞因子的活性。细胞因子拮抗剂包括抗体、合成的或天然序列的肽、免疫粘附素、和与细胞因子或细胞因子受体结合的小分子拮抗剂。细胞因子拮抗剂可选地与细胞毒性剂缀合或融合。示例性TNF拮抗剂有依那西普(ENBREL )、英夫利昔单抗(REMICADE )和阿达木单抗(humiratm)。本文中使用的术语“免疫抑制剂”指，起抑制或遮蔽所治疗的受试者的免疫系统的作用的物质。这包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自体抗原表达、或遮蔽MHC抗原的物质。免疫抑制剂的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利号4，665，077)；霉酌·酸酯(mycophenolate mofetil)例如CEI^LCEPT㊣;硫唑嘌呤(azathioprine)(IMURAN 、AZASAN ); 6-疏基嘌呤；溴隐亭(bromocriptine);达那唑(danazol);氨苯砜(dapsone);戍二醒(其遮蔽MHC抗原，如美国专利号4，120，649中所描述)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A (cyclosporin A);类固醇,例如皮质类固醇和糖皮质类固醇，例如泼尼松(prednisone),泼尼松龙(prednisolone),例如PEDIAPRED (泼尼松龙磷酸钠)或ORAPRED (泼尼松龙磷酸钠口服液)，甲基泼尼松龙和地塞米松；甲氨蝶呤(口服或皮下)(RHEUMATREX 、TREXALL )；轻氯喹/氯喹；柳氮磺卩比唳；来氟洛米(Ieflunomide);细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素Y、β或α抗体，抗肿瘤坏死因子α抗体(英夫利昔单抗或阿达木单抗)，抗TNFa免疫粘附素(ENBREL 、依那西普)，抗肿瘤坏死因子β抗体，抗白细胞介素2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-I抗体，包括抗⑶I Ia和抗⑶18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；多克隆或pan-T抗体,或单克隆抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；包含LFA-3结合结构域的可溶性肽(W0 90/08187);链激酶；TGF-β ;链道酶；来自宿主的RNA或DNA;FK506 ;RS_61443 ;脱氧精胍菌素；雷帕霉素^细胞受体(Cohen等，美国专利号 5，114，721) ;T 细胞受体片段(Offner 等· Science 251:430-432(1991) ;W090/11294;Ianeway, Nature 341:482(1989);和 WO 91/01133) ;T 细胞受体抗体(EP340，109)例如Τ10Β9 ;环磷酰胺(CYTOXAN );氨苯砜；青霉胺(CUPRIMINE );血
浆更换；或静脉免疫球蛋白(IVIG)。这些物质可以单独或互相组合使用，特别是类固醇和另一种免疫抑制剂的组合，或在这样的组合后给予维持剂量的非类固醇药，以降低对类固
醇的需要。“镇痛剂”指起抑制或压制受试者疼痛的作用的药物。示例性镇痛剂包括非类固醇抗炎药(NSAIDs),包括布洛芬(MOTRIN ),萘普生(NAPROSYN ),乙酰水杨酸，吲哚美辛，舒林酸(sulindac)和托美汀(tolmetin)，包括它们的盐和衍生物，以及各种用于减轻可能发生的刺痛的其它药物，包括抗惊厥药物(加巴喷丁(gabapentin),苯妥英(phenyloin),酰胺咪嗪(carbamazepine))或三环抗抑郁药。具体实例包括醋氨酹(acetaminophen),阿司匹林(aspirin),阿密曲替林(amitriptyline) (ELAVIL )，酸胺咪嗪(TEGRETOL )，苯妥英(phenyltoin) (DILANTIN ),加巴喷丁(NEURONTIN ), (E)-N-香草基-8-甲基-6-壬烯酰胺(CAPSAICIN )，或神经阻断剂。“皮质类固醇”指几种合成的或天然存在的具有类固醇通用化学结构的物质之任一，其模拟或放大天然存在的皮质类固醇的效应。合成的皮质类固醇的实例包括泼尼松，泼尼松龙(包括甲基泼尼松龙)，地塞米松，曲安西龙(triamcinolone)和倍他米松(betamethasone)。本文中使用的“癌症疫苗”是刺激受试者的抗癌免疫反应的组合物。癌症疫苗的组成典型地是与癌症相关的物质或细胞(抗原)的来源(其对受试者可以是自体的(来自其自身)或同种异体的(来自别人)、以及其它组分(例如免疫佐剂)(以进一步刺激和提升对抗原的免疫反应)。癌症疫苗可以导致刺激受试者的免疫系统，以产生抗一种或几种特定抗原的抗体、和/或产生杀伤T细胞而攻击具有这些抗原的癌细胞。本文中使用的“细胞毒性放射性治疗”指抑制或阻止细胞的功能和/或导致细胞破坏的放射性治疗。放射性治疗可以包括，例如体外射束照射或以放射性标记的试剂例如抗体进行治疗。该术语旨在包括使用放射线同位素(例如At211、I131、I125、Y' Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P32 和 Lu 的放射性同位素)。“受试者”是脊椎动物，例如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于农畜(例如母牛)、运动动物、宠物(例如猫、狗和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。除非上下文另有说明，否则术语“第一”多肽和“第二”多肽及其变体只是通用表述，其不应被理解为标识本发明抗体的具体的或特定的多肽或组分。除非另有说明，按生产商的用法说明使用实施例中提及的商业获取的试剂。在以下实施例中和整个说明书中通过ATCC保藏号标识的细胞来源于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas, VA。除非另有说明，本发明使用重组DNA技术的标准程序，例如上文和以下教科书中描述的程序Sambrook等，同上；Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associatesandffiley Interscience, NY, 1989);Innis 等,PCR Protocols:A Guide toMethods andApplications(Academic Press, Inc. ,NY, 1990);Harlow 等,Antibodies:A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Press, ColdSpring Harbor, 1988);Gait, Oligonucleotide Synthesis(IRL Press, Oxford, 1984);Freshneyj Animal Cell Culture, 1987;Coligan等，Current Protocolsin Immunology，1991。在整个本说明书和权利要求中，表述“包含”或其变体应被理解为暗指包括所述及的整体或整体组，但不排除任何其它整体或整体组。II.异源多聚体蛋白质的构建典型地，本文中描述的异源多聚体蛋白质将包含抗体Fe区的显著部分。然而，在其它方面，重链包含CH1、Ch2和/或Ch3区的仅一部分。异源多聚化区域异源多聚体蛋白质包含异源多聚化区域。为了产生基本上同质的异源二聚体分子群体，异源二聚化区域必须具有形成异源二聚体超过同源二聚体的强烈偏向。尽管本文中 示例的异源多聚体蛋白质使用鼓突入洞技术来促进异源多聚化，但本领域技术人员将明了可以用于本发明的其它异源多聚化区域。鼓突入洞使用鼓突入洞作为生产多特异性抗体的方法在本领域公知。见美国专利号5，731，168，1998 年3 月 24 日授予并转让给 Genentech ；PCT 公布号 W02009089004，2009年7月16日公布，转让给Amgen ;和美国专利公开号20090182127，2009年7月16 日公布，转让给 Novo Nordisk Α/S。也见 Marvin 和 Zhu, Acta PharmacologicaSincia (2005) 26 (6) : 649-658 和 Kontermann (2005) Acta Pharacol. Sin. , 26:1-9。在此提供简单讨论。“突起”指从第一多肽的界面伸出并因此可以置入相邻界面(即第二多肽的界面)中的互补性洞腔中的至少一个氨基酸侧链，该置入使得可以例如稳定异源多聚体化、和由此相对于同源多聚体的形成更利于异源多聚体的形成。突起可以存在于原始界面中或可以通过合成引入(例如，通过改变编码界面的核酸)。通常，对编码第一多肽的界面的核酸进行改变以编码突起。为了达到该目的，以至少一个“输入”氨基酸残基的编码核酸，置换第一多肽界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的编码核酸，所述“输入”氨基酸具有比原始氨基酸残基大的侧链体积。应理解的是，可以有一个以上的原始和对应输入残基。可以被置换的原始残基的数量的上限是第一多肽界面中残基的总数。各种氨基酸的侧链体积显示于下表中。表I、氨基酸残基的特性
SII单字母缩写|MASSa (道尔顿) I体积b(埃3)I可及表面积°(埃2)
丙氨酸(Ala) A71.0888 6Τ 5
精氨酸(Arg) R156.20173.4225
天冬酰胺(Asn)~N114. 11117. 7160
天冬氨酸(Asp)~ D115. 09111. I150
权利要求
1.制备异源多聚体蛋白质的方法，所述异源多聚体蛋白质包含具有第一异源二聚化区域的第一含铰链的多肽、和具有第二异源二聚化区域的第二含铰链的多肽，其中第二异源二聚化区域与第一异源二聚化区域相互作用，且其中第一和第二含铰链的多肽通过至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤 (a)培养包含编码第一含铰链的多肽的第一核酸的第一宿主细胞，其中在表达该含铰链的多肽的条件下进行该培养； (b)培养包含编码第二含铰链的多肽的核酸的第二宿主细胞，其中在表达该含铰链的多肽的条件下进行该培养； (C)破坏第一和第二宿主细胞的细胞膜，其中第一和第二宿主细胞已在单个悬浮液中组合在一起；和 (d)回收异源多聚体蛋白质， 其中所述方法不需要添加还原剂。
2.制备异源多聚体蛋白质的方法，所述异源多聚体蛋白质包含具有第一异源二聚化区域的第一含铰链的多肽、和具有第二异源二聚化区域的第二含铰链的多肽，其中第二异源二聚化区域与第一异源二聚化区域相互作用，且其中第一和第二含铰链的多肽通过至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤 (a)提供纯化的具有第一异源二聚化区域的第一含铰链的多肽； (b)提供纯化的具有第二异源二聚化区域的第二含铰链的多肽； (C)将第一和第二含铰链的多肽组合； (d)在体外在允许该分离的第一含铰链的多肽与第二含铰链的多肽多聚化的条件下，使第一含铰链的多肽与第二含铰链的多肽重折叠；和 (e)回收异源多聚体蛋白质复合物。
3.权利要求I或2的方法，其中第一异源二聚化区域和第二异源二聚化区域在界面相遇，第二异源二聚化区域的界面部分包含突起，所述突起可置入第一异源二聚化区域的界面部分中的腔洞中。
4.权利要求I或2的方法，其中第二异源二聚化区域是包含突起的Fe多肽或第一异源二聚化区域是包含腔洞的Fe多肽，或同时两者。
5.权利要求I或2的方法，其中第一Fe多肽和第二 Fe多肽在界面相遇，其中第二 Fe多肽的界面包含突起，所述突起可置入第一 Fe多肽的界面中的腔洞中，其中该腔洞或突起或两者是之前已经被引入到第一和第二 Fe多肽的界面中的。
6.权利要求I或2的方法，其中第一异源二聚化区域和第二异源二聚化区域包含亮氨酸拉链。
7.权利要求I或2的方法，其中第一异源二聚化区域和第二异源二聚化区域包含卷曲螺旋。
8.权利要求I或2的方法，其中链间二硫键位于抗体的铰链区。
9.权利要求I或2的方法，其中所述链间二硫键位于铰链区之间。
10.权利要求I或2的方法，其中所述二硫键是分子间的。
11.权利要求I或2的方法，其中所述分子间二硫键位于两个包含免疫球蛋白铰链的多肽链的半胱氨酸之间。
12.权利要求I或2的方法，其中含铰链的多肽包含Ch结构域或其变体。
13.权利要求I或2的方法，其中含铰链的多肽包含Fe区或其变体。
14.权利要求I或2的方法，其中第一含铰链的多肽是抗体重链。
15.权利要求I或2的方法，其中第二含铰链的多肽是抗体重链。
16.权利要求I或2的方法，其中第一含铰链的多肽是与抗体轻链配对的抗体重链。
17.权利要求I或2的方法，其中第二含铰链的多肽是与抗体轻链配对的抗体重链。
18.权利要求16或17的方法，其中含铰链的多肽与抗体轻链多肽配对形成靶标结合臂。
19.权利要求I或2的方法，其中含铰链的多肽包含人Ch2和/或Ch3结构域的至少一部分。
20.权利要求I或2的方法，其中一对含铰链的多肽和轻链多肽是人源化的，或者两对均是人源化的。
21.权利要求I的方法，其中含铰链的多肽和轻链多肽在分开的表达质粒上编码。
22.权利要求I的方法，其中含铰链的多肽和轻链多肽在相同的表达质粒上编码。
23.权利要求I的方法，其中宿主细胞选自原核细胞、真核细胞、哺乳动物细胞和植物细胞。
24.权利要求I的方法,其中宿主细胞是原核细胞。
25.权利要求24的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
26.权利要求25的方法，其中所述大肠杆菌细胞是Ipp缺陷型。
27.权利要求I的方法，其中宿主细胞是哺乳动物细胞。
28.权利要求27的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
29.权利要求I的方法，其中第一宿主细胞和第二宿主细胞在分开的细胞培养物中。
30.权利要求I的方法，其中步骤(a)和(b)的细胞在包含这两种宿主细胞的混合培养物 中。
31.权利要求29的方法，其中在破坏细胞膜之前，将步骤(a)和(b)的细胞混合、离心和重悬浮于缓冲液中。
32.权利要求29的方法，其中，将步骤(a)和(b)的细胞离心和重悬浮于缓冲液中，然后组合，之后破坏细胞膜。
33.权利要求I的方法，其中破坏细胞膜选自对细胞膜进行通透化和使细胞膜解体。
34.权利要求I的方法，其中破坏细胞膜选自细胞裂解、超声、渗压震扰、通过微流化器、加入EDTA、各种洗涤剂、溶剂(例如甲苯、二甲基亚砜等)、表面活性剂(例如Triton-X100、吐温20等)、低渗缓冲液、使用冻/融技术、电穿孔、和通过不锈钢球匀浆器。
35.权利要求I或2的方法，其中回收步骤还包括至少一个纯化步骤。
36.权利要求I或2的方法，还包括步骤 (a)在包含蛋白A的柱上捕获所述抗体， (b)从所述柱上洗脱所述抗体，和 (C)将所述洗脱的抗体稀释到包含离液剂或温和洗涤剂的溶液中。
37.权利要求I或2的方法，其中异源多聚体蛋白质选自抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、单臂抗体、多特异性单价抗体、双特异性maxibody、monobody、免疫粘附素、肽体、双特异性肽体、单价肽体和亲和体。
38.权利要求37的方法，其中异源多聚体蛋白质是抗体。
39.权利要求37的方法，其中异源多聚体蛋白质是双特异性抗体。
40.权利要求37的方法，其中异源多聚体蛋白质是多特异性抗体。
41.权利要求37的方法，其中异源多聚体蛋白质是单臂抗体。
42.权利要求37的方法，其中所述抗体包含重链恒定区和轻链恒定区。
43.权利要求37的方法，其中所述抗体是人源化的。
44.权利要求37的方法，其中所述抗体是全长抗体。
45.权利要求44的方法，其中所述全长抗体包含重链和轻链。
46.权利要求16或17的方法，其中重链和轻链多肽之一或两者是人的。
47.权利要求37的方法，其中所述抗体是人的。
48.权利要求37的方法，其中抗体是包含人Ch2和/或Ch3结构域的至少一部分的抗体片段。
49.权利要求48的方法，其中所述抗体片段是Fe融合多肽。
50.权利要求37的方法，其中抗体选自IgG、IgA和IgD。
51.权利要求50的方法，其中抗体是IgG。
52.权利要求51的方法，其中抗体是IgGl。
53.权利要求51的方法，其中抗体是IgG2。
54.权利要求37的方法，其中抗体是治疗性抗体。
55.权利要求37的方法，其中抗体是激动剂抗体。
56.权利要求37的方法，其中抗体是拮抗剂抗体。
57.权利要求37的方法，其中抗体是诊断性抗体。
58.权利要求37的方法，其中抗体是封闭抗体。
59.权利要求37的方法，其中抗体是中和抗体。
60.权利要求37的方法，其中抗体能够与肿瘤抗原结合。
61.权利要求60的方法，其中肿瘤抗原不是细胞表面分子。
62.权利要求60的方法，其中肿瘤抗原不是分化群因子。
63.权利要求37的方法，其中抗体能够与分化群因子结合。
64.权利要求37的方法，其中抗体能够与细胞存活调节因子结合。
65.权利要求37的方法，其中抗体能够与细胞增殖调节因子特异性结合。
66.权利要求37的方法，其中抗体能够与和组织发育或分化相关的分子结合。
67.权利要求37的方法，其中抗体能够与细胞表面分子结合。
68.权利要求37的方法，其中抗体能够与淋巴因子结合。
69.权利要求37的方法，其中第一对和第二对的轻链包含不同的可变区序列。
70.权利要求37的方法，其中多肽的至少45%形成所述双特异性抗体。
71.权利要求39的方法，其中所述双特异性抗体能够特异性结合两个靶标分子。
72.权利要求71的方法，其中第一臂特异性结合第一靶标分子，第二臂特异性结合第二革El标分子。
73.权利要求I或2的方法，其中多肽的至少45%存在于复合物中，所述复合物包含第一含铰链的多肽和轻链对以及第二含铰链的多肽和轻链对。
74.权利要求I或2的方法，其中在纯化抗体的步骤之前，分离的多肽中不超过10%以单体或同源二聚体存在。
75.权利要求71的方法，其中第一对和第二对的轻链包含不同的可变区序列。
76.权利要求71的方法，其中第一和第二重链-轻链对各包含通过二硫键互相连接的重链和轻链。
77.权利要求71的方法，其中第一对和第二对之间的pi值差异为至少O.5。
78.通过权利要求1-2之任一生产的异源多聚体蛋白质。
79.权利要求78的异源多聚体蛋白质，其中异源多聚体蛋白质是多特异性抗体。
80.权利要求78的异源多聚体蛋白质，其中异源多聚体蛋白质能够结合至少2个靶标分子。
81.权利要求78的异源多聚体蛋白质，其中异源多聚体蛋白质是能够结合相同抗原上的至少2个表位的抗体。
82.根据权利要求I或2的方法生产的双特异性抗体。
83.包含第一对重链和轻链多肽以及第二对重链和轻链多肽的双特异性抗体，其中所述轻链多肽包含不同的可变区序列。
84.包含权利要求78的异源多聚体蛋白质及载体的组合物。
85.包含至少10%的权利要求78的异源多聚体蛋白质的组合物。
86.包含根据权利要求78的异源多聚体蛋白质的药物组合物。
87.产生异源多聚体蛋白质组合文库的方法，其中所述异源多聚体蛋白质包含具有第一异源二聚化区域的第一含铰链的多肽、和包含具有第二异源二聚化区域的第二含铰链的多肽，其中第二异源二聚化区域与第一异源二聚化区域相互作用，其中第一和第二含铰链的多肽通过至少一个链间二硫键连接，所述方法包括步骤 (a)培养第一宿主细胞和至少两种另外的宿主细胞,其中 i.所述第一宿主细胞包含第一核酸，所述核酸编码包含第一异源二聚化区域的多肽；和 .所述另外的宿主细胞包含核酸，所述核酸编码包含第二异源二聚化区域的多肽， (b)破坏第一宿主细胞和至少两种另外的宿主细胞的细胞膜，以使包含第一和第二异源二聚化区域的多肽释放到细胞外环境中，其中该第一宿主细胞和至少两种另外的宿主细胞已经在单个悬浮液中组合在一起；和 (c)回收异源多聚体蛋白质， 其中所述方法不需要添加还原剂。
88.权利要求I或2的方法，其中第一含铰链的多肽与抗体轻链多肽配对形成第一靶标结合臂，第二含铰链的多肽与抗体轻链多肽配对形成第二靶标结合臂。
89.权利要求88的方法，其中每一个或两个结合臂能够结合一个以上的靶标。
全文摘要
本申请描述用于高效生产能够特异性结合多个靶标的抗体和其它多聚体蛋白质复合物(在本文中统称为异源多聚体蛋白质)的方法。所述靶标可以是例如单个分子上的不同表位或位于不同分子上。该方法将异源多聚体蛋白质的高效高基因表达水平、正确组装和易于纯化组合在一起。本发明还提供使用这些异源多聚体蛋白质的方法，和包含这些抗体的组合物、套盒和制品。
文档编号C07K16/46GK102946906SQ201180031150
公开日2013年2月27日 申请日期2011年4月22日 优先权日2010年4月23日
发明者J·舍尔, C·斯皮斯, D·G·延苏拉 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司