多肽的制作方法

专利名称：多肽的制作方法
技术领域：
本披露涉及对白蛋白具有结合亲和力的一类工程化多肽。本披露还涉及利用这些和其他化合物与白蛋白在不背景下结合的新的方法和用途，其中一些对于治疗包括人类的哺乳动物中的疾病具有重要性。
背景技术：
血清白蛋白 血清白蛋白是哺乳动物血清中最丰富的蛋白质(40g/l ;在人类中大约为O. 7mM),并且它的功能之一是结合多种分子，如脂质和胆红素(彼得斯(Peters)，《蛋白质化学进展》(Advances in Protein Chemistry) 37:161，1985)。血清白蛋白无任何酶或免疫功能。此外，人血清白蛋白(HSA)是在许多天然以及治疗性分子的内源性运输和递送中所涉及的一种天然载体(塞勒斯(Sellers)和科赫韦泽(Koch-Weser)，《白蛋白结构、功能以及用途》(AlbuminSructure, Function and Uses),编者罗森诺(Rosenoer)等人，培格曼(Pergamon),牛津(Oxford),第159页，1977)。血清白蛋白的半衰期与动物的大小成正t匕，其中例如人血清白蛋白具有19天的半衰期，而兔血清白蛋白具有大约5天的半衰期(麦柯迪(McCurdy)等人，《实验和临床医学杂志》(J Lab Clin Med) 143:115，2004)。HSA广泛分布于身体各处，尤其在间质和血液隔室中，其中HSA主要与维持克分子渗透压浓度有关。在结构上，白蛋白是包含三个同源结构域以及总共584或585个氨基酸的单链蛋白质(Dugaiczyk等人，《美国国家科学院院刊》(ProcNatl Acad Sci USA)79:71，1982)。白蛋白包含17个二硫键以及单个反应性巯基、位置34上的半胱氨酸，但缺乏N连接以及O连接的碳水化合物部分(彼得斯，1985，同前文献；尼克尔森(Nicholson)等人，《英国麻醉学杂志》(Br J Anaesth) 85:599，2000)。与HSA融合或缔合导致蛋白质的体内半衰期增加已经报道了使蛋白质与血清白蛋白抑或将允许与血清白蛋白的体内缔合的肽或蛋白质直接共价偶联的若干策略。后一方法的实例已经描述于例如W091/01743、W001/45746以及丹尼斯(Dennis)等人(《生物化学杂志》(J Biol Chem)277:35035-43，2002)中。第一个文献尤其描述了从链球菌蛋白G (SpG)衍生的白蛋白结合肽或蛋白质用于增加其他蛋白质的半衰期的用途。这种观念在于，使细菌衍生的白蛋白结合肽/蛋白质与一种治疗上感兴趣的肽/蛋白质融合，这种肽/蛋白质已经显示出具有从血液中的快速消除。因此产生的融合蛋白与血清白蛋白在体内结合，并且受益于其更长的半衰期，增加了融合的在治疗上感兴趣的肽/蛋白质的净半衰期。W001/45746和丹尼斯等人涉及同一概念，但在此，诸位作者利用相对较短的肽来结合血清白蛋白。这些肽选自一个噬菌体展示肽库。在丹尼斯等人的文献中，提及了早期研究中发现对链球菌蛋白G的白蛋白结合域与人补体受体I型的重组融合物的免疫应答的增强。作为US2004/0001827公开的美国专利申请(丹尼斯)还披露了包含肽配体的构建体的用途，这些构建体同样通过噬菌体展示技术鉴定，其与血清白蛋白结合并且与生物活性化合物结合用于肿瘤靶向。细菌受体蛋白的白蛋白结合域
链球菌蛋白G (SpG)是一种双功能受体，它存在于某些链球菌菌株的表面上，并且能够与IgG和血清白蛋白两者结合(布约克(Bj(Irck)等人，《分子免疫学》(Mol Immunol)24:1113, 1987)。其结构以若干结构上和功能上不同的结构域高度重复(格斯(Guss)等人，欧洲分子生物学杂志(EMBO J) 5:1567，1986)，更准确地说以三个Ig结合域和三个血清白蛋白结合域高度重复(奥尔松(Olsson)等人，《欧洲生物化学杂志》(EurJ Biochem)168:319,1987)。已经测定SpG中的三个血清白蛋白结合域之一的结构，显示为一种三螺旋束折叠(Kraulis等人，《欧洲生物化学学会联盟通讯》(FEBS Lett)378:190, 1996 ;约翰松(Johansson)等人，《生物化学杂志》(J. Biol. Chem. ) 277:8114-20，2002)。一个含 46个氨基酸的基序被定义为ABD (白蛋白结合域)并且后来也被命名为G148-GA3 (关于蛋白G相关性白蛋白结合的GA)。在例 如W009/016043中，披露了该含46个氨基酸的基序ABD的白蛋白结合变体。除了蛋白G中的白蛋白结合域之外也已经鉴定了其他细菌白蛋白结合域，其中一些在结构上与蛋白G的白蛋白结合域相似。含有这样的白蛋白结合域的蛋白质的实例是PAB、PPL、MAG以及ZAG蛋白(罗扎克(Rozak)等人，《生物化学》(Biochemistry)45:3263-3271,2006)。已经例如由约翰松和同事进行了这样的白蛋白结合域的结构和功能的研究并且加以报道(约翰松等人，《分子生物学杂志》(J Mol Biol)266:859-865, 1997)。此外，罗扎克等人已经报道了 G148-GA3的人工变异体的产生，这些人工变异体是就不同的种特异性和稳定性而加以选择并且研究的(罗扎克等人，《生物化学》，45:3263-3271，2006 )，而约翰松等人研发了对于人血清白蛋白的亲和力有很大提高的G148-GA3的人工变异体(约翰松等人，《蛋白质工程设计与选择》(Prot Eng Des Sel)21:515-27, 2008)。对于一些变异体来说，获得一种更高的亲和力是以热稳定性降低为代价的。除了上述含有三螺旋结构的蛋白质之外，还存在着其他的结合白蛋白的无关细菌蛋白。ABD和免疫作用最近，以实验的方式鉴定出在链球菌蛋白G菌株148 (G148)的白蛋白结合区内的少数T细胞和B细胞表位(戈奇(Goetsch)等人，《临床诊断实验室免疫学》(Clin DiagnLab Immunol) 10:125-32，2003)。这项研究背后的诸位作者的兴趣在于，利用在疫苗中的G148的T细胞表位，S卩，利用白蛋白结合区的固有免疫刺激特性。另外，戈奇等人在G148的序列中发现一个B细胞表位，即，被在免疫之后的抗体结合的一个区域。在用于人类给药的药物组合物中，免疫应答是所不希望的。因此，由于其上述免疫刺激特性，白蛋白结合域G148本身不适合用于这样的组合物中。说明书在一个第一个方面，通过一种白蛋白结合多肽克服或减轻了现有技术的以上缺点和不足，这种白蛋白结合多肽包含选自以下的一个氨基酸序列i) LAX3AKX6X7AnX10 EldX14YGVSdf YKRLIXffiKAKTVEGVEALKX39X4(lILX43X44LP，其中彼此独立地，X3 选自 E、S、Q 以及 C ;X6 选自 E、S 以及 C ;
X7 选自 A 和 S ;X1。选自 A、S 以及 R ;X14 选自 A、S、C 以及 K ;X26 选自 D 和 E ;X39 选自 D 和 E ;X40 选自 A 和 E ;X43 选自 A 和 K ;X44 选自 A、S 以及 E ； 位置45处的L存在或不存在；并且位置46处的P存在或不存在；以及ii)与i)中所定义的序列具有至少95% —致性的一个氨基酸序列。以上所定义的对于白蛋白具有结合亲和力的序列相关多肽的类别是衍生自一种共同亲本多肽序列，这种共同亲本多肽序列折叠成一个三α螺旋束结构域。更确切地说，如上文所描述的这些多肽衍生自一种模型建立，这种模型建立是基于血清白蛋白与白蛋白结合域G148-GA3之间的一种复合物的结构(莱永(Lejon)等人，《生物化学杂志》279:42924-8, 2004)，以及对共同亲本多肽序列的许多突变变异体的结合和结构特性的分析。以上所定义的氨基酸序列i)与亲本多肽序列相比包含氨基酸置换，这导致预期折叠成一种几乎完全相同的三螺旋束结构域的一类多肽。同时该亲本多肽序列已经包含用于与白蛋白相互作用的一个结合表面，该结合表面是通过根据以上定义的一些置换而被修饰的。根据以上定义的置换提供了相比于亲本多肽序列的改进的白蛋白结合能力。根据本披露的第一个方面的白蛋白结合多肽展现出一组特征，这组特征例如，使这些白蛋白结合多肽适合用作用于人类给药的治疗性分子的融合或结合伴侣。例如，与相关白蛋白结合多肽(如白蛋白结合域G148-GA3以及披露于W009/016043中的白蛋白结合多肽)相比较，根据本披露的白蛋白结合多肽展示以下六个特征中的至少五个与例如G148-GA3和其他细菌衍生的白蛋白结合域比较，这些多肽展示不同的表面。该差异可以降低或消除已经暴露于这样的细菌蛋白的受试者(如一个人)体内的抗体反应的任何风险。这些多肽与例如G148-GA3和多种其他相关但不同的常见亲本多肽序列的突变变异体相比包含更少的潜在T细胞表位，并且因此当向一个受试者(如一个人)给予时展示低免疫原性。当给予受试者(如一个人)时，这些多肽展示出更低的与循环抗体的反应性。因此，如在人类血清的一个试验装置中所测量的，通过在暴露于循环抗体的这些多肽的表面中(即，在不涉及与白蛋白的结合相互作用的多肽表面中)的氨基酸置换，相比于例如由G148-GA3引起的抗体交叉反应性，抗体交叉反应性被降低了。与例如已知天然存在的白蛋白结合多肽(如衍生自细菌蛋白的白蛋白结合域)相t匕，就更高的结合亲和力(如通过Kd值所定义的)来说，以及就更慢的解离率(如通过I^ff值所定义的)来说，这些多肽具有高的白蛋白结合能力。与例如已知天然存在的白蛋白结合多肽(如衍生自细菌蛋白的白蛋白结合域)相t匕，这些多肽包含更少的与多肽的稳定性问题相关的氨基酸残基。因此，这些多肽不包含例如易于氧化的甲硫氨酸或色氨酸并且仅包含一个天冬酰胺。与前述白蛋白结合多肽(如在W009/016043中所披露的)相比，这些多肽具有更高的结构稳定性(如通过55° C以上的熔点所定义的)。在一个实施方案中，根据第一个方面的白蛋白结合多肽展示所有以上列出的六个特征。在另一个实施方案中，当与白蛋白结合时，与例如前述白蛋白结合多肽(如在W009/016043中所披露的)比较，根据第一个方面的白蛋白结合多肽展示更亲水的特征。当白蛋白结合多肽与白蛋白相互作用时，该多肽暴露于环境的表面包含更少的赋予表面疏水性的氨基酸残基。如熟练的人员将认识到的，任何多肽的功能(如根据第一个方面的多肽的白蛋白 结合容量)取决于该多肽的三级结构。然而，有可能在不影响α螺旋多肽的结构的情况下改变其氨基酸序列(达维娜(Taverna)和戈德斯坦(Goldstein)，《分子生物学杂志》315(3) :479-84, 2002 ;何(抱)等人，《美国国家科学院院刊》105 (38) : 14412-17，2008)。因此，i)的修饰变异体(这些变异体使得产生的序列与属于由i)所定义的类别的一个序列至少95%—致)也被该第一个方面所涵盖。例如，有可能的是，属于氨基酸残基的某一官能团(例如疏水性、亲水性、极性官能团，等等)的一个氨基酸残基可以取代为来自相同官能团的另一个氣基酸残基。如在本说明书和权利要求书中所使用的，术语“ 一致性百分比(％identitical*%identity)”是如下计算的。使用CLUSTAL W算法将查询序列与目标序列进行比对(汤普森，J. D. (Thompson, J. D.)，希金斯，D. G. (Higgins, D. G.)以及吉布森，T. J. (Gibson, T.J.),《核酸研究》(Nucleic Acids Research)，22:4673-4680 (1994))。在与比对序列中的最短序列相应的窗口上进行比较。比对序列中的最短序列在一些情况下可以是目标序列，如在此所披露的白蛋白结合多肽。在其他情况下，查询序列可以构成比对序列中的最短序列。查询序列可以例如由至少10个氨基酸残基，如至少20个氨基酸残基，如至少30个氨基酸残基，如至少40个氨基酸残基，例如45个氨基酸残基组成。比较在各位置的氨基酸残基，并且将查询序列中具有目标序列中的相同一致性的位置的百分比报告为一致性百分比。在根据第一个方面的白蛋白结合多肽的一个实施方案中，X6是E。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X3是S。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X3是E。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X7是A。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X14是S。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X14是C。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，Xltl是A。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，Xltl是S。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X26是D。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X26是E。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X39是D。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X39是E。
在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X4tl是A。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X43是A。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X44是A。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，X44是S。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，在位置45处存在L残基。在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，在位置46处存在P残 基。 在根据这个方面的白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，在位置46处不存在P残基。在另一个实施方案中，根据这个方面的白蛋白结合多肽的限制条件为X7既不是L、E，也不是D。可以制备根据第一个方面的白蛋白结合多肽，以便通过用例如一个半胱氨酸或一个赖氨酸置换表面暴露的氨基酸残基而与一种适合的结合伴侣相结合。这些置换可以引入到该多肽的N末端螺旋(即螺旋一)中，螺旋一为当白蛋白结合多肽与血清白蛋白结合时位于离该血清白蛋白最远的螺旋。因此，可以使用i)中所定义的序列的位置X14处的一个赖氨酸残基来实现定点结合。此外，当通过化学肽合成来制造该分子时，这可能是有利的，因为可以利用所述赖氨酸的ε-氨基的正交保护。此外，可以将一个半胱氨酸残基引入到氨基酸序列中以实现定点结合。例如，可以将半胱氨酸残基引入到符合以上定义的位置χ3、χ6和/或X14中的任何一处。一个结合伴侣与一个赖氨酸的ε胺或一个半胱氨酸的硫基偶联代表两种化学上不同的替代方案，从而使用氨基酸序列i)内的一个氨基酸残基获得定点结合。如熟练的人员所理解的，存在着制备用于结合的一个氨基酸序列的其他化学替代方案，并且这些方案本身也在本披露的范围内。这样的化学方法的一个实例是点击样化学反应(click-likechemistry),如由班(Ban)等人提出的通过引入一个酪氨酸来实现的(《美国化学会志》(JAmChem Soc) 132:1523-5，2009)。如在本说明书中所使用的，术语“白蛋白结合”和“对白蛋白的结合亲和力”是指一个多肽的一种特性，这种特性可以例如通过使用表面等离子共振技术(如在Biacore仪器中)来测试。例如，如在以下实例中所述的，可以在一个实验中测试白蛋白结合亲和力，其中白蛋白或其一个片段被固定在该仪器的一个传感器芯片上，并且使含有将要被测试的多肽的样品在该芯片上方经过。可替代地，将要被测试的多肽被固定在该仪器的一个传感器芯片上，并且使含有白蛋白或其一个片段的一个样品在该芯片上方经过。在这点上，白蛋白可以是来自一个哺乳动物的血清白蛋白，如人血清白蛋白。然后，熟练的人员可以解释通过这样的实验所获得的结果来建立该多肽对于白蛋白的结合亲和力的至少一个定性量度。如果一个定量量度是所希望的，例如用来确定针对相互作用的一个Kd值，还可以使用表面等离子共振法。例如,可以在Biacore2000仪器(通用电气医疗集团(GEHealthcare))中确定结合值。将白蛋白适当地固定在该测量仪器的一个传感器芯片上，并且通过连续稀释来制备有待测定亲和力的多肽的样品并且将其注入。然后，可以根据由使用例如由仪器制造商(通用电气医疗集团)提供的BIA评估4.1软件的1:1兰米尔结合模型(Langmuirbindingmodel)的结果来计算Kd值。在一个实施方案中，根据这个方面的白蛋白结合多肽与白蛋白结合，使得该相互作用的Iw值为至多δΧΙΟ 如至多5 X KT6s'如上文所描述的，如由氨基酸序列i)所定义的白蛋白结合多肽衍生自折叠成一个三α螺旋束结构域的一种共同亲本多肽序列。在一个实施方案中，这种亲本多肽序列的三螺旋结构域形成来自链球菌(Streptococcus)菌株G148的蛋白G的一部分,尤其结构域GA3。在另一个实施方案中，白蛋白结合多肽的氨基酸序列是选自SEQ IDN0:1_144以及·SEQ ID NO: 164-203中的任何一个，如选自SEQ IDNO: 1-144中的任何一个。更确切地说，该氨基酸序列是选自 SEQ IDNO:4-5,SEQ ID NO:7-8,SEQ ID NO: 10-1KSEQ ID NO: 13-14,SEQIDN0:16-17、SEQ ID NO:19-20、SEQ ID NO:22-23、SEQ ID NO:25-26、SEQID NO:28-29、SEQID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42, SEQ ID NO:49-50,SEQ ID NO: 164-170 以及SEQ IDN0:192-203。因此，该氨基酸序列可以选自 SEQ ID NO:4-5,SEQ IDNO:7-8, SEQ ID NO:10-11、SEQ ID NO:13-14、SEQ ID NO:16-17、SEQ IDN0:19-20、SEQ ID NO:22-23、SEQ ID NO:25-26、SEQ ID NO:28-29、SEQID NO:31-32、SEQ ID NO:34-35、SEQ ID NO: 37-38、SEQ ID NO:41-42 以及 SEQ ID NO:49-50。在一个实施方案中，根据这个方面的白蛋白结合多肽进一步包含位于i)中所定义的序列的N末端和/或C末端的一个或多个另外的氨基酸残基。这些另外的氨基酸残基可以在增强多肽对白蛋白的结合以及改进折叠的白蛋白结合域的构象稳定性方面发挥作用，但同样可以良好地用于其他目的，例如有关于该多肽的生产、纯化、体内或体外稳定化、偶联、标记或检测中的一者或多者，以及其任何组合。这样的另外的氨基酸残基可以包含为化学偶联目的而添加的一个或多个氨基酸残基，例如添加到色谱树脂中以获得一种亲和基质，或添加到一个螯合部分中以便与一种射电金属络合。因此，在一个实施方案中，直接在氨基酸序列i)的N末端或C末端的α螺旋之前或之后的氨基酸可能影响构象稳定性。可以促使改进构象稳定性的一个氨基酸残基的一个实例为位于如上文所定义的氨基酸序列i)的N末端的一个丝氨酸残基。在一些情况下，该N末端丝氨酸残基可以通过涉及在丝氨酸侧链的Y氧与谷氨酸残基的多肽主链NH之间的氢键键合来形成一种标准S-X-X-E封端盒。这种N末端封端可以促进构成根据本披露第一个方面的白蛋白结合多肽的三螺旋结构域的第一 α螺旋的稳定化。因此，在一个实施方案中，这些另外的氨基酸包含在多肽的N末端的至少一个丝氨酸残基。换句话说，该氨基酸序列前面是一个或多个丝氨酸残基。在白蛋白结合多肽的另一个实施方案中，这些另外的氨基酸包含在该多肽的N末端的一个甘氨酸残基。应当理解的是，氨基酸序列i)前面可以是一个、两个、三个、四个或任何适合数目的氨基酸残基。因此，该氨基酸序列的前面可以是单个丝氨酸残基、单个甘氨酸残基或这两者的组合(如一个甘氨酸-丝氨酸(GS)组合或一个甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸(GSS)组合)。包含在N末端的另外的氨基残基的白蛋白结合多肽的实例展示于SEQ ID NO: 145-163(如SEQ ID NO: 145-148以及SEQ ID NO: 162-163)中。在又另一个实施方案中，这些另外的氨基酸残基在如由序列i)所定义的多肽的N末端包含一个谷氨酸。同样，可以利用C末端封端来改进构成白蛋白结合多肽的三螺旋结构域的第三α螺旋的稳定性。当存在于i)中所定义的氨基酸序列的C末端时，一个脯氨酸残基可以至少部分地作为一个封端残基起作用。在这种情况下，在C末端的脯氨酸残基之后的一个赖氨酸残基可以促使白蛋白结合多肽的第三螺旋进一步稳定化，这是通过赖氨酸残基的ε氨基与位于多肽主链中的赖氨酸之前两个和三个残基处的氨基酸的羰基(例如当L45与Ρ46两者都存在时，在i)中所定义的氨基酸序列的亮氨酸和丙氨酸残基的羰基)之间的氢键键合来实现的。因此，在一个实施方案中，这些另外的氨基酸包含在该多肽的C末端的一个赖氨酸残基。如上文所论述的，这些另外的氨基酸可能与该白蛋白结合多肽的生产有关。具体来说，当根据其中存在P46的一个实施方案的白蛋白结合多肽是通过化学肽合成来生产时，在C末端脯氨酸之后的一个或多个 任选的氨基酸残基可以提供多种优点。这样的另外的氨基酸残基可以例如防止形成所不希望的物质，如在合成的二肽阶段的二酮哌嗪。这样的氨基酸残基的一个实例是甘氨酸。因此，在一个实施方案中，这些另外的氨基酸包含在该多肽的C末端的一个甘氨酸残基，如上文所考虑的，这个甘氨酸残基直接在脯氨酸残基之后，或在一个另外的赖氨酸和/或甘氨酸残基之后。可替代地，多肽生产可以受益于氨基酸序列i)的C末端脯氨酸残基(当存在时)的酰胺化。在这种情况下，C末端脯氨酸包含在羧基碳处的一个另外的胺基。在此处所述的多肽(特别是那些在C末端处以脯氨酸或已知在肽合成过程中用来外消旋的其他氨基酸终止的多肽)的一个实施方案中，以上提及的向C末端添加一个甘氨酸或使脯氨酸(当存在时)酰胺化也可以对抗C末端氨基酸残基的外消旋化的潜在问题。如果以此方式酰胺化的多肽预期通过重组手段而不是通过化学合成来生产，可以通过本领域中已知的若干方法(例如通过使用酰胺化PAM酶)来进行C末端氨基酸的酰胺化。在C末端包含多个另外的氨基酸残基的多种白蛋白结合多肽的多项实例展示于SEQ ID NO: 145-152，如SEQ ID N0:148_150中。熟练的人员知晓用于完成C末端修饰的多种方法，例如通过不同类型的用于肽合成的预制基质。在另一个实施方案中，这些另外的氨基酸残基包含在该多肽的N末端和/或C末端的一个半胱氨酸残基。这样的半胱氨酸残基可以直接在如i)中所定义的氨基酸序列之前和/或之后或可以在如上文所描述的任何其他另外的氨基酸残基之前和/或之后。包含在该多肽链的N末端和/或C末端的一个半胱氨酸残基的白蛋白结合多肽的实例展示于SEQ ID NO: 149-150 (C末端)和SEQ ID NO: 151-152 (N末端)中。通过向该多肽链中添加半胱氨酸残基，可以获得用于定点结合白蛋白结合多肽的硫基。可替代地，可以用与引入一个半胱氨酸残基类似的一种方式将一个硒半胱氨酸残基引入到该多肽链的C末端，以有助于位点特异性结合(程(Cheng)等人，《自然实验手册》(Nat Prot) 1: 2，2006)。在一个实施方案中，该白蛋白结合多肽包含不超过两个半胱氨酸残基。在另一个实施方案中，该白蛋白结合多肽包含不超过一个半胱氨酸残基。在另一个实施方案中，该白蛋白结合多肽的另外的氨基酸残基包含用于该多肽的纯化或检测的一个“标签”，如一个六聚组氨酰基(His6)标签，或一个“myc”(“c_Myc”)标签或一个“FLAG”标签，这种标签可以与对该标签具有特异性的抗体相互作用和/或待用于纯化。熟练的人员知晓其他的替代方案。在又另一个实施方案中，根据这个方面的白蛋白结合多肽与人血清白蛋白结合。在其他实施方案中，白蛋白结合多肽与来自除了人类之外的其他种类的白蛋白(如来自小鼠、大鼠、狗以及食蟹猴的白蛋白)结合。上文所论述的“另外的氨基酸残基”也可以构成具有任何所希望的功能(如与第一白蛋白结合域相同的结合功能，或另外的结合功能，或治疗功能，或酶促功能，或荧光功能，或其功能的混合)的一个或多个多肽结构域。因此，在另一个相关方面中提供了一种融合蛋白或结合物，该融合蛋白或结合物包含 i) 一个第一部分，该第一部分由一个如在此所述的根据第一个方面的白蛋白结合多肽组成；以及ii) 一个第二部分，该第二部分由具有一种所希望的生物活性的一个多肽组成。包含一个根据本披露第一个方面的白蛋白结合多肽以及一个第二部分的一种融 合蛋白或结合物与该第二部分本身的体内半衰期相比可以增加该第二部分的体外和/或体内半衰期。结果，当向受试者(如人类受试者)给予一种根据这个方面的融合蛋白或结合物时，体内暴露于该第二部分可以增加，这可以导致该第二部分的生物活性效能与在单独给予该第二部分时的体内暴露的效能相比有所改进。所希望的生物活性可以例如是一种治疗活性、一种结合活性或一种酶促活性。当所希望的生物活性是一种治疗活性时，显示这种活性的第二部分可以是一种治疗活性多肽。治疗活性多肽的非限制性实例是生物分子，如选自下组的分子，该组由以下各项组成人内源酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子以及淋巴因子、以及非人类生物活性蛋白，如选自下组的蛋白质，该组由以下各项组成细菌毒素(例如假单胞菌外毒素以及葡萄球菌和链球菌超抗原)、酶(例如核糖核酸酶和内酰胺酶)以及活化蛋白(例如链激酶)。可以证明对与白蛋白结合多肽融合或结合有用的治疗活性生物分子的非限制性实例选自下组，该组由以下各项组成IL_2、GLP-1、BNP (Alb-β -钠尿肽)、IL-1-RA (白细胞介素-1受体拮抗剂)、KGF (角质细胞生长因子)、Stemgen 、生长激素(gh)、g-csf、ctla-4、肌肉生成抑制素、因子VI1、因子VIII以及因子IX。肿瘤组织的有泄漏缺陷的(leaky defective)血管使其血管结构(内皮屏障)能透过大分子，而在健康组织的血管中仅仅小分子可以通过该内皮屏障。同样，在类风湿性关节炎患者的发炎的关节中，血-关节屏障对白蛋白的渗透性显著增加。因此，根据这个方面的融合蛋白或结合物有可能渗透在肿瘤组织中的血管以及在发炎的关节中的血-关节屏障。当该第二部分的所述所希望的生物活性是一种结合活性时，所述第二部分可以是能够与目标分子选择性相互作用的一种结合多肽。这样的结合多肽可以例如选自下组，该组由以下各项组成抗体以及其实质上保留抗体结合活性的片段和结构域；微体、maxybody、高亲合性多聚体以及其他小的二硫键结合的蛋白质；以及衍生自一种骨架的结合蛋白，其选自下组，该组由以下各项组成葡萄球菌A蛋白及其结构域、其他三螺旋结构域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复结构域、纤维素结合域、Y晶型、绿色荧光蛋白、人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂(如库尼兹结构域)、PDZ结构域、SH3结构域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纤连蛋白III型结构域、转铁蛋白、锌指以及芋螺毒素。在一些实施方案中，用于结合所述目标结合多肽的目标分子可以选自下组，该组由以下各项组成阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease)的淀粉样β (Αβ )肽；其他疾病相关淀粉样肽；毒素，如细菌毒素和蛇毒；凝血因子，如血管性血友病因子；白细胞介素，如IL-13 ;肌肉生成抑制素；促炎因子，如TNF-α、TNF-α受体、IL-1、IL-8以及IL-23 ;补体因子，如C3和C5 ;超敏反应介质，如组胺和IgE ;肿瘤相关抗原，如⑶19、⑶20、⑶22、⑶30、CD33、CD40、CD52、CD70、cMet、HERl、HER2、HER3、HER4、CAIX (碳酸酐酶 IX)、CEA、IL-2 受体、MUCl、PSMA, TAG-72 ;以及其他生物分子，如G-CSF、GM-CSF、生长激素(GH)、胰岛素以及生长抑素。如熟练的人员所理解的，根据第一个方面的白蛋白结合多肽可以在融合蛋白中或作为任何其他部分的结合伴侣是有用的。因此，以上治疗活性多肽、结合多肽以及目标分子的清单不应当理解为以任何方式的限制。在根据本披露的融合蛋白或结合物一个实施方案中，该第二部分经由添加到该白蛋白结合多肽的N末端或C末端的一个赖氨酸或半胱氨酸残基或经由在该白蛋白结合多肽内的一个位置处(如选自X3、X6以及X14的一个位置处)的一个赖氨酸或半胱氨酸残基而与该白蛋白结合多肽结合。如果该结合位点是在该白蛋白结合多肽的氨基酸序列i)内的一 个位点(如在位置X14处的一个半胱氨酸)，为了实现与该第二部分结合的目的，不需要将另外的氨基酸添加到该白蛋白结合多肽中。而且如由i)所定义的在该多肽链内的一个结合位点可以保护该多肽(尤其是接近于该结合位点的多肽部分)不受交叉反应抗体的影响。在不希望受理论约束的情况下，当该结合物经由该白蛋白结合多肽与体内(即位于血清白蛋白的结合口袋中)血清白蛋白结合时，结合在例如构成该白蛋白结合多肽的三螺旋结构域的螺旋一之内的一个位置的第二部分可能远离该白蛋白结合多肽结合到其上的血清白蛋白。另外，在该白蛋白结合多肽内的一个结合位点可以损害以别的方式衍生自该多肽的这个部分的肽部分到T细胞的呈递，这是由于例如对抗原呈递细胞的加工的作用、潜在肽在MCH II类分子的肽结合槽中的配合的损害、以及可供T细胞受体使用的肽表面的重塑(由于结合部分伸出)。因此，在该结合位点附近的结合物部分的免疫原性预期在结合之后会变得进一步降低。由于本披露的白蛋白结合多肽与血清白蛋白之间的高亲和力，包含这样一种白蛋白结合多肽的一种结合物或融合蛋白可以被视为与血清白蛋白的一种间接复合物。因此，根据本披露的结合物或融合蛋白为时常使用的利用具有血清白蛋白的直接结合物或融合物的方法提供了一种替代方案。这样的具有血清白蛋白的直接结合物时常是不均匀的，无论使用何种方法进行偶联。当一个特定分子经由一个赖氨酸残基的一个氨基与血清白蛋白偶联时，可以靶向血清白蛋白分子表面上的大量赖氨酸中的任何一个，这个赖氨酸提供一个随机结合位点和一种随机产物。虽然经由人血清白蛋白中的单一不成对的半胱氨酸偶联(在34位置处，彼得斯，1985，同前文献)的巯基似乎提供了一种获得直接结合物的替代方法，但是这样的方法时常产生一种不均匀的产物。在可商购的(人类)血清白蛋白中，仅20%-60%的分子展示游离硫基，而其余部分被硫基化合物(如半胱氨酸、高半胱氨酸或谷胱甘肽)封闭。相比之下，可以用位点特异性方式来进行与根据本披露的白蛋白结合多肽的三螺旋结构域的结合。如上文所论述的，这可以通过偶联到一个或多个半胱氨酸、一个硒半胱氨酸或一个指定赖氨酸上(在合成期间受正交保护)来完成。根据本披露的这个方面，具有所希望的生物活性的该第二部分可以与该白蛋白结合多肽的三螺旋结构域结合或作为一种具有该第二部分的融合蛋白而生产。以下给出根据本披露的结合物的一个非限制性实例。胰高血糖素样肽I (GLP-1)或其衍生物是一种小的多肽，这种多肽可以适合地作为具有该白蛋白结合多肽的结合物中的一个第二部分而存在。可以在如上文所描述的多肽序列的任一位置中进行GLP-1与该白蛋白结合多肽的结合。像这样，可以在一种非生物过程中生产该结合物，并且与GLP-1本身的效能相比，该结合物预期展示出显著提高的效能。结合可以采用小的多肽或蛋白质，如GLP-1，或用更大的多肽或蛋白质。根据本披露的结合物可以典型地包含一种非氨基酸间隔部分，如聚乙二醇(PEG)0其他多肽或蛋白质可以与处于融合蛋白形式的白蛋白结合多肽的氨基酸序列相组合。此外，这样一种融合蛋白可以在第一与第二部分之间包含一个或多个间隔氨基酸残基。如上文所描述的，根据第一个方面的白蛋白结合多肽结合来自若干种类(包括小 鼠、大鼠、狗以及食蟹猴)的血清白蛋白。因此，根据本披露的融合蛋白或结合物可以有助于增强不仅在人类受试者而且动物模型中的第二部分的生物效应。已经生产了作为具有人血清白蛋白的直接融合物的许多内源性蛋白质，这样的蛋白质的实例包括G-CSF、GH、干扰素、⑶4、IL-2、胰岛素、胰高血糖素、GLP-1、抗体Fab片段以及蛋白酶抑制剂(像库尼兹结构域衍生蛋白)。然而，可以在动物模型中不完全评估这样的直接融合物。这是由于以下事实人血清白蛋白例如在通常使用的动物模型(小鼠和大鼠)中不适当地与内源性Fe新生受体(FcRn)相互作用，并且这种相互作用是促成血清白蛋白的长循环时间的重要因素。如上文所描述的，根据本披露的结合物或融合蛋白可以在血清白蛋白存在下与白蛋白组合并且作为一种具有白蛋白的间接融合物起作用。这使得包含根据第一个方面的白蛋白结合多肽的结合物或融合蛋白在临床前模型种类中是有用的，条件是在所选择的种类中该第二部分是生物学活性的。在一个实施方案中，在此提供了包含由具有一种另外的所希望的生物活性的多肽组成的一个另外的部分的融合蛋白或结合物，这种另外的所希望的生物活性可以与该第二部分的所希望的生物活性相同或不同。这样的融合蛋白或结合物的一个特定实例包含如上文定义为第二部分的治疗活性多肽以及如上文定义为一个另外的部分的结合多肽。关于以上对与根据第一个方面的白蛋白结合多肽结合的融合蛋白或结合物的描述，应当注意的是，作出第一、第二以及另外的部分的指定是为了清楚的原因，以便在一方面区分根据本披露的白蛋白结合多肽或多肽，而在另一方面区分展示其他功能的部分。这些指定并不旨在是指在融合蛋白或结合物的多肽链中的不同结构域的实际顺序。因此，例如，所述第一部分可以未加限制地出现在融合蛋白或结合物的N末端、中间或C末端。在一个相关方面，提供了进一步包含有机分子(如一种细胞毒性剂)的如在本披露中所定义的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物。与根据第一个方面的白蛋白结合多肽融合或结合或与根据第二个方面的融合蛋白或结合物组合的细胞毒性剂的非限制性实例选自刺孢霉素、奥莉丝汀(auristatin)、多柔比星、美登醇、紫杉醇、海鞘素(ecteinascidin)、格尔德霉素(geldanamycin)、氨甲喋呤以及其衍生物以及其组合。先前已经作出用直接白蛋白结合物治疗不同的失调的尝试。这样的直接白蛋白结合物已经例如与多柔比星一起用于癌症中(克拉兹(Kratz)等人，《药物化学杂志》(J Med Chem)45:5523-33，2002)，并且与氨甲喋呤一起用于类风湿性关节炎中(温德尔(Wunder)等人，《免疫学杂志》(J Immunol) 170:4793-4801,2003)。应当理解的是，白蛋白结合多肽，其自身或作为融合蛋白或结合物中的一个部分，通过其高白蛋白结合能力提供了分析白蛋白复合物的间接手段，并且因此可以提供与以上提及的这些尝试相比的一种替代治疗方法。此外，以上方面涵盖了多种多肽，其中根据第一个方面的白蛋白结合多肽或如根据第二个方面的融合蛋白或结合物中所包含的白蛋白结合多肽已经具备一种标记基团，如一种选自下组的标记物，该组由以下各项组成荧光染料和金属、发色染料、化学发光化合物以及生物发光蛋白、酶、放射性核素以及颗粒，例如用于检测多肽的目的。具体来说，本披露涵盖了由如在此所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物与一种放射性核素(如一种放射性金属)的放射性螯合物组成的一种放射性标记多肽。
在标记白蛋白结合多肽包含根据本披露第一个方面的一种白蛋白结合多肽以及一个标记的实施方案中，该标记多肽可以例如用于间接标记血清白蛋白。由于标记多肽与血清白蛋白之间的强缔合作用，该标记多肽可以用于例如研究血管渗透性和血池(bloodpool)。在其他实施方案中，该标记白蛋白结合多肽是作为同样包含具有所希望的生物活性的一个第二部分的融合蛋白或结合物中的一个部分而存在。该标记在一些情况下可以仅仅与该白蛋白结合多肽偶联，而在一些情况下与该白蛋白结合多肽和该结合物或融合蛋白的第二部分偶联。当参考一种标记多肽时，这应当理解为参考如在此所述的多肽的所有方面，包括包含一种白蛋白结合多肽和一个第二部分以及任选地另外的部分的融合蛋白和结合物。因此，一种标记多肽可以仅含有该白蛋白结合多肽和例如一种治疗性放射性核素，这种治疗性放射性核素可以与该白蛋白结合多肽螯合或共价偶联，或含有该白蛋白结合多肽、一种治疗性放射性核素以及具有所希望的生物活性(如治疗效果)的一个第二部分(如一个小分子)。在白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物经放射性标记的实施方案中，这样的放射性标记多肽可以包含一种放射性核素。大多数放射性核素具有金属性质并且多种金属典型地不能与蛋白质和肽中存在的元素形成稳定的共价键。由于这个原因，用放射性金属标记蛋白质和肽是在使用多种螯合剂(即多齿配体)的情况下进行的，这些螯合剂与金属离子形成非共价化合物，称为螯合物。在白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的一种实施方案中，与一种放射性核素结合是通过提供一种螯合环境来实现的，通过这种螯合环境该放射性核素可以与多肽配合、螯合或复合。螯合剂的一个实例是聚氨基聚羧酸酯型螯合剂。这样的聚氨基聚羧酸酯螯合剂中的两类是著名的大环和非环螯合剂。在一个实施方案中，该白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物包含由通过半胱氨酸残基的一个硫基或赖氨酸残基的一个ε胺基与白蛋白结合多肽结合的一种聚氨基聚羧酸酯螯合剂提供的螯合环境。对于铟、镓、钇、铋、放射性锕系元素(radioactinide)以及放射性镧系元素(radiolanthanide)的放射性同位素来说,最常使用的大环螯合剂为DOTA (1,4,7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)的不同衍生物。在一个实施方案中，白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的螯合环境是由DOTA或其衍生物提供的。更确切地说，例如如实例5中所述，通过使DOTA衍生物1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三-乙酸-10-马来酰亚胺乙基乙酰胺(马来酰亚胺单酰胺-D0TA)与例如白蛋白结合多肽的一个硫基反应而产生由本披露所涵盖的一组螯合多肽。高动力学惰性(即金属从DOTA的缓慢解离速率)有利于放射性核素的稳定连接。然而，由于缔合速率缓慢，对于标记需要高温。由于这个原因，DOTA衍生物广泛用于标记短肽，如本披露的白蛋白结合多肽，这种短肽在标记反应所需的温度下孵育后展示出结合功能性。最常使用的非环聚氨基聚羧酸酯螯合剂是DTPA (二乙烯三胺五乙酸)的不同衍生物。因此，具有由二乙烯三胺五乙酸或其衍生物提供的螯合环境的多肽也被本披露所涵盖。已经发现DTPA的主链修饰的半刚性变异体(sem1-rigid variant)由于用例如Zevaiml^ 9°Y标记提供了充分的稳定性。虽然非环螯合剂与大环螯合剂相比惰性更小，并且因此稳定性更低，但是其标记甚至在环境温度下也是足够快的。为了这个原因，非环螯合剂可以用于标记根据本披露的融合蛋白或结合物。用于使聚氨基聚羧酸酯螯合剂与目标蛋 白和肽偶联的详细方案已经由库柏(Cooper)等人(《自然实验手册》1:314-7，2006)以及索松伯斯基(Sosabowski)和马瑟(Mather)(《自然实验手册》1:972-6，2006)公开。与一种聚氨基聚羧酸酯螯合剂偶联的根据在此所述的这些方面的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物可以用于提供一种放射性标记多肽，这种放射性标记多肽由与螯合剂偶联的白蛋白结合多肽融合蛋白或结合物与一种放射性核素的放射螯合物组成，这种放射性核素适合用于医学显像，其选自下组，该组由以下各项组成61Cu、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、n°nIn、mIn、44SC以及86Y,或这种放射性核素适合用于治疗，这种放射性核素选自下组，该组由以下各项组成:225Ac、212B1、213B1、67Cu、166H0、177Lu、212Pb、149Pm、153Sm、227Th 以及 9°Y，其中该放射性核素与白蛋白结合多肽经由一种螯合剂而复合。在其实施方案中，该多肽也可以用非金属放射性同位素使用所谓的间接标记进行放射性标记。因此，用例如18F、76Br、不同的碘同位素以及211At标记时，使用中间“连接分子”进行标记。这样的连接子分子应当含有两个功能部分，一个提供快速并且有效的放射性标记，而另一个实现与蛋白质的快速并且有效的偶联，例如与一个独特半胱氨酸(如在白蛋白结合多肽的位置X14处)的胺基或优选地硫基偶联。例如，一个马来酰亚胺基与硫基反应形成一个稳定的硫醚键。“连接分子”可以首先与放射性标记反应，并且随后与蛋白质的巯基或硒代巯基(selenothiol group)反应。在另一个方面，提供了编码如在此所述的白蛋白结合多肽或融合蛋白的一种多核苷酸。同样，涵盖了生产如上文所描述的白蛋白结合多肽或融合蛋白的一种方法，包括表达多核苷酸、包含这种多核苷酸的表达载体以及包含这种表达载体的宿主细胞。本披露的白蛋白结合多肽可以可替代地使用具有受保护的反应性侧链的氨基酸和/或氨基酸衍生物通过非生物肽合成来生产，这种非生物肽合成包括使氨基酸和/或氨基酸衍生物逐步偶联，形成具有受保护的反应性侧链的根据第一个方面的一种多肽，从该多肽的反应性侧链中去除保护基团，并且使该多肽在水溶液中折叠。因此，使用生理氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸以及缬氨酸)和预保护的氨基酸衍生物在溶液中或在一种有机溶剂中的固体载体上顺序地构建多肽序列。在固体载体上的肽合成的一个特定实例描述于实例5中。当构建好一个完整的多肽序列时，去除保护基团并且允许该多肽在水溶液中折叠。根据本披露的每种多肽在不添加因子并且因此自发地折叠的情况下可逆地折叠成一种三螺旋束结构域。可以通过一种方法来生产根据第二个方面的结合物，这种方法包括根据以上所描述的任何方法(如通过非生物肽合成)生产一种白蛋白结合多肽，并且使所生产的白蛋白结合多肽与如结合第二个方面所定义的一个第二和/或另外的部分相结合。而且，在融合蛋白或结合物的一个实施方案中，提供了如在此所定义的融合蛋白或结合物用于治疗，例如用作一种药剂。这样一种融合蛋白或结合物可以展示比本身具有所希望的生物活性的多肽的体内半衰期更长的体内半衰期。而且，与向哺乳动物给予本身具有所希望的生物活性的多肽后引出的免疫应答相比，向哺乳动物(如人类)给予该融合蛋白或结合物后可能不引出免疫应答或引出较低的免疫应答。可替代地讲，这提供了用于降低具有所希望的生物活性的多肽的免疫原性的一种方法，这种方法是通过使这样的多肽与根据在此所披露的方面的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物融合或结合。另外，这可能增强第二部分的生物活性。
在另一个实施方案中，提供了根据本披露的融合蛋白或结合物，用于诊断，例如用作一种诊断剂。同样，本披露涉及使用上述白蛋白结合多肽的不同方面，以及用于治疗、诊断以及检测的不同方法，其中该多肽由于其结合特征和其他特征是有用的。当在以下对这些用途和方法的说明中提及“白蛋白结合多肽”时，这一术语旨在涵盖单独的白蛋白结合多肽，以及所有基于上文所描述的这种多肽的那些分子，这些分子例如与作为融合蛋白或结合物中的一个部分的白蛋白结合多肽结合，和/或与一种标记物、一种螯合剂、一种治疗剂和/或诊断剂结合，和/或具备另外的氨基酸残基作为一个标签或用于其他目的。如上文所解释的，这样的融合蛋白、衍生物等等形成本披露的一部分。另一组方面涉及提供多种新的手段，用于通过使一种难溶的化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物结合使其在水溶液中的溶解度增加。难溶的化合物与白蛋白结合多肽(单独地或作为融合蛋白或结合物中的一个部分而结合)的作为结果产生的复合物能够与白蛋白体内或体外缔合，这种缔合使其在水溶液中的溶解度增加。因此，在这个另外的方面的一个实施方案中，提供了一种组合物，这种组合物包含一种化合物，这种化合物本身具有不超过100μ g/ml的在水中的溶解度；与以下物质偶联如在此所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中这种化合物与这种白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物是共价偶联的。在一个实施方案中，该化合物本身具有不超过10 μ g/ml的溶解度。在又另一个实施方案中，所述溶解度不超过I μ g/ml。在一些实施方案中，该化合物可以是一种药物活性的化合物，例如一种细胞毒性齐U。细胞毒性剂的非限制性实例为选自以下的那些细胞毒性剂刺孢霉素、奥莉丝汀、多柔比星、美登醇、紫杉醇、海鞘素、格尔德霉素以及其衍生物以及其组合。可替代地，细胞毒性剂可以为通过有机合成制成而不是衍生自天然存在的化合物的一种合成化学毒素。除了难溶的化合物以及白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物之外，根据本披露的这个方面的组合物在一些实施方案中还可以包含对于临床相关目标具有亲和力的一种结合多肽。这种结合多肽适当地不同于白蛋白结合多肽，并且可以与发明的组合物的其他组分非共价或共价偶联。作为非限制性实例，对于临床相关目标具有亲和力的结合多肽可以选自下组，该组由以下各项组成抗体以及其实质上保留抗体结合活性的片段和结构域；微体、maxybodies、高亲合性多聚体以及其他小的二硫键结合的蛋白质；以及衍生自选自下组的一种骨架的结合蛋白，该组由以下各项组成葡萄球菌A蛋白以及其结构域、其他三螺旋结构域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复结构域、纤维素结合域、Y晶型、绿色荧光蛋白、人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂(如库尼兹结构域)、PDZ结构域、SH3结构域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纤连蛋白III型结构域、转铁蛋白、锌指以及芋螺毒素。根据本披露以上方面的组合物具有通过提供于白蛋白结合多肽(单独地或以存在·于融合蛋白或结合物中的形式)的组合物中而与白蛋白体内或体外缔合的能力。在某些情况下，形成组合物与一个活有机体外部的白蛋白的一种复合物(即将外源性白蛋白添加到组合物中)可能是有益的。可以将这样的组合物冻干，从而提供适合于在环境温度下储存的一种制剂。因此，本披露还提供了如上文所定义的一种组合物，这种组合物进一步包含白蛋白，如人血清白蛋白。在该化合物为一种治疗活性化合物的情况下，本披露还提供了根据以上方面的组合物以便用作一种药剂，即，用于治疗。适当地，提供了一种白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物并且任选地白蛋白不会有害地影响活性化合物的治疗效果，因此发明的组合物在指定化合物本身的那些治疗性或预防性背景下将是有用的。在另一个实施方案中，提供了根据以上方面的组合物，以便用作一种诊断剂，SP，用于诊断。本披露的一个相关方面提供了制备如上文刚刚描述的组合物的一种方法。该方法包括提供一种化合物，这种化合物本身具有不超过100μ g/ml的在水中的溶解度；以及使该化合物与根据如在此所述的方面的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物共价偶联，从而形成包含该化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的共价复合物的一种组合物。在白蛋白包括于该组合物中的本披露的实施方案中，该方法可以包括使该化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的所述复合物与白蛋白混合的另外的步骤，从而形成一种组合物，这种组合物包含i)化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的共价复合物与ii)白蛋白的非共价复合物。这种非共价复合物中的两种组分的相对比例可以例如是1:1，使得难溶的化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的一个复合物单元与一个白蛋白分子缔合。在一个实施方案中，该方法另外包括将该非共价复合物冻干，从而获得一种冻干组合物。在另一个紧密相关的方面，本披露提供了增加一化合物的水溶性的方法，该方法包括提供一种化合物，这种化合物本身具有不超过100 μ g/ml的在水中的溶解度；使该化合物与根据如在此所述的方面的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物共价偶联，从而形成化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的一种共价复合物；以及将化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的所述复合物与白蛋白在促进白蛋白结合多肽与白蛋白非共价缔合的条件下混合；从而所述复合物中的该化合物在水中的溶解度比这种化合物本身在水中的溶解
度更大。在有关一种难溶的化合物的溶解度的这些方法方面中，不同组分的任选特征如结合刚刚在之前的组合物方面所描述。
虽然已经参考不同的示例性实施方案描述了本发明，本领域的普通技术人员应当理解的是，在不脱离本发明范围的情况下可以作出不同的改变并且多种要素可以由多种等效物代替。另外，在不脱离本发明的基本范围的情况下，可以做出许多修改以使特定的情况或分子适应本发明的传授内容。因此，预期本发明不受限于为进行本发明而考虑的任何具体实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求书范围内的所有实施方案。MM

图1是以下实例的氨基酸序列表本披露的多种白蛋白结合多肽(SEQIDNO: 1-152, SEQ ID NO: 155-203)，由一个N末端甘氨酸残基扩展的来自链球菌菌株G148的蛋白G的GA3结构域(SEQ ID NO: 153)，以及先前由约翰松等人所描述的衍生自G148-GA3的一种白蛋白结合多肽(同前文献，SEQ ID N0:154)。图2显示了在Biacore仪器中进行的结合分析的结果，用于研究白蛋白结合多肽PEP07912CSEQ ID NO: 157)与人血清白蛋白的结合。在具有955个RU的固定人血清白蛋白的一个表面上注射三种不同浓度的纯化蛋白(40nM，粗灰色线；10nM，黑色线；以及2. 5nM，灰色线)。图3A-C显示了通过ELISA进行结合分析的结果，用于研究白蛋白结合多肽PEP07913 (SEQ ID NO: 153)、PEP06923 (SEQ ID NO: 154)、PEP07271 (SEQ ID NO: 155)、PEP07912 (SEQ ID NO: 157)、PEP07554 (SEQ ID NO: 156)、PEP07914 (SEQ ID NO: 158)、PEP07968 (D0TA 结合的 PEP07911，SEQ ID NO: 159)以及 PEP07844 (SEQ ID N0:161)与存在于126位个体的正常人血清中的IgG分子的结合，其中A)显示了平均OD值，B)显示了阴性血清(定义为0D〈0. 15)的百分比，并且C)显示了阳性血清(定义为0D>1. O)的百分比。图4A-B是显示了对纯化的以化学方式生产的白蛋白结合多肽PEP07834 (SEQ IDNO: 160)的分析的色谱图，其中A)显示了 220nm处的吸收信号，已扣除空白，并且B)显示了280nm处的吸收信号，已扣除空白。在两种波长处均出现两个峰。图5A-B是显示对在图4A)和B)中所鉴定的两个峰的质谱分析的光谱图。A)是第一峰，即PEP07834 (SEQ ID NO: 160)的单体的光谱图，而B)是PEP07834的二聚体的光谱图。图6A-C是显示在CD3+CD4+T细胞增殖分析中的白蛋白结合多肽PEP07913(SEQ IDN0:153)、PEP07912 (SEQ ID NO: 157)、PEP07914 (SEQID NO: 158)以及 PEP07968 (DOTA 结合的PEP07911，SEQ ID NO: 159)的免疫原性评定的图。A)显示了在一个具有52位白种人供体的同期组群中与重组人白蛋白相比对白蛋白结合多肽作出反应的个体的数目。B)显示了与含有重组人白蛋白的阴性对照相比的PEP07913、PEP07912、PEP07914以及PEP07968的平均刺激指数(SI)。C)显示了与缓冲剂对照相比的对研究中的所有蛋白质作出反应的个体的数目。图7A-C显示了在Biacore仪器中进行的结合分析的结果，用于研究白蛋白结合多肽 A)PEP07986 (SEQ ID NO: 163)、B) PEP08296 (D0TA 结合的 PEP08185，SEQ ID NO: 148)以及C)PEP06923 (SEQ ID NO: 154)与来自不同种类的白蛋白的结合。所示的传感图相应于在固定有来自以下种类的白蛋白的表面上以40nM的浓度注射的蛋白质人类(1130RU )，细灰色线；食蟹猴(1046RU)，粗灰色线；大鼠(831RU)，粗浅灰色线；狗(1053RU)，细黑色线；以及小鼠(858RU)，粗黑色线。图8显示了 ZX_PP013 (空心圆)、Zy-PPO 13 (空心正方形)以及Zneg_PP013 (实心三角形)在五倍摩尔过量的HSA存在下对细胞因子诱导的TF-1细胞增殖的抑制作用。图9显示了通过PEP07986 (SEQ ID NO: 163)的Biacore分析获得的最大结合反应，PEP07986在2mg/ml的浓度下按指示储存在4° C、25° C或40° C下持续一周、两周、 一个月以及三个月，以IOnM的浓度注射于固定的HSA (704RU)上。显示了时间为O时的未处理样品作为参考。图10显示了在Biacore仪器中进行的结合分析的结果，用于研究白蛋白结合多肽PEP08296 (D0TA结合的PEP08185，SEQ ID NO: 148)在热处理之前和之后与人血清白蛋白的结合。在具有724RU的固定人血清白蛋白的一个表面上注射两种浓度的PEP08296(0. 8nM，灰色线；4nM，黑色线)。实线表示热处理之前而阴影线表示在90° C下热处理10分钟之后。图1lA-B 显示了 PEP08296 (D0TA 结合的 PEP08185，SEQ ID NO: 148)在热处理之前和在90° C下热处理12min之后的两种⑶光谱的叠加。A)在PBS (pH 7. 2)中孵育样品。B)在PBS (pH 4.0)中孵育样品。图12显示了 68Ga_PEP08296在一个健康大鼠中的全身分布的最大强度投影(MIP)图像，在静脉内注射(尾静脉)后立即采集数据，持续1. 5h后求和。容易地描绘出在主要血管(例如颈静脉(长箭头)和股动脉(短箭头))、心脏(H)、肝脏(L)、脾脏(S)、肾脏(K)以及膀胱(B)中的循环放射性。图13显示了以42mg/ml的浓度注射的PEP07986 (SEQ ID NO: 163)的凝胶过滤色谱图，黑色实线。包括以5mg/ml的浓度注射的卵白蛋白(Mw43kDa)的色谱图用于比较,灰色虚线，证实了 PEP07986的峰不是一种聚集体，将预期聚集体在与卵白蛋白相比更早的一个时间点洗脱的空隙体积中。现在，将进一步通过对据此所进行的实验的非限制性说明来展示本发明。除非另有规定，自始至终使用了常规的化学和分子生物学方法。SM实例1:白蛋白结合多肽的克隆、表达、纯化以及表征在这个实例中，将以下十种不同的白蛋白结合多肽克隆、纯化以及特征化PEP07913 (SEQ ID NO: 153)、PEP07912 (SEQ ID NO: 156)、PEP07914 (SEQ ID NO: 158)、PEP07968 (DOTA 结合的 PEP07911，SEQ ID NO: 159)、PEP06923 (SEQ ID NO: 154)、PEP07271(SEQ ID N0:155)、PEP07554 (SEQID NO:156)、PEP07844 (SEQ ID NO:161)、PEP07986 (SEQID NO: 163)以及 PEP08296 (DOTA 结合的 PEP08185，SEQ ID NO: 148)，其氨基酸序列在图1和所附的序列表中列出。
材料和方法白蛋白结合多肽变异体的克隆用适当的寡核苷酸使用定点突变诱变在G148-GA3中产生突变，从而获得所希望的白蛋白结合多肽变异体。用引物通过PCR扩增基因片段，在白蛋白结合多肽变异体之前添加特异性核酸内切酶位点以及一个N末端MGSS序列。将这些片段用NdeI和NotI切割、纯化，然后连接到受相同的酶的限制的一种克隆载体上，该克隆载体为质粒PAY02556 (含有来自pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因以及T7启动子，用于表达感兴趣的基因))。将连接体转化到多个电感受态的大肠杆菌TOPlO细胞中。将转化的细胞涂布在补充有50 μ g/ml卡那霉素的TBAB板(30g/l胰蛋白示血琼脂基质)上，随后在37° C下孵育过夜。根据制造商的方案进行使用，使用PCR筛选集落，并且使用生物素化寡核苷酸和Terminatorv3.1循环测序试剂盒(应用生物系统(Applied Biosystems))对扩增片段进行测序。使用Magnatrix 8000 (NorDiag AB)通过与包被有磁性链霉亲和素的珠粒结合来纯化测序反应物，并且在ABI丨iRlSM 3100基因分析仪(PE应用生物系统(PE Applied Biosystems))上分析。将所有白蛋白结合多肽变异体亚克隆为单体，并且由表达载体编码的多种结构为MGSS-[PP###]，其中PP###相应于构成白蛋白结合多肽序列的氨基酸残基。另外，用多引物通过PCR将G148-GA3、PP007(SEQID NO:7)、PP013(SEQ ID NO: 13)以及PP037 (SEQ ID N0:37)的基因片段扩增，在构成白蛋白结合多肽序列的氨基酸残基之前添加特异性核酸内切酶位点以及一个六聚组氨酸(hexahistidin)序列、一个TEV蛋白酶位点以及一个甘氨酸残基。多肽 PEP07913 (SEQ ID NO: 153)、PEP07912 (SEQ ID NO: 157)、PEP07914 (SEQ ID NO: 158)以及 PEP07968 (SEQ ID NO: 159)相应于添加了甘氨酸残基的白蛋白结合多肽 G148-GA3、PP007 (SEQ ID N0:7)、PP013 (SEQ ID NO: 13)以及 PP037 (SEQID N0:37)。将这些片段用XbaI和NotI切割、纯化，然后与受相同的酶的限制的一种克隆载体连接，该克隆载体为质体PAY02512 (含有来自PBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因以及T7启动子，用于表达感兴趣的基因。克隆位点的前面是编码一种含有一个六聚组氨酸标签的肽的序列，随后为TEV蛋白酶的切割位点)，其受相同的酶的限制。如上文所描述进行连接、转化以及序列测定。将四个白蛋白结合多肽变异体G148-GA3、PP007、PPO13以及PP037亚克隆为单体，并且由表达载体编码的构建体为MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG-[PP###]。通过使用寡核苷酸的定点诱变将编码MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG- [PPO13]的表达载体进一步修饰，导致在构成白蛋白结合多肽序列的氨基酸残基之前插入一个丝氨酸残基，从而获得构建体MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS- [PP013]。将这个构建体通过如下方式进一步修饰1)定点诱变以用一个半胱氨酸残基替换位置14 (PP013内)处的丝氨酸残基，产生MGS SHHHHHHLQS SGVDLGTENLYFQGS_[PP049]，以及2)在C末端添加一个甘氨酸残基，产生MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS-[PP049]-G。通过使用引物的PCR扩增完成在C末端添加甘氨酸，这些引物包括编码甘氨酸残基和多个特异性核酸内切酶位点的核苷酸。将该片段用XbaI和NotI切割、纯化，然后与受相同的酶的限制的一种克隆载体连接，该克隆载体为质体PAY02641 (含有来自PBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因以及T7启动子，用于表达感兴趣的基因。如上文所描述进行连接、转化以及序列测定。蛋白表达
在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达白蛋白结合多肽变异体，这种大肠杆菌具有一个N末端MGSS延伸或一个N末端His6标签，随后为一个TEV蛋白酶识别位点和一个甘氨酸残基。使用每个白蛋白结合多肽变异体的一个集落在4ml TSB+YE介质中接种，TSB+YE介质补充有达到浓度为50 μ g/ml的卡那霉素。使培养物在37° C下生长大约5小时。在多个并联的生物反应器(格里塔系统(Greta system), Belach Bioteknik AB),使用3ml的每种培养物，接种在800ml的补充有达到浓度为50 μ g/ml的卡那霉素的TSB+YE中。在37° C下进行培养，具有每分钟800ml的通气以及以保持溶解氧含量水平大于30%的搅拌曲线(agitation profile)，直到2个达到0D600，随后添加IPTG，达到最终浓度为O. 5mM。培养持续五小时，其后将培养物冷却到10° C，停止通气并且使搅拌速度降低到300rpm。通过离心(15600Xg，4° C，20分钟)收获细胞沉淀物并且在-20° C下储存直到进行纯化。具有一个His6_tag和一个TEV-蛋白酶位点的白蛋白结合多肽变异体的纯化 将含有带可溶性六聚组氨酸标签的多肽PEP07913 (SEQ ID NO: 153)、PEP07912(SEQ ID N0:156)、PEP07914 (SEQ ID NO:158)、PEP07968 (SEQID NO:159)、PEP07986 (SEQID NO 163)以及 PEP08185 (seq id NO 148)的冷冻细胞沉淀在添加 iooou Benzonase (1. 01654. 001，默克公司(Merck))的情况下悬浮于35ml结合缓冲液(20mM磷酸钠，O. 5MNaCl, 20mM咪唑，pH 7. 4)中，并且通过超声作用进行破碎。对于每种多肽，通过离心(lh，37000Xg，4° C)使超声处理的悬浮液变澄清，并且将上清液加载到His GraviTrap 柱(11-0033-99，通用电气医疗集团)上。将该柱子用IOml洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，O. 5MNaCl，60mM咪唑，pH 7. 4)洗涤，然后用3ml洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，O. 5M NaCl，0.5M咪唑，pH 7. 4)洗脱多肽。使用PD-10脱盐柱(17-0851-01，通用电气医疗集团)，将缓冲液换成一种切割缓冲液(50mM Tris-HCl, 150mMNaCl, pH 8)。通过测量280nm下的吸光度测定多肽产物的量，然后添加DTT，达到最终浓度为5mM。将带His6标签的TEV蛋白酶以相对于多肽产物1:10的质量比添加到切割缓冲液中。在4° C下，在缓慢混合下进行切割过夜。将咪唑添加到切割混合物中，直到浓度为20mM，然后将混合物加载到His GraviTrap 柱(11-0033-99，通用电气医疗集团)上，以便去除切割的His6标签、带His6标签的TEV蛋白酶以及带His6标签的未切割产物。对于每种变异体，使流过的含有白蛋白结合多肽变异体的物质如下通过反相色谱(RPC)进一步纯化。将流过的部分加载到事先用RPCA缓冲液(O. 1%TFA水溶液)平衡的ImlResource 15RPC柱(通用电气医疗集团)上。在用10个柱体积(CV)RPC A缓冲液洗涤柱子后，将结合的多肽用10个CV以内的RPC B缓冲液(O. 1%TFA乙腈溶液)以0%_50%的线性梯度进行洗脱。流速为2ml/min并且监测在280nm下的吸光度。将含有白蛋白结合多肽变异体的部分通过SDS-PAGE分析来鉴定并且汇集。将RPC纯化白蛋白结合多肽变异体通过在填充在一个》(16柱(通用电气医疗集团)中的120ml Superdex 75 (通用电气医疗集团)上凝胶过滤而进一步纯化。运行缓冲液为lxPBS，并且流速为2ml/min。将含有纯白蛋白结合多肽变异体的部分汇集并且浓缩到大约1.3mg/ml。最后,根据制造商的建议,通过使用Iml的AffinityPak Detox1-Gel内毒素去除凝胶柱(Pierce，产品号20344)将浓缩物从痕量的剩余内毒素中纯化。使白蛋白结合多肽变异体PEP07911和PEP08185与Mal-DOTA结合，然后如下进行RPC纯化步骤。使用一次性ro-10脱盐柱(通用电气医疗集团)将来自IMAC-FT纯化步骤的流过的部分的缓冲液换成O. 2M NaAc (pH 5.5)。以5倍摩尔过量添加马来酰亚胺基-单-酰胺-DOTA (大环，目录号B-272)，并且在30° C下在连续振荡下孵育60分钟。产生的多肽对应地表示PEP07968和PEP08296。不含His6标签的白蛋白结合多肽变异体的纯化将含有可溶性白蛋白结合多肽变异体PEP06923 (SEQ ID NO: 154)、PEP07271(SEQ ID NO: 155), PEP07554 (SEQ ID NO: 156)以及 PEP07844 (SEQ ID N0:161)的冷冻细胞沉淀悬浮在20mM Tris-HCl (pH 8)中，并且用超声作用破碎。对于每种多肽变异体，通过离心(30min，32000Xg，4° C)将超声处理的悬浮液变澄清，并且将上清液加载到HSA-Sepharose 柱(通用电气医疗集团)上。在用 TST 缓冲液(25mM Tris-HCl, ImMEDTA, 200mMNaCl，O. 05% 吐温(Tween) 20，pH 8. 0)之后，用 5mM N H4Ac (pH 5. 5)洗涤，将结合的白蛋白结合多肽变异体用O. 5M HAc (pH 3.2)洗脱。将白蛋白结合多肽变异体如下通过反相色谱(RPC)进一步纯化。对于每种变异体，将来自HSA亲和力纯化步骤的洗脱物加载到事先用RPC A缓冲液(O. 1%TFA水溶液)平衡的Iml Resource 15RPC柱(通用电气医疗集团)上。在用10个CV的RPC A缓冲液洗涤柱子后，将结合的多肽用10个CV以内的RPC B缓冲液(O. 1%TFA乙腈溶液)以0%_50%的线性梯度进行洗脱。流速为2ml/min并且监测在280nm下的吸光度。将含有纯白蛋白结合多肽变异体的部分通过SDS-PAGE分析鉴定并且汇集。最后，使用一次性PD-10脱盐柱(通用电气医疗集团)将缓冲液换成 IxPBS (2. 68mM KCl，137mM NaCl，1. 47mM KH2PO4,8.1mM Na2HPO4, ρΗ7· 4)。纯化的白蛋白结合多肽变异体的表征通过使用一台NaaoDlOp ND-1000分光光度计测量在280nm下的吸光度来评估浓度。用SDS-PAGE和LC-MS进一步分析这些蛋白质。为了 SDS-PAGE分析，将大约10 μ g的每种白蛋白结合多肽变异体与NuPAGE LDS样品缓冲液(茵维特罗根(Invitrogen))混合,在70° C下孵育15min,并且加载到NuPAGE4%-12%Bis-Tris凝胶(茵维特罗根)上。使这些凝胶在一个XCell II SureLock电泳槽(诺维克斯(Novex))中用NuPAGE MES SDS运行缓冲液(茵维特罗根)进行电泳，使用Sharp预染色标准品(茵维特罗根)作为分子量标记并且使用PhastGel BlueR (通用电气医疗集团)进行染色。为了鉴定白蛋白结合多肽变异体的一致性，使用装备有AP1-ESI和单个四组分质量分析仪的一个Agilent 1100LC/MSD系统进行LC/MS分析。将大约10 μ g的每种纯化白蛋白结合多肽变异体加载到Zorbax 300SB-C8窄孔柱(2.1 X 150_，3. 5 μ m，安捷伦技术公司(Agilent Technologies))上，流速为 O. 5ml/min。在 O. 5ml/min 下使用溶液 B 以 10%-70%的线性梯度将多肽洗脱15min。在30° C下进行分离。监测离子信号以及280nm和220nm下的吸光度。通过MS确定纯化的白蛋白结合多肽变异体的分子量。结果如由SDS-PAGE分析评估的，白蛋白结合多肽变异体的表达水平是每克细胞沉淀10-30mg 产物。对于所有变异体，如通过SDS-PAGE分析所测定，纯度超过95%，并且LC/MS分析验证了正确的分子量。在纯化之后，针对十种白蛋白结合多肽变异体中每一个获得了 Img与8mg之间的纯多肽。
实例2 白蛋白结合多肽的亲和力测定在这个实例中，使用Biacore仪器表征在实例I中合成或表达并且纯化的PEP06923 (SEQ ID NO: 154)、PEP07271 (SEQ ID NO: 155)、PEP07844 (SEQ ID NO: 161)、PEP07912 (SEQ ID NO: 157)、PEP07913 (SEQ IDN0:153)、PEP07914 (SEQ ID NO: 158)以及PEP07968 (D0TA结合的PEP07911，SEQ ID NO: 159)对人血清白蛋白(HSA)的亲和力。PEP07913相应于添加了一个N末端甘氨酸残基的G148-GA3的氨基酸序列，而PEP07271、PEP07844、PEP07912、PEP07914以及PEP07968相应于添加有不同的N末端氨基酸的白蛋白结合多肽 PPOOl (SEQ ID N0:1)、PP043 (SEQ ID N0:43)、PP007 (SEQ ID N0:7)、PP013(SEQ ID NO: 13)以及 PP037 (SEQ ID NO:37)。材料和方法
根据制造商的建议，用HSA (AlbuCuHH,诺维信(Novozymes))在 Biacore2000 仪器(通用电气医疗集团)上进行生物传感器分析，HSA是通过胺偶联到CM-5芯片(研究级；通用电气医疗集团)表面的羧化右旋糖酐层上而固定。将芯片的表面I活化和去活化，并且用作多次注射之间的一个参比池(空白表面)，而表面2包含被固定到731个共振单位(RU)上的HSA，并且表面4包含被固定到955个RU上的HSA。将纯化白蛋白结合多肽变异体在运行缓冲液HBS-EP (通用电气医疗集团)中稀释到2. 5nM、10nM以及40nM，并且以50μ I/min的恒定流速注射5分钟，随后注射HBS-EP 60分钟。用25 μ I HCl (IOmM)注射一次使这些表面再生。在两组中进行亲和力测量；在第一组中，注射HBS-EP、PEP06923、PEP07271、PEP07912、PEP07913、PEP07914 以及 PEP07968 (芯片表面 2)，而在第二组中，注射 HBS-EP、PEP06923、PEP07844、PEP07912 以及 PEP07914 (芯片表面 4)。在每组中注射 PEP06923 两次作为对照。用BIA评估软件(通用电气医疗集团)分析结果。将空白表面的曲线从配体表面的曲线上扣除。结果Biacore 2000仪器具有技术限制，妨碍很高亲和力的测量。因此，Biacore研究的目的不是测定白蛋白结合多肽变异体对HAS的亲和力的精确动力学参数。然而，这些结果提供了对这些多肽对于白蛋白的相对亲和力的定量估计。在扣除参考表面和缓冲液注射之后，使用BIA评估软件在对质量转移进行校正并且以RUmax组作为局部参数的情况下，将多条曲线与1:1 (兰米尔)结合模型拟合。在图2中显示了多条曲线。评估相对KD、ka (kon)以及kd (I^ff)值并且呈现于下表中。表1:白蛋白结合多肽对HSA的动力学参数(ka、kd以及KD)，第I组
—Ikn (Ms-1)Ikri (s-1) |Kn (M)
PEP079135. 7xl059. 3xlCT4 ~ 1.6xlCT9 —
PEP06923(1) 2.9xl072.9xl0~5 _9.9xl0_13 —
PEP06923(2) 2.6xl072.8xl0~5 ~1.1xlO-12 —
PEP072713.9xl062.9xl0~5 ~ 7. 5xl0~12 —
PEP079124.6xl062.8xl0~5 ~6.2xl0~12 —
PEP079143. 5xl062. 5xl0~5 ~ 7.2xl0~12 —
PEP07968|3. OxlO6\2. 7xlCT5 \9. OxlCT12 —
表2:白蛋白结合多肽对HSA的动力学参数(ka、kd以及KD)，第2组
权利要求
1.一种白蛋白结合多肽，包含选自以下的一个氨基酸序列i) LAX3AKX6X7AnX10 Eldxi4YGVSdf YKRLIXffiKAKTVEGVEALKX39X4(lILX43X44LP其中彼此独立地X3选自E、S、Q以及C ; X6选自E、S以及C ; X7选自A和S ; Xltl选自A、S以及R ; X14选自A、S、C以及K; Xffi选自D和E ; X39选自D和E ; X4tl选自A和E ; X43选自A和K ; X44选自A、S以及E ; 位置45处的L存在或不存在；并且 位置46处的P存在或不存在； 以及 )与i)中所定义的序列具有至少95%—致性的一个氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的白蛋白结合多肽，其中X6是E。
3.根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X3是S。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X3是E。
5.根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X7是八。
6.根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X14是S。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X14是C。
8.根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中Xltl是A。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中Xltl为是S。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X26是D。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X26是E。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X39是0。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X39是E。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X40是A。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X43是八。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X44是八。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中X44是S。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中位置45处的L存在。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中位置46处的P存在。
20.根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，该白蛋白结合多肽与白蛋白结合，使得该相互作用的Uf值为至多5 X KT5s'
21.根据权利要求20所述的白蛋白结合多肽，该白蛋白结合多肽与白蛋白结合，使得该相互作用的Iw值为至多5 X KT6S'
22.根据权利要求1所述的白蛋白结合多肽，其氨基酸序列是选自SEQID N0:l-144以及SEQ ID NO: 164-203中的任何一个。
23.根据权利要求22所述的白蛋白结合多肽，其氨基酸序列是选自SEQID NO:4-5,SEQID NO:7-8,SEQ ID NO:10-1KSEQ ID NO:13-14,SEQ ID NO:16-17,SEQ ID NO:19-20,SEQID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35,SEQ ID NO:37-38、SEQ ID NO:41-42、SEQ ID NO:49-50、SEQ ID NO: 164-170 以及 SEQ IDNO: 192-203中的任何一个。
24.根据权利要求22所述的白蛋白结合多肽，其氨基酸序列是选自SEQID NO: 1-144中的任何一个。
25.根据权利要求24所述的白蛋白结合多肽，其氨基酸序列是选自SEQID NO:4-5,SEQID NO:7-8,SEQ ID NO:10-1KSEQ ID NO:13-14,SEQ ID NO:16-17,SEQ ID NO:19-20,SEQID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35,SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42 以及 SEQ ID NO:49-50 中的任何一个。
26.根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，进一步包含位于i)中所定义的该序列的N末端和/或C末端处的一个或多个另外的氨基酸残基。
27.根据权利要求26所述的白蛋白结合多肽，其中这些另外的氨基酸包含在该多肽的N末端的至少一个丝氨酸残基。
28.根据权利要求26至27中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中这些另外的氨基酸包含在该多肽的N末端的一个甘氨酸残基。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中这些另外的氨基酸包含在该多肽的N末端的一个半胱氨酸残基。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中这些另外的氨基酸包含在该多肽的C末端处的一个赖氨酸残基。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中这些另外的氨基酸包含在该多肽的C末端处的一个甘氨酸残基。
32.根据权利要求26至31中任一项所述的白蛋白结合多肽，其中这些另外的氨基酸包含在该多肽的C末端处的一个半胱氨酸残基。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的白蛋白结合多肽，其氨基酸序列是选自SEQID NO: 145-150 以及 SEQ ID NO: 162-163 中的任何一个。
34.根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，包含不超过两个半胱氨酸残基。
35.根据权利要求34所述的白蛋白结合多肽，包含不超过一个半胱氨酸残基。
36.根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽，该白蛋白结合多肽与人血清白蛋白结合。
37.一种融合蛋白或结合物，包含 i) 一个第一部分，由根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽组成；以及 ) 一个第二部分，由具有一种所希望的生物活性的一种多肽组成。
38.根据权利要求37所述的融合蛋白或结合物，其中具有一种所希望的生物活性的该第二部分是一种治疗活性多肽。
39.根据权利要求38所述的融合蛋白或结合物，其中具有一种所希望的生物活性的该第二部分是选自下组，该组由以下各项组成人内源酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子以及淋巴因子。
40.根据权利要求39所述的融合蛋白或结合物，其中该第二部分是选自下组，该组由以下各项组成IL_2、GLP-U BNP、IL-l-RA、KGF、Sfcmgen__「(_:、GH、G-CSF, CTLA-4、肌肉生成抑制素、因子VI1、因子VIII以及因子IX。
41.根据权利要求38所述的融合蛋白或结合物，其中具有一种所希望的生物活性的该第二部分是一种非人类生物活性蛋白，其选自下组，该组由以下各项组成细菌毒素类、酶类以及活化蛋白类。
42.根据权利要求37所述的融合蛋白或结合物，其中具有一种所希望的生物活性的该第二部分是能够与一个目标分子选择性相互作用的一种结合多肽。
43.根据权利要求42所述的融合蛋白或结合物，其中该结合多肽是选自下组，该组由以下各项组成抗体以及其实质上保留抗体结合活性的片段和结构域；微体、maxybodies、高亲合性多聚体(avimer)以及其他小的二硫键结合的蛋白质；以及衍生自一种骨架的结合蛋白，其选自下组，该组由以下各项组成葡萄球菌A蛋白及其结构域、其他三螺旋结构域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复结构域、纤维素结合域、Y晶型、绿色荧光蛋白、人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂(如库尼兹(Kunitz)结构域)、PDZ结构域、SH3结构域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纤连蛋白III型结构域、转铁蛋白、锌指以及芋螺毒素。
44.根据权利要求43所述的融合蛋白或结合物，其中所述目标分子是选自下组，该组由以下各项组成阿尔茨海默病的Αβ肽；其他疾病相关淀粉样肽；毒素，如细菌毒素和蛇毒；凝血因子，如血管性血友病因子；白细胞介素，如IL-13 ;肌肉生成抑制素；促炎因子，如TNF-a、TNF-a受体、IL_1、IL_23以及IL-8 ;补体因子，如C3和C5 ;超敏反应介质，如组胺和 IgE ;肿瘤相关抗原，如 CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD52、CD70、cMet、HERl、HER2、HER3、HER4、CAIX、CEA、IL-2 受体、MUCl、PSMA, TAG-72，以及其他生物学分子，如 G-CSF、GM-CSF、GH、胰岛素以及生长抑素。
45.根据权利要求37至44中任一项所述的融合蛋白或结合物，包含一个另外的部分，该另外的部分由具有另外的、所希望的生物活性的一种多肽组成，该另外的所希望的生物活性可以与该第二部分的生物活性相同或不同。
46.根据权利要求45所述的融合蛋白或结合物，其中该第二部分如权利要求38至41中任一项所定义，并且该另外的部分如权利要求42至44中任一项所定义。
47.根据权利要求37至46中任一项所述的结合物，其中该第二部分是经由在该多肽的位置X14处存在的任何半胱氨酸残基的硫基与根据权利要求1至36中任一项所述的白蛋白结合多肽结合。
48.根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，进一步包含一种细胞毒性剂。
49.根据权利要求48所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中该细胞毒性剂是选自刺孢霉素、奥莉丝汀(auristatin)、多柔比星、美登醇、紫杉醇、海鞘素、格尔德霉素、氨甲喋呤以及它们的衍生物，以及其组合。
50.根据以上权利要求中任一项所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，进一步包含一种标记。
51.根据权利要求50所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中所述标记是选自下组，该组由以下各项组成荧光染料和金属、发色染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素以及颗粒。
52.根据权利要求51所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，包含由一种聚氨基聚羧酸酯螯合剂提供的一种螯合环境(chelating environment),这种聚氨基聚羧酸酯螯合剂经由一个半胱氨酸残基的一个硫基或一个赖氨酸残基的一个胺基与该白蛋白结合多肽结合。
53.根据权利要求52所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中该聚氨基聚羧酸酯螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸或其衍生物。
54.根据权利要求53所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中该1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸衍生物是1，4，7，10-四氮杂环十二烷_1，4，7-三-乙酸-10-马来酰亚胺乙基乙酰胺。
55.根据权利要求52所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中该聚氨基聚羧酸酯螯合剂是二乙烯三胺五乙酸或其衍生物。
56.一种编码根据权利要求1至46中任一项所述的白蛋白结合多肽或融合蛋白的多核苷酸。
57.—种生产根据权利要求1至45中任一项所述的多肽的方法,包括表达根据权利要求56所述的多核苷酸。
58.—种表达载体,包含根据权利要求56所述的多核苷酸。
59.—种宿主细胞，包含根据权利要求58所述的表达载体。
60.一种制造根据权利要求1至36中任一项所述的多肽的方法，该方法是使用具有受保护的反应性侧链的氨基酸和/或氨基酸衍生物通过非生物学肽合成来实现，该非生物学肽合成包括 使这些氨基酸和/或这些氨基酸衍生物逐步偶联，形成具有受保护的反应性侧链的根据权利要求1至36中任一项所述的多肽， 从该多肽的这些反应性侧链去除保护基团，以及 使该多肽在水溶液中折叠。
61.—种生产根据权利要求37至48中任一项所述的结合物的方法，包括 通过根据权利要求60所述的方法生产一种白蛋白结合多肽，以及 使所生产的白蛋白结合多肽与如权利要求38至48中任一项所定义的第二部分和/或另外的部分结合。
62.根据权利要求37至55中任一项所述的融合蛋白或结合物，用作一种药剂。
63.根据权利要求62所述的融合蛋白或结合物，与向哺乳动物给予本身具有一种所希望的生物活性的该多肽后引出的免疫应答相比，在向该哺乳动物给予该融合蛋白或结合物后不引出或引出降低的免疫应答。
64.根据权利要求37至55中任一项所述的融合蛋白或结合物，用于诊断。
65.一种组合物，包含一种化合物，这种化合物本身具有不超过ΙΟΟμ g/ml的在水中的溶解度；与以下物质偶联 根据权利要求1至47中任一项所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物，其中该化合物与该白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物是共价偶联的。
66.根据权利要求65所述的组合物，其中所述溶解度不超过10μ g/ml。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述溶解度不超过Iμ g/ml。
68.根据权利要求65至67中任一项所述的组合物，其中所述化合物是一种药物活性化合物。
69.根据权利要求68所述的组合物，其中所述药物活性化合物是一种细胞毒性剂。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述细胞毒性剂如权利要求49中所定义。
71.根据权利要求69所述的组合物，其中所述细胞毒性剂是一种合成化学毒素(chemotoxin),而不是衍生自一种天然存在的化合物。
72.根据权利要求65至71中任一项所述的组合物，进一步包含对于临床相关目标具有结合亲和力的一种结合多肽。
73.根据权利要求72所述的组合物，其中所述结合多肽如权利要求43中所定义。
74.根据权利要求65至73中任一项所述的组合物，进一步包含人血清白蛋白。
75.根据权利要求65至74中任一项所述的组合物，用作一种药剂。
76.根据权利要求65至74中任一项所述的组合物，用于诊断。
77.一种制备根据权利要求65至76中任一项所述的组合物的方法，包括 a)提供一种化合物，这种化合物本身具有不超过ΙΟΟμg/ml在水中的溶解度；以及 b)使该化合物与根据权利要求1至47中任一项所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物共价偶联，从而形成一种组合物，该组合物包含化合物与一种白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的一种共价复合物。
78.根据权利要求77所述的方法，进一步包括c)将化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的所述复合物与白蛋白混合，从而形成一种组合物，该组合物包含i)化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的共价复合物与ii)白蛋白的一种非共价复合物。
79.根据权利要求78所述的方法，进一步包括将包含该非共价复合物的所述组合物冻干，获得一种冻干组合物。
80.一种增加化合物的水溶性的方法，包括 提供一种化合物，这种化合物本身具有不超过ΙΟΟμ g/ml的在水中的溶解度； 使该化合物与根据权利要求1至47中任一项所述的白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物共价偶联，从而形成化合物与白蛋白结合多肽的一种共价复合物；以及 将化合物与白蛋白结合多肽、融合蛋白或结合物的所述复合物与白蛋白在促进该白蛋白结合多肽与人血清白蛋白的非共价缔合的条件下混合； 由此在所述复合物中的该化合物在水中的溶解度比该化合物本身在水中的溶解度大。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述溶解度如权利要求66至67中任一项所定义。
82.根据权利要求80到81中任一项所述的方法，其中所述化合物如权利要求68至71中任一项所定义。
83.根据权利要求80至82中任一项所述的方法，其中所述复合物进一步包含对于临床相关目标具有结合亲和力的一种多肽。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述结合多肽如权利要求43中所定义。
全文摘要
本披露涉及对白蛋白具有结合亲和力的一类工程化多肽。本披露还涉及利用这些和其他化合物与白蛋白在不同环境中的结合的新的方法和用途，其中一些对于治疗或诊断包括人类的哺乳动物中的疾病具有重要性。
文档编号C07K14/43GK103003296SQ201180033097
公开日2013年3月27日 申请日期2011年7月8日 优先权日2010年7月9日
发明者卡罗琳·埃克布拉德, L·亚伯拉罕森 申请人:阿菲博迪公司