Ospa嵌合体及其在疫苗中的用途的制作方法

专利名称：Ospa嵌合体及其在疫苗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及嵌合OspA多肽、编码所述多肽的核酸、包含这些分子的组合物以及其使用方法。
背景技术：
莱姆病(Lymedisease)是由广义伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferisensuIato (s.1.))引起的蜱传疾病。这种疾病的典型特征在于:在蜱虫叮咬部位处的扩散红疹的发展，之后可能是包括脑膜炎、心脏炎或关节炎的全身并发症。莱姆病的几乎所有病例都是由三个同基因型种阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、伽氏疏螺旋体(Borreliagarinii)以及狭义伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.))中的一个引起的。在欧洲，发现了感染人类的所有这三种种类。然而，在北美洲仅发现了单一个种类:狭义伯氏疏螺旋体。伯氏疏螺旋体是疏螺旋体属(Borrelia)的螺旋体类的革兰氏阴性菌的一个种类。针对莱姆病的抗生素治疗通常是有效的，但一些患者发展成涉及关节或神经系统的慢性致残形式的疾病，所述疾病甚至在肠胃外抗生素治疗之后都未得到实质性改善，由此凸显了高危人群 对于疫苗的需要。外膜蛋白A(OspA)是存在于硬蜱属蜱虫的中肠中的由广义伯氏疏螺旋体种类表达的31kDa抗原。已证实OspA在预防北美洲的莱姆病中是有效的(Steere等，N.Engl.J.Med.339:209-15，1998 ；Sigal 等，N.Engl.J.Med.339:216-22，1998 ；N.Engl.J.Med.339:571, 1998中的正误表)。经过完全加工的OspA的氨基末端是用三个脂肪酰基链进行翻译后修饰的半胱氨酸残基，这三个脂肪酰基链将蛋白锚定到细菌膜的外表面上(Bouchon 等,Anal.Biochem.246:52-61，1997)。据报道 OspA 的脂质化可稳定分子(Luft,个人通信)并且在不存在强效的佐剂下对保护作用来说是至关重要的(Erdile等，Infect.1mmun.61:81-90, 1993)。缺少氨基末端脂质膜锚的可溶重组形式的蛋白被与凝集型小鼠单克隆抗体的Fab片段一起共结晶以便确定OspA的结构，该结构被显示包含后接单一个α螺旋的 21 个反平行 β 链(Li 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S..Α.94:3584-9，1997)。基于OspA的单价疫苗(LYMErk )在美国有售，用于预防莱姆病。然而，在欧洲，横跨三个基因种的OspA序列的异质性妨碍了基于来自单一菌株的OspA的疫苗的广泛保护作用(Gern等，Vaccine 15:1551-7,1997)。在欧洲分离物中已经识别出七个主要的OspA血清型(指定为血清型 I 至 7, Wilske 等,J.Clin.Microbiol.31:340-50，1993)。OspA 血清型与种类相关联；血清型I对应于狭义伯氏疏螺旋体，血清型2对应于阿氏疏螺旋体并且血清型3至7对应于伽氏疏螺旋体。通过用OspA免疫获得的保护性免疫是少有的，因为宿主的免疫反应与病原体之间的相互作用不会发生在宿主体内，而是发生在蜱虫载体的中肠中。就莱姆病而论，蜱虫充当莱姆病从动物传播到人类的载体(vector或carrier)。在受感染的蝶虫的进食期间获得的OspA特异性抗体防止广义伯氏疏螺旋体传播到被免疫的哺乳动物宿主(de Silva等，J.Exp.Med.183:271-5, 1996)。保护作用是抗体介导的并且主要通过杀菌性抗体而受到影响，尽管阻碍螺旋体附接至蜱虫肠道上皮组织的内层上的受体的抗体也可能是有效的(Pal 等，J.1mmunol.166:7398-403，2001)。有效OspA疫苗的合理开发要求鉴定保护性表位，如由保护性单克隆抗体LA-2限定的表位(Golde等,Infect.1mmun.65:882-9，1997)。X射线晶体学和NMR分析已被用来鉴定OspA中的在免疫学上重要的高变域并且已将LA-2表位定位到氨基酸203-257 (Ding等，J.Mol.Biol.302:1153-64,2000; Luft 等，J Infect Dis.185 (增刊 I): S46-51, 2002)。本领域中存在开发OspA疫苗的需要，所述OspA疫苗能够提供针对在美国、欧洲以及其它地方存在的疏螺旋体属的多种种类的广泛保护。以下公开描述了这种疫苗的细节。发明概述本发明解决了本领域中与莱姆病或莱姆疏螺旋体病的预防和治疗相关的一个或多个需求。本发明包括一种分离的核酸分子，其包含选自由SEQ ID N0:l、3以及5中阐述的序列组成的组的核苷酸序列。在一些方面，本发明包括一种分离的核酸分子，其由选自由SEQ ID N0:l、3以及5中阐述的序列组成的组的核苷酸序列组成。在其它方面，本发明包括一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列:(a)与包含SEQID NO: KSEQ ID N0:3或SEQ ID NO :5中阐述的核苷酸序列的核酸分子具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核苷酸序列；和(b)与(a)互补的核苷酸序列。在其它方面，本发明包括一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列:(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽与包含SEQ IDNO: 2, SEQ ID N0:4或SEQ ID NO: 6中阐述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一'I"生；和(b)与(a)互补的核苷酸序列。在甚至其它方面，本发明包括一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列:(a)编码包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或SEQ ID N0:6中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个保守氨基酸的取代；(b)编码包含SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个保守氨基酸的插入；(c)编码包含SEQ IDNO:2, SEQ ID N0:4或SEQ IDN0:6中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个保守氨基酸的内部缺失；(d)编码包含SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4或SEQ IDNO:6中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个氨基酸的C末端和/或N末端截短；(e)编码包含SEQ IDN0:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个氨基酸的修饰，所述修饰选自氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、C末端截短或N末端截短；以及(f)与(a)至(e)中任何一个互补的核苷酸序列。本发明包括一种分离的核酸分子，其包含选自由SEQ ID N0:7、9以及11中阐述的序列组成的组的核苷酸序列。在一些方面，本发明包括一种分离的核酸分子，其由选自由SEQ ID N0:7、9以及11中阐述的序列组成的组的核苷酸序列组成。在其它方面，本发明包括一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列:(a)与包含SEQ IDNO:7, SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 11中阐述的核苷酸序列的核酸分子具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核苷酸序列；和(b)与(a)互补的核苷酸序列。在其它方面，本发明包括一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列:(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽与包含SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一'丨生；和(b)与(a)互补的核苷酸序列。在甚至其它方面,本发明包括一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列:(a)编码包含SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个保守氨基酸的取代；(b)编码包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个保守氨基酸的插入；(c)编码包含SEQ ID NO:8, SEQID NO: 10或SEQ ID NO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个保守氨基酸的内部缺失；(d)编码包含SEQID NO:8、SEQ IDNO: 10或SEQ ID NO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个氨基酸的C末端和/或N末端截短；(e)编码包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ IDNO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个氨基酸的修饰，所述修饰选自氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、C末端截短或N末端截短；以及(f)与(a)至(e)中任何一个互补的核苷酸序列。本发明包括载体、宿主细胞以及通过培养本文论述的宿主细胞来产生多肽的方法。在一些方面，本发明包括包含本文描述的任何核酸分子的载体。在其它方面，本发明包括包含所述载体的宿主细胞。在一些方面，宿主细胞是真核细胞。在其它方面，宿主细胞是原核细胞。在各个方面，产生多肽的方法包括在适于表达多肽的条件下培养本文描述的宿主细胞，并且任选地使多肽与培养物分离。在各个方面，本发明包括包含这些嵌合核酸分子中的任何嵌合核酸分子或包含所述核酸分子的任何载体和一种或多种药学上可接受的载体的组合物。本发明包括组合物，其包含本文论述的核酸分子中的任一种或本文论述的载体(vector)中的任一种以及药学上可接受的载体(carrier)。在一些方面,本发明包括组合物，其包含本文论述的核酸分子中的至少两种和药学上可接受的载体，其中所述核酸分子具有不同的核苷酸序列。在具体方面，本发明包括组合物，其包含SEQ ID N0:l、3以及5中阐述的核苷酸序列的组合。本发明包括一种分离的多肽，其包含选自由SEQ ID N0:2、4以及6中阐述的序列组成的组的氨基酸序列。在一些方面，本发明包括一种分离的多肽，其由选自由SEQ IDN0:2、4以及6中阐述的序列组成的组的氨基酸序列组成。在其它方面，本发明包括一种分离的多肽，其包含具有至少200个氨基酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列与包含SEQID NO: 2,SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6中阐述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在其它方面，本发明包括一种分离的多肽，其包含选自由SEQ ID N0:8、10以及12中阐述的序列组成的组的氨基酸序列。在甚至其它方面，本发明包括一种分离的多肽，其由选自由SEQ ID N0:8、10以及12中阐述的序列组成的组的氨基酸序列组成。在一些方面，本发明包括一种分离的多肽，其包含具有至少200个氨基酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列与包含SEQ ID NO:8, SEQ IDN0:10或SEQ ID NO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
本发明包括组合物，其包含本文论述的多肽中的任一种和药学上可接受的载体。在一些方面，本发明包括组合物，其包含本文论述的多肽中的至少两种和药学上可接受的载体，其中所述多肽具有不同的氨基酸序列。在具体方面，本发明包括组合物，其包含多肽的组合，所述多肽包含SEQ ID N0:2、4以及6中阐述的氨基酸序列。本发明包括免疫原性组合物。在一些方面,本发明的免疫原性组合物包含本文论述的组合物中的任何组合物和药学上可接受的载体。在各个方面，所述免疫原性组合物具有诱导产生特异地结合外膜蛋白A(OspA)蛋白的抗体的性质。在某些方面，所述免疫原性组合物具有诱导产生特异地结合疏螺旋体属的抗体的性质。在特定方面，所述免疫原性组合物具有诱导产生中和疏螺旋体属的抗体的性质。在某些方面，疏螺旋体属是广义伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu lato)。在特定方面，疏螺旋体属是阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii) >伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)或狭义伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensustricto)。在其它方面，疏螺旋体属是日本疏螺旋体(Borrelia japonica)、安德森疏螺旋体(Borrelia andersonii)、比塞蒂疏螺旋体(Borreliabissettii)、西尼伽疏螺旋体(Borrelia sinica)、土德疏螺旋体(Borreliaturdi)、塔卢基疏螺旋体(Borrelia tanukii)、法雷斯疏螺旋体(Borreliavalaisiana)、卢西塔尼疏螺旋体(Borrelia lusitaniae)、斯柏曼疏螺旋体(Borrelia spielmanii)、宫本疏螺旋体(Borrelia miyamotoi)或孤星疏螺旋体(Borrelialonestar) 0在一些方面，抗体是由动物产生。在其它方面，动物是哺乳动物。在甚至其它方面，哺乳动物是人类。本发明包括疫苗组合物。在一些方面,本发明的疫苗组合物包含本文论述的任何免疫原性组合物和药学上可接受的载体。在各个方面，本发明包括联合疫苗。在某些方面，本发明的联合疫苗包含本文论述的任何疫苗组合物联合至少一种第二疫苗组合物。在一些方面，第二疫苗组合物防御蜱传疾病。在各个方面，所述蜱传疾病是落基山斑疹热(Rocky Mountain Spotted Fever)、巴贝斯虫病(Babesiosis)、回归热、科罗拉多蝶热(Colorado tick fever)、人单核细胞埃立克体病(HME)、人粒细胞埃立克体病(HGE)、南方蜱叮咬相关的皮疹疾病(STARI)、兔热病(Tularemia)、蜱瘫痪、波瓦桑脑炎(Powassanencephalitis)、寇热病、克里米亚刚果出血热(Crimean-Congo hemorrhagic fever)、胞裂虫病(Cytauxzoonosis)、南欧斑疫热(boutonneuse fever)或蝶传脑炎。在其它方面，所述第二疫苗组合物是选自由 以下组成的组的疫苗:蜱传脑炎疫苗、日本脑炎疫苗以及落基山斑疹热疫苗。在各个方面，所述第二疫苗组合物具有与针对疏螺旋体属感染或莱姆病的免疫相容的季节性免疫程序(seasonal immunization schedule)。本发明包括用于诱导受试者体内的免疫反应的方法。在各个方面，所述方法包括向受试者施用有效诱导免疫反应的量的本文论述的免疫原性组合物或疫苗组合物中的任一种的步骤。在某些方面，免疫反应包括产生抗OspA抗体。本发明包括特异地结合本文描述的任何多肽的抗体或其片段。本发明包括用于预防或治疗受试者体内的疏螺旋体属感染或莱姆病的方法。在各个方面，所述方法包括向受试者施用有效预防或治疗疏螺旋体属感染或莱姆病的量的本文论述的疫苗组合物中的任一种或本文论述的联合疫苗中的任一种的步骤。在其它方面，所述方法包括向受试者施用有效预防或治疗疏螺旋体属感染或莱姆病的量的本文论述的抗体中的任一种的步骤。在其它方面，所述方法包括向受试者施用有效预防或治疗所述疏螺旋体属感染或莱姆病的量的抗体或其片段的步骤，所述抗体或其片段是通过用如权利要求28至34中任一项所述的疫苗组合物使哺乳动物免疫来产生。在其它方面，所述抗体或其片段是高免疫血清、高免疫血浆或其纯化的免疫球蛋白部分。本发明包括用于被动地预防受试者体内的疏螺旋体属感染或莱姆病的方法，所述方法包括以下步骤:向所述受试者施用有效预防所述疏螺旋体属感染或莱姆病的量的抗OspA抗体或其片段，所述抗OspA抗体或其片段是通过用本文论述的疫苗组合物中的任一种使哺乳动物免疫来产生，其中所述抗体或其片段是纯化的免疫球蛋白制剂或免疫球蛋白片段制剂。本发明包括用于预防受试者体内的疏螺旋体属感染或莱姆病的方法，所述方法包括以下步骤:向所述受试者施用有效预防所述疏螺旋体属感染或莱姆病的量的抗OspA单克隆抗体或其片段，所述抗OspA单克隆抗体或其片段是在用本文论述的疫苗组合物中的任一种使受试者免疫之后产生。在一些方面，所述单克隆抗体或其片段是人源化的。在一个特定方面，所述单克隆抗体是F237/BK2。本发明包括本发明的组合物用于制备药剂的用途。在本发明中还提供了其它相关方面。以上概述不意图限定本发明的每个方面，并且其它方面被描述于其它章节如以下详细描述中。整个文件意图被关联成统一公开，并且应理解的是，涵盖本文描述的特点的所有组合，即使这些特点的组合未在本文件的同一句子或段落或章节中被一起发现。从以下的详细描述中将会明了本发明的其它特点和优点。然而，应理解的是，指示本发明的具体实施方案的详细描述和具体实施例仅是通过说明方式给出的，这是因为本领域技术人员从这一详细描述中将会明了在本发明的精神和范围内的各种改变和变更。附图简述

图1是用于制备脂质化OspA嵌合体构建体的示意性概述。图2 是 IipB sOspA 1/2251 的氨基酸序列(SEQ ID NO:2) 图3示出IipB sOspA 1/2251的核苷酸(SEQ ID NO:1)和推导的氨基酸序列(SEQID NO:2)。图4 是 IipB sOspA 6/4 的氨基酸序列(SEQ ID NO:4) 图5示出IipB sOspA 6/4的核苷酸(SEQ ID NO: 3)和推导的氨基酸序列(SEQ IDNO:4)。图6 是 IipB sOspA 5/3 的氨基酸序列(SEQ ID N0:6)。图7示出IipB sOspA 5/3的核苷酸(SEQ ID NO: 5)和推导的氨基酸序列(SEQ IDNO:6)。图8描绘了优化密码子的使用用于高水平表达。图9示出在脂质化构建体与非脂质化构建体之间的序列差异。图10是T7表达系统的描述。图11是示出来自诱变培养物和非诱变培养物的新型重组OspA蛋白的表达的SDS-PAGE。图12是质粒pUC18的图谱。图13是质粒pET30a的图谱。图14示出用于产生IipB sOspA 5/3Kpn 1-Bam HI片段的策略。
图15是凸显IipB sOspA 1/2251中的氨基酸变化(SEQ ID NO:39)的比对和用于引入所述变化的 PCR 引物序列(SEQ ID NO:21 和 41) (IipBOspA l/2mod(SEQ ID NO:38)；共有序列(SEQ ID NO:40)) ο图16 是 Blip OspA BPBP/A1 与被修饰的分子 IipB sOspA 1/2251 的 OspA 序列比对。上部链是原始序列(SEQ ID NO:42)并且下部链是优化序列(SEQ ID N0:43)。注意:未示出序列起始处的三个碱基(CAT);这些碱基形成Nde I位点CATATG的一部分。图17是Blip OspA KT与被修饰的分子IipB sOspA 6/4的OspA序列的比对。上部链是原始序列(SEQ ID NO:44)并且下部链是优化序列(SEQ ID N0:45)。注意:未示出序列起始处的一个单一的碱基(C);这些碱基形成Nde I位点CATATG的一部分。图18是Blip OspA 5/3与被修饰的分子IipB sOspA 5/3的OspA序列的比对。上部链是原始序列(SEQ ID NO:46)并且下部链是优化序列(SEQ ID NO:47)。图19示出在用狭义伯氏疏螺旋体B31菌株攻击之前，在用3ng的OspA 1/2进行免疫的受保护和受感染的动物之中的抗体表面结合和生长抑制测定中的功能性抗OspA反应的分布。曼-惠特尼(Mann-Whitney)p值证明了在受保护与受感染的动物之间的功能性抗体含量的高度显著的差异。图20示出在用野生蜱虫攻击之前，在用3ng的OspA 1/2进行免疫的受保护和受感染的动物之中的抗体表面结合和生长抑制测定中的功能性抗OspA反应的分布。曼-惠特尼P值证明了在受保护与受感染的动物之间的功能性抗体含量的高度显著的差异。图21示出在用三个剂量的3-组分嵌合OspA疫苗免疫之后，池集的小鼠血清中的表面结合(平均荧光强度(MFI))和生长抑制(G1-50效价)。检测针对所有六种疏螺旋体属菌株的有效的表面结合和生长抑制，所述六种疏螺旋体属菌株表达与在疫苗中的OspA类型(I至6类型)同源的OspA类型。

图22示出在表面结合测定(SBA)中使用来自用rOspA疫苗的组合进行免疫的单独小鼠的第42天的血清所获得的平均荧光强度(MFI)效价。结果显示多价疫苗中要求所有三种rOspA组分(1/2、6/4以及5/3)以便在C3H小鼠体内诱导针对所有六种菌株的高效价表面结合IgG抗体。2-组分疫苗无法完全覆盖两种缺少的菌株。图23示出使用来自用rOspA疫苗的组合进行免疫的单独小鼠(10只为一组)的第42天的血清的疏螺旋体属的生长抑制。只有多价疫苗(该疫苗包含所有三种菌株)在大于90%的动物(n=10)中给出大于50%的生长抑制。黑色直条(实心直条)指示与使用的疫苗同源的菌株。图24示出表达OspA的型内变体的疏螺旋体属的覆盖度。表面结合分类成强式结合(荧光增加大于10倍)或弱式结合(荧光增加2至10倍)。发明详述本发明提供可用作抗原的嵌合OspA分子，所述嵌合OspA分子可以作为免疫原性组合物或疫苗组合物进行递送以用于莱姆病或疏螺旋体属感染。在详细解释本发明的任何实施方案之前，应理解的是，本发明的应用不限于在以下描述中阐述或附图和实施例中说明的组分的构建细节和安排细节。本文使用的章节标题仅是出于组织性目的并且不应视为是限制所描述的标的。本申请中引用的所有参考文献都被以引用方式明确并入本文中。本发明包涵其它实施方案并且以各种方式来实践或进行。而且，应理解的是，本文使用的措辞和术语是出于描述目的并且不应认为具有限制性。术语“包括”、“包含”或“具有”以及其变型意欲涵盖其后所列的项目和其等效项目以及其它项目。本发明的实施方案是在编码三种相异的脂质化OspA分子的三种嵌合OspA编码序列的设计和合成中进行例证，所有三种相异的脂质化OspA分子共有一些共同的特点。每个嵌合编码序列代表两个OspA血清型并且所述嵌合编码序列被设计成编码安全且高度免疫原性的稳定的嵌合OspA分子，并且向受试者提供针对广义伯氏疏螺旋体感染的保护。在一方面，嵌合OspA分子包含来自一个OspA血清型的近端部分连同来自另一个OspA血清型的远端部分，同时保留了两个亲本多肽的保护性质。嵌合OspA核酸分子被表达在大肠杆菌(E.coli)中以便提供抗原，该抗原可以被配制成联合疫苗以便提供针对与在欧洲的莱姆病或疏螺旋体属感染相关联的所有六种流行的血清型(血清型I至6)和针对与在北美洲的莱姆病或疏螺旋体属感染相关联的单一个OspA血清型的保护。由于包含血清型I至6的疫苗提供针对阿氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体以及伯氏疏螺旋体的保护，所以疫苗被设计成全球通用。本发明还包括通过去除编码产生脂质化OspA分子所需要的前导序列的核酸序列来制备第二组嵌合OspA编码序列，在一方面，该组嵌合OspA编码序列源自于第一组三种基因。需要对这两组构建体(产生脂质化和非脂质化多肽)进行以下操作:评估所述构建体在发酵罐中产生的难易程度(生物量、稳定性、产物产率等)、评定不同类型的抗原可以纯化的容易程度以及比较所述构建体的生物特征(安全状况和保护效力)。本发明包括包含本发明的嵌合OspA分子的免疫原性组合物。本发明同样包括包含所述OspA分子的疫苗和疫苗试剂盒、用于制作免疫原性组合物和疫苗的方法以及免疫原性组合物和疫苗在人类和兽医医学治疗和预防中的用途。本发明进一步包括使用本文描述的OspA组合物来进行免疫对抗莱姆病或疏螺旋体属感染的方法和OspA组合物在制造用于预防莱姆病或疏螺旋体属感染的药剂中的用途。定义 除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义。以下参考文献为技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的通用定义:Singleton等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND M0LECULARB10L0GY (1994 第二版)；THE CAMBRIDGE DICTIONARY 0FSCIENCE ANDTECHNOLOGY(1988ffalker 编);THE GLOSSARY 0FGENETICS,第五版，R.Rieger 等(编)，Springer Verlag(1991);以及 Hale&Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY (1991)。贯穿全文使用以下缩写。AA 氨基酸Amp 安比西林bp碱基对B.afzelii阿弗西尼疏螺旋体B.burdorferi 伯氏疏螺旋体B.gar ini i伽氏疏螺旋体DNA脱氧核糖核酸
dNTPs脱氧核苷酸三磷酸E.coli大肠杆菌GC content 含有鸟嘌呤和胞嘧啶碱基的序列的百分比hLFA-Ι人类白细胞功能相关抗原-1HPLC高效液相色谱法IP知识产权IPTG异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷Kan卡那霉素kDa千道尔顿LB卢里亚肉汤(Luria Broth)Lip B来自外膜蛋白B的前导序列Mab单克隆抗体 OD光密度OspA外膜蛋白AOspB外膜蛋白BPCR聚合酶链反应RNA核糖核酸s.1.广义s.s.狭义SDS十二烧基硫酸纳SMK用于大肠杆菌的生长培养基(酮戊二酸山梨醇培养基)tRNA转移核糖核酸WCB工作细胞库此处应注意，如在本说明书和随附权利要求书中所使用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”以及“该(the) ”包括复数引用。如在此所使用，除非另外规定，否则以下术语具有赋予给它们的含义。术语“基因”是指编码包含一个或多个多肽、蛋白或酶中的全部或部分的氨基酸序列的DNA序列，并且可以或可以不包括内含子，和调控DNA序列，如影响例如基因表达的条件的启动子或增强子序列、5’未翻译区或3’未翻译区。在本公开中，OspA基因是细菌基因并且因此不存在内含子。术语“编码序列”是指编码氨基酸序列但不含有内含子或调控序列的DNA序列。同样地，在本公开中，OspA编码序列不含有调控序列。“核酸”或“核酸序列”或“核酸分子”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其聚合物。该术语涵盖了含有已知核苷酸类似物或被修饰的骨架残基或连接部分的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的以及非天然存在的，它们具有与参考核酸相似的结合性质，并且它们以与参考核苷酸相似的方式进行新陈代谢。所述类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸甲酯、手性磷酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。所述术语涵盖了由DNA和RNA的任何已知碱基类似物形成的分子，所述碱基类似物诸如但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤、吖丙啶基-胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基-甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异-戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧唳、5-甲氧胺基-甲基-2-硫尿卩密唳、β -D-甘露糖基Q核苷(mannosylqueosine)、5’ -甲氧羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿卩密唳-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿卩密唳、Q核苷、2_硫基胞卩密唳、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫基胞嘧啶以及2，6- 二氨基嘌呤。除非另外指示，否则一个特定核酸序列也隐含地涵盖其经过保守性修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指示的序列。明确来说，在一些方面，简并密码子取代是通过产生序列来实现，在所述序列中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等，Nucleic AcidRes.19:5081(1991);Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸可以与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸以及多核苷酸互换使用。术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”在本文中可互换使用以便指代经由肽键连接的氨基酸残基的聚合物。所述 术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。术语“蛋白”典型地是指较大多肽。术语“肽”典型地是指短多肽。合成多肽可以例如使用自动化的多肽合成仪来进行合成。术语“Osp A分子”或“嵌合OspA分子”在一方面是指包含SEQ IDNOil (IipBsOspA 1/2251)、SEQ ID N0:3(lipB sOspA 6/4)、SEQ ID N0:5(lipB sOspA 5/3)、SEQID NO: 7 (sOspA 1/2251)、SEQ ID NO:9 (s0spA6/4)、SEQ ID NO: 11 (sOspA 5/3)、SEQ IDN0:168(orig sOspA 1/2),SEQ ID NO:170(orig sOspA 6/4)或SEQ ID N0:172(orig sOspA5/3)的核苷酸序列的“OspA核酸”，或者在另一方面是指包含SEQ ID NO:2 (IipB sOspA1/2251)、SEQ ID N0:4(lipB sOspA 6/4)、SEQ ID NO: 6 (IipBsOspA 5/3)、SEQ ID NO:8 (sOspA1/2251)、SEQ ID NO: 10 (sOspA 6/4)、SEQ ID NO: 12 (sOspA 5/3), SEQ ID NO: 169 (orig sOspA1/2) ,SEQ IDN0:171 (orig sOspA 6/4)或 SEQ ID NO: 173 (orig sOspA 5/3)的氨基酸序列的“OspA多肽”。术语“lipBsOspA 分子”在一方面是指包含 SEQ ID NO:1 (IipBsOspA 1/2251)、SEQID N0:3(lipB sOspA 6/4)或 SEQ ID NO: 5 (IipBsOspA 5/3)的核苷酸序列的“OspA 核酸”，或者在另一方面是指包含 SEQID NO: 2 (lipB sOspA 1/2251)、SEQ ID N0:4(lipB sOspA 6/4)或 SEQ IDN0:6(lipB sOspA 5/3)的氨基酸序列的“OspA 多肽”。SEQ ID N0:7、9 以及 11 的核酸序列缺少编码IipB前导序列(MRLLIGFALALALIG(SEQID NO: 13)的核酸序列。此外，代替SEQ ID N0:2、4以及6中的IipB前导序列的羧基末端处存在的半胱氨酸残基，SEQ IDN0:7、9以及11的核酸序列对在SEQ ID N0:8、10以及12的氨基末端处的甲硫氨酸残基进行编码。术语“orig sOspA分子”或“原始sOspA分子”在一方面是指包含SEQ IDNO:168(orig sOspA 1/2),SEQ ID NO:170(orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO:172(orig sOspA5/3)的核苷酸序列的“OspA核酸”，或者在另一方面是指包含SEQ ID NO: 169 (orig sOspA1/2)、SEQ ID NO: 171 (orig sOspA 6/4)或 SEQ ID NO: 173 (orig sOspA 5/3)的氨基酸序列的“OspA多肽”。这些“原始”分子是不具有突变并且不具有密码子优化的嵌合构建体。本发明包括“脂质化OspA”和“非脂质化OspA”嵌合分子。在各个方面，脂质化将佐剂性质赋予OspA。在本发明的一些方面,脂质化OspA分子包含OspB前导序列。在本发明的一些方面，所述OspB前导序列包含氨基酸MRLLIGFALALALIG(SEQ ID NO: 13)。在其它方面，OspB前导序列包含其它氨基酸。如在本领域中已知的术语“一致的”或“同一性”百分比是指两个或更多个多肽分子或者两个或更多个核酸分子的序列之间的如通过比较这些序列来确定的关系。在本领域中，“同一性”也意指核酸分子或多肽之间的序列相关性的程度，所述程度看情形而定，如通过两个或更多个核苷酸序列或者两个或更多个氨基酸序列的链条之间的匹配度来确定。通过特定的数学模型或计算机程序( 即，“算法”)来解决，“同一性”测量间隙对准(如果有的话)的两个或更多个较小序列之间的一致匹配的百分比。“大致同一性”是指序列与指定序列具有至少约70%、约71%、约72%、约73%、约74%、约75%、约76%、约77%、约78%、约79%、约80%、约 81%、约 82%、约 83%、约 84%、约 85%、约 86%、约 87%、约 88%、约 89%、约 90%、约 91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列同一性。在一些方面，同一性存在于长度至少约为50至100个氨基酸或核苷酸的区域中。在其它方面，同一性存在于长度至少约为100至200个氨基酸或核苷酸的区域中。在其它方面，同一性存在于长度至少约为200至500个氨基酸或核苷酸的区域中。在某些方面，序列同一性百分比是使用选自由以下组成的组的计算机程序来确定:GAP、BLASTP, BLASTN、FASTA, BLASTA, BLASTX,BestFit 以及 Smith-Waterman 算法。还应明确理解的是，本文引用的任何数值包括从下限值至上限值的所有值，S卩，在本申请中认为明确陈述了在已列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合。例如，如果浓度范围被陈述为约1%至50%，那么意图在本申请中明确列举一些值如2%至40%、10%至30%或1%至3%等。上文列出的值仅是明确意图的值的实例。在各个方面，范围在本文中被表达为从“约”或“近似” 一个特定值和/或至“约”或“近似”另一个特定值。在通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，应理解的是，一些变化量被包括在所述范围内。术语“相似性”是相关的概念，但与“同一性”相比是指包括一致匹配和保守性取代匹配的相似性的量度。如果两个多肽序列例如具有10/20的一致的氨基酸并且剩余部分是所有的非保守性取代，那么同一性百分比和相似性百分比将都是50%。在同一实施例中，如果存在其中存在保守性取代的多余的五个位置，那么同一性百分比仍然是50%，但相似性百分比将是75%(15/20)。因此，在存在保守性取代的情况下，两个多肽之间的相似性百分比的程度将大于在那两个多肽之间的同一性百分比。术语“分离的核酸分子”是指本发明的核酸分子，(I)所述核酸分子已从当从源细胞分离总DNA时，可天然地被一起发现的蛋白、脂类、碳水化合物或其它材料分离成任何程度；(2)所述核酸分子未连接至所述“分离的核酸分子”天然连接的多核苷酸的全部或一部分；(3)所述核酸分子被操作地连接至它天然并不连接的多核苷酸；或者(4)所述核酸分子并不是天然存在作为较大多核苷酸序列的一部分。如本文使用的大致地不含指示核酸分子不含在它的自然环境中发现的任何其它污染性核酸分子或其它污染物，所述污染性核酸分子或其它污染物会干扰所述核酸分子在多肽产生中的用途或所述核酸分子的治疗、诊断、预防或研究用途。术语“分离的多肽”是指本发明的多肽，⑴所述多肽已从当它从源细胞分离时，可天然地被一起发现的多核苷酸、脂类、碳水化合物或其它材料分离成任何程度；(2)所述多肽未连接(通过共价或非共价相互作用)至所述“分离的多肽”天然连接的多肽的全部或一部分；(3)所述多肽被操作地连接(通过共价或非共价相互作用)至它天然并不连接的多肽；或者(4)所述多肽天然并不存在。在一方面，分离的多肽大致上不含在它的自然环境中发现的任何其它污染性多肽或其它污染物，所述污染性多肽或其它污染物会干扰所述多肽的治疗、诊断、预防或研究用途。如本文使用的多肽的“片段”是指多肽的小于全长多肽或蛋白表达产物的任何部分。片段典型地是全长多肽的缺失类似物，其中一个或多个氨基酸残基已从全长多肽的氨基末端和/或羧基末端去除。因此，“片段”是下文描述的缺失类似物的子集。如本文使用的“类似物”是指在结构上大致相似并且具有相同的生物活性的多肽，尽管在某些情况下在不同程度上，是指天然存在的分子。基于一种或多种突变，与衍生类似物的天然存在的多肽相比，类似物在它们的氨基酸序列的组成上是不同的，所述一种或多种突变包括(i)在多肽(包括如上文描述的片段)的一个或多个末端处和/或天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域处缺失一个或多个氨基酸残基；(ii)在多肽的一个或多个末端(典型是“添加”类似物)处和/或天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域(典型是“插入”类似物)处插入或添 加一个或多个氨基酸；或者(iii)用一个或多个氨基酸取代天然存在的多肽序列中的其它氨基酸。取代基于被替换的氨基酸和替换它的氨基酸的物理化学相关性或功能性相关性是保守性的或非保守性的。“保守性修饰的类似物”应用于氨基酸序列与核酸序列。对于特定的核酸序列来说，保守性修饰的核酸是指编码一致的或基本上一致的氨基酸序列或其中核酸未将氨基酸序列编码成基本上一致的序列的那些核酸。大量功能上一致的核酸由于遗传密码的简并性而对任何给出的蛋白进行编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG以及GCU都对氨基酸丙氨酸进行编码。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置处，在不改变被编码的多肽的情况下可以将密码子改变为描述的任何相应的密码子。所述核酸变异是“沉默变异”，是保守性修饰的类似物的一个种类。在本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每个可能的沉默变异。技术人员将认识到在核酸(除了通常为甲硫氨酸仅有的密码子的AUG和通常为色氨酸仅有的密码子的TGG)中的每个密码子都可以被修饰以便产生功能上一致的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异均暗含于每个描述的序列中。至于氨基酸序列，技术人员将认识到在被编码的序列中改变、添加或缺失单一个氨基酸或小百分比的氨基酸的针对核酸、肽、多肽或蛋白序列的单独取代、插入、缺失、添加或截短是“保守性修饰的类似物”，其中改变造成氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守性取代表在本领域中是熟知的。除了这类经过保守性修饰的变体之外，不排除本发明的多态变体、种间同源物以及等位基因。以下八个组各自含有互为彼此的保守性取代的氨基酸:I)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见,例如 Creighton, Proteins (1984))。如本文使用的“变体”是指包含至少一个氨基酸取代、缺失、插入或修饰的多肽、蛋白或其类似物，前提是所述变体保留了天然多肽的生物活性。如本文使用的“等位基因变体”是指占据同一基因座的基因的两个或更多个多态形式中的任何一种。等位基因变异通过突变而天然出现，并且在一些方面导致群体中的表型多态。在某些方面，基因突变是沉默的(经过编码的多肽中无变化)或者在其它方面，对具有改变的氨基酸序列的多肽进行编码。“等位基因变体”也是指源自于遗传等位基因变体的mRNA转录本的cDNA以及由cDNA编码的蛋白。术语“衍生物”是指通过偶联到治疗剂或诊断剂、标记(例如，用放射性核素或各种酶)、共价聚合物附接如PEG化(用聚乙二醇衍生化)以及通过非天然氨基酸的化学合成而进行的插入或取代来进行共价修饰的多肽。在一些方面，衍生物被修饰以便包含正常情况下不是分子的一部分的其它化学部分。在各个方面，所述部分调节分子的溶解性、吸收和/或生物半衰期。在其它各个方面，所述部分可选地降低了分子的毒性并且消除或弱化分子的任何不合意的副作用等。雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(1980)中公开了能够介导所述作用的部分。将所述部分连接至分子的程序在本领域中是熟知的。例如，在一些方面，OspA衍生物是具有赋予所述蛋白较长体内半衰期的化学修饰的OspA分子。在一个实施方案中，多肽是通过添加本领域中已知的水溶性聚合物来进行修饰。在一个相关的实施方案中，多肽是通过糖基化、PEG化和/或多唾液酸化来进行修饰。在参考例如细胞或核酸、蛋白或载体来一起使用时，术语“重组”指示细胞、核酸、蛋白或载体已通过引入异源核酸或蛋白或者改变天然核酸或蛋白来进行修饰，或者指示细胞源自于经过如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因或者表达以其它形式异常表达、表达不充分或完全未表达的天然基因。如本文使用的“可选标记”是指编码赋予细胞或有机体的酶或其它蛋白的基因，在所述细胞或有机体中，所述基因表达为可鉴定的表型变化如对药物、抗生素或其它试剂的抗性，这样使得标记的表达或活性被选择用于(例如但不限于阳性标记如neo基因)或对抗(例如并且不限于阴性标记如白喉基因)。“异源可选标记”是指已被插入动物的基因组的可选标记基因，在所述动物中通常无法发现所述可选标记基因。可选标记的实例包括但不限于抗生素抗性基因如新霉素(neo)、嘌呤霉素(Puro)、白喉毒素、磷酸转移酶、潮霉素磷酸转移酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核酸基转移酶、第一型单纯疱疹病毒胸苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶以及次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthinephosphoribosy I transferase)。本领域普通技术人员将理解本领域已知的任何可选标记都可用于本文描述的方法中。在参考核酸部分一起使用时，术语“异源”指示核酸包含彼此在性质上未找出相同关系的两个或更多个子序列。例如，核酸典型地是进行重组来产生，从而使来自不相关基因的两个或更多个序列被安排，以便制作新的功能性核酸，例如，来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。相似地，异源蛋白指示蛋白包含彼此在性质上未找出相同关系的两个或更多个子序列(例如，融合蛋白)。如本文使用的术语“同源”是指拥有“共同的进化起源”的蛋白之间的关系，所述蛋白包括来自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白和来自不同物种(例如，肌球蛋白轻链等)的同源蛋白(Reeck等，Cell50:667，1987)。所述蛋白(和它们的编码基因)具有如通过它们的序列相似性来反映的序列同源性，所述序列相似性是就在相似性百分比而论，或是就在保守位置处特定残基或基元的存在而论。进行用于比较的序列的最佳比对，最佳比对是例如但不限于通过Smith等，Adv.Appl.Math.2:482，1981 的局部同源性算法；通过 Needleman 等，J.Mol.Biol.48:443，1970的同源性比对算法；通过Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:2444, 1988的相似性搜索方法；通过这些算法的计算机化实施(威斯康星洲麦迪逊(Madison, WI)的575ScienceDr.的 Genetics Computer Group 的 Wisconsin 遗传学软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)或者通过目测检查(通常参见上文的Ausubel等)。适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的另一个实例是BLAST算法，该算法被描述在Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410, 1990中。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。除计算出序列同一'I"生百分比之外，BLAST算法还进行在两个序列之间的相似性的统计分析(参见，例如Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:5873-5787， 1993)。术语“载体”用于指用来将编码信息转移到宿主细胞的任何分子(例如，核酸、质粒或病毒)。“克隆载体”是其中可以插入外来DNA片段的一小片DNA。将片段插入克隆载体是通过用同一限制酶来处理运载物和外来DNA，然后将片段连接在一起来进行。存在许多类型的克隆载体并且所有类型的 克隆载体都用于本发明中。遗传工程改造的质粒和细菌噬菌体(如，噬菌体λ)可能最常用于这一目的。其它类型的克隆载体包括细菌人工染色体(BAC)和酵母菌人工染色体(YAC)。“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，所述核酸构建体具有允许特定的核酸在宿主细胞中进行转录的一系列指定的核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。在某些方面，表达载体包括待被转录操作地连接至启动子的核酸。术语“编码序列”在本文中被定义为转录成mRNA的核酸序列，所述mRNA在处于适当的控制序列的控制下时被翻译成多肽。编码序列的边界总体上是由通常为mRNA的5'末端处的开放读码框的起点的ATG起始密码子和恰好位于mRNA的3'末端处的开放读码框的下游的转录终止序列来确定。编码序列可以包括但不限于基因组DNA序列，cDNA序列，半合成序列、合成序列以及重组的核酸序列。在一方面，启动子DNA序列被定义为位于与其相关的编码序列的上游的DNA序列并且能够控制这一编码序列的表达。“启动子”被定义为指引核酸转录的一系列核酸控制序列。如本文使用的启动子包括在转录的起始位点附近的必要的核酸序列，如在聚合酶II类型启动子情况下的TATA元件。启动子还任选地包括可以位于距离转录的起始位点多达数千碱基对处的远端增强子或阻遏元件。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下呈活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节情况下呈活性的启动子。术语“操作地连接”是指在核酸表达控制序列(如启动子或一系列转录因子结合位点)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指引对应于第二序列的核酸的转录。术语“转导”是用于指通常通过噬菌体将核酸从一种细菌转移到另一种细菌。“转导”还指通过逆转录病毒获得并且转移真核细胞序列。术语“转染”是用于指通过细胞摄取外来或外源DNA，并且细胞在外源DNA已被引入细胞膜内时已经被“转染”。本领域中熟知并且在本文中公开了许多转染技术。参见，例如 Graham 等，Virology,52:456 (1973) ;Sambrook 等，Molecular Cloning, a LaboratoryManual, ColdSpring Harbor Laboratories, New York, (1989) ;Davis 等，Basic MethodsinMolecular Biology, Elsevier, (1986);以及 Chu 等，Gene, 13:197 (1981)。所述技术可以用来将一个或多个外源DNA部分引入适合的宿主细胞。如在此使用的术语“转化”是指细胞遗传特征的改变，并且细胞在经过修饰而含有新的DNA时已经被转化。例如，在细胞从它的天然状态进行遗传修饰时，所述细胞已被转化。在转染或转导之后，转化DNA可以通过物理地并入细胞的染色体来与细胞的DNA重组。在一些情况下，DNA被短暂地维持为游离元件而不被复制，或者它独立地复制为质粒。在DNA随着细胞分裂而进行复制时，认为细胞已经被稳定转化。术语“内源的”是指在宿主有机体内天然地表达或起源于细胞、组织或有机体内的多肽或多核苷酸或其它化合物。“外源的”是指起源于细胞、组织或有机体之外的多肽、多核苷酸或其它化合物。术语“试剂”或“化合物”描述具有影响本发明中的生物学参数的能力的任何分子，例如，蛋白或药物。如本文使用的“对照”可以是指活性、阳性、阴性或媒介物对照。如将为本领域技术人员所理解，对照是用来建立实验结果的相关性并且为测试条件提供比较。在提及莱姆或莱姆病的症状时，术语“降低严重程度”意指症状具有延迟的发作，降低的严重程度或对受试者产生较小损害。通常来说，将症状的严重程度与例如未接受活性预防性或治疗性组合物的对照相比较。在所述情况下，与症状的对照水平相比，如果所述症状被降低了 10%、25%、30%、50%、80%或100%(即，实质上消除)，那么则说组合物可以降低莱姆症状的严重程度。术语“抗原”是指能够由选择性结合剂如抗体来结合并且另外能够用于受试者以便产生能够接合到每个抗原的表位的抗体的分子或分子的一部分。在各个方面，抗原具有一个或多个表位。术语“抗体”是指具有针对OspA多肽的特异性的一个或多个分子。如在此使用的术语“特异的”、“特异性”以及“特异地结合”是指抗体接合到OspA多肽和不结合到非OspA多肽的能力。在某些方面，抗体是“中和抗体”，其中抗体与感染剂发生反应并且破坏或抑制它的感染性或毒力。本发明包 括包含“中和”疏螺旋体属的抗体的免疫原性组合物。如在此使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”是指适于实现或增强作为药用组合物的OspA多肽、OspA核酸分子或OspA抗体的递送的一种或多种配制材料。术语“稳定剂”是指保护疫苗的免疫原性组合物不受不利条件(如在加热或冷冻期间产生的那些条件)的影响和/或延长免疫原性组合物在稳定和免疫原性的条件或状态下的稳定性或保质期的物质或疫苗赋形剂。稳定剂的实例包括但不限于糖类，如蔗糖、乳糖以及甘露糖；糖醇如甘露醇(manitol);氨基酸如甘氨酸或谷氨酸；以及蛋白如人血清清蛋白，或明胶。术语“抗菌性防腐剂”是指被添加至免疫原性组合物或疫苗的任何物质，所述物质抑制在反复刺穿多剂量小瓶(如果使用所述容器)时可能引入的微生物的生长。抗菌性防腐剂的实例包括但不限于如硫柳汞、2-苯氧基乙醇、苄索氯铵以及苯酚的物质。术语“免疫原性组合物”是指包含抗原(产生针对它的抗原特异性抗体)(例如，嵌合OspA分子)、刺激受试者宿主的免疫反应的佐剂以及适合的免疫惰性的药学上可接受的载体的组合物。任选地，免疫原性组合物包含一种或多种稳定剂。任选地，免疫原性组合物包含一种或多种抗菌性防腐剂。术语“疫苗”或“疫苗组合物”是指改善对特定疾病(例如，莱姆病或疏螺旋体属感染)的免疫性的生物制剂。疫苗典型地含有与引起疾病的微生物类似的试剂(例如，疏螺旋体属的嵌合OspA分子(抗原))。所述试剂刺激机体的免疫系统来将所述试剂识别为外来物，破坏所述试剂并且“记住”所述试剂，这样使得免疫系统可以更容易地识别并且破坏它后来碰到的这些微生物中的任何微生物。在各个方面，疫苗是预防性的(预防或改变通过任何天然或“野生”病原体引起的未来感染的作用)或治疗性的(针对本感染的疫苗)。如上文所阐述,所述疫苗组合物包括包含药学上可接受的载体的制剂。任选地,疫苗还包含一种或多种稳定剂和/或一种或多种抗菌性防腐剂。术语“有效量”和“治疗有效量”各自是指用于支持如本文所阐述的OspA多肽的一种或多种生物活性的可观察水平的核酸分子、多肽、组合物或抗体的量。例如，在本发明的一些方面，有效量将是预防、中和或降低疏螺旋体属感染所必要的量。术语“组合”是指本发明的两个或更多个核酸分子或本发明的两个或更多个多肽。在一些方面，施用本发明的分子的组合来提供免疫力或抵抗来自本文描述的疏螺旋体属的六种血清型(I至6)中的至少四种血清型的感染。在各个方面，使用了本发明的两个或三个分子或多肽的组合。在某些方面，向受试者施用本发明的分子的组合来提供针对来自本文描述的疏螺旋体属的所有六种血清型(I至6)的免疫性。后一种组合已显示出提供针对表达核酸分子或多肽的组合中不存在的OspA类型的疏螺旋体属的异源菌株的免疫性。术语“联合疫苗”是指含有针对一种或多种疾病的一种以上疫苗组合物或一种以上保护性抗原的疫苗制剂。除了针对一种或多种其它疾病的抗原之外，本发明还包括包含针对莱姆病或疏螺旋体属的OspA嵌合抗原的联合疫苗。在各个方面,一种或多种其它疾病是蜱传疾病。在某些方面，其 它蜱传疾病是落基山斑疹热、巴贝斯虫病、回归热、科罗拉多蜱热、人单核细胞埃立克体病(HME)、人粒细胞埃立克体病(HGE)、南方蜱叮咬相关的皮疹疾病(STARI)、兔热病、蜱瘫痪、波瓦桑脑炎、寇热病、克里米亚刚果出血热、胞裂虫病、南欧斑疹热或蜱传脑炎。在特定方面，本发明包括包含一种或多种疫苗的联合疫苗，所述一种或多种疫苗包括蜱传脑炎疫苗、日本脑炎疫苗以及落基山斑疹热疫苗。在一些方面，联合疫苗包含具有与针对疏螺旋体属感染或莱姆病的免疫相容的季节性免疫程序的疫苗组合物。在更特定的方面，联合疫苗可用于预防多种疾病，用于这些疾病流行的地理位置。术语“疏螺旋体属”是指疏螺旋体属的螺旋体类的革兰氏阴性细菌的一个种类。在一个方面，“广义伯氏疏螺旋体”是指较宽意义上的伯氏疏螺旋体。莱姆病或疏螺旋体病的几乎所有病例都是由三个同基因型种阿氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体以及狭义伯氏疏螺旋体(其是指狭义上的伯氏疏螺旋体)中的一个引起的。疏螺旋体属的OspA血清型与种类相关联；血清型I对应于狭义伯氏疏螺旋体，血清型2对应于阿氏疏螺旋体并且血清型3至7对应于伽氏疏螺旋体。在各个方面，本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物还提供了针对其它种类的疏螺旋体属的保护作用，所述其它种类的疏螺旋体属包括但不限于日本疏螺旋体、安德森疏螺旋体、比塞蒂疏螺旋体、西尼伽疏螺旋体、土德疏螺旋体、塔卢基疏螺旋体、法雷斯疏螺旋体、卢西塔尼疏螺旋体、斯柏曼疏螺旋体、宫本疏螺旋体或孤星疏螺旋体。“受试者”被给予了非植物、非原生生物的生物的常规含义。在大多数方面，受试者是动物。在特定方面，动物是哺乳动物。在更特定方面，哺乳动物是人类。在其它方面，哺乳动物是宠物或伴侣动物、驯养家畜或动物园动物。在某些方面，哺乳动物是猫、狗、马或牛。在其它各个方面，哺乳动物是鹿、小鼠、花栗鼠、松鼠、负鼠或浣熊。莱姆病(疏螺旋体病或莱姆疏螺旋体病)在一些方面，本发明包括嵌合OspA分子和包含这些分子的组合物以预防莱姆病或疏螺旋体属感染。莱姆病在本领域中又称为疏螺旋体病或莱姆疏螺旋体病，因此，所有这些术语都包括在本发明内。同样地，本发明包括预防或治疗莱姆病的方法，所述方法包括施用本文描述的嵌合OspA分子。莱姆病或疏螺旋体病是由属于疏螺旋体属的至少三种革兰氏阴性细菌引起的感染性疾病。存在已发现的至少13种疏螺旋体属种类，已知其中三种是与莱姆病相关的。引起莱姆病的疏螺旋体属种类被统称为广义伯氏疏螺旋体，并且显示大量基因多样性。广义伯氏疏螺 旋体组是由可能造成绝大多数的病例的三个紧密相关的种类构成。狭义伯氏疏螺旋体是美国莱姆病(但所述莱姆病还存在于欧洲)的主要病因，而阿氏疏螺旋体和伽氏疏螺旋体引起了欧洲的大多数病例。一些研究还提出疏螺旋体属种类(例如，比塞蒂疏螺旋体、斯柏曼疏螺旋体、卢西塔尼疏螺旋体以及法雷斯疏螺旋体)有时可能会感染人类。虽然这些种类看起来似乎不是疾病的重要病因，但针对这些种类的免疫保护也被包括在本发明内。莱姆病是北半球最常见的蝶传疾病。所述疾病是以康乃狄格州(Connecticut)的村庄莱姆来命名的，在1975年在所述村庄中鉴定出许多病例。疏螺旋体属通过属于硬蜱属(“硬蜱”)的一些种类的受感染的蜱虫的叮咬传播到人类。在一些情况下，早期症状包括发热、头痛、疲劳、抑郁以及称为游走性红斑的特征性圆形皮肤红疹。如果不治疗，那么稍后的症状经常可以涉及关节、心脏以及中枢神经系统。在大多数情况下，感染和其症状可通过抗生素(尤其是疾患早期治疗时)来消除。然而，过晚、延迟或不充分的治疗可以导致更严重的症状，所述症状可能致残并且难以治疗。症状如在感染之后持续的关节炎有时通过抗生素来消除。一些团体辩称，“慢性”莱姆病造成在识别出的晚期莱姆病的症状之外的一系列医学上无法解释的症状，并且需要另外的长期抗生素治疗。然而，长期治疗是备受争议的并且关于所述治疗的争论已产生了针对治疗指南的立法行动。
莱姆病被分类成动物传染病，这是因为莱姆病是通过蜱虫从包括啮齿动物和鸟类的天然储存宿主传播到人类，而所述蜱虫是以啮齿动物和鸟类这两组宿主为生。硬蜱属的硬体蜱虫是莱姆病的主要载体。大多数的人类感染是由处于幼虫阶段的蜱虫引起的，这是因为蜱虫幼虫十分之小并且可能进食很长一段时间，而不被检测到。蜱虫叮咬因处于幼虫阶段的蜱虫的较小体型以及防止宿主感觉到因叮咬而产生的任何瘙痒或疼痛的蜱虫分泌物而经常不被察觉。莱姆病基于症状、客观身体上的发现(如游走性红斑、面神经麻痹或关节炎)、可能暴露于受感染的蜱虫的经历以及血清学血液测试而进行临床诊断。接近一半的莱姆病患者将发展成特征性靶心状红疹，但许多患者可能都不会联想到蜱虫叮咬。对于没有莱姆病症状的人来说，不推荐进行实验室测试。因为在实验室中很难培养疏螺旋体属细菌，所以莱姆病的诊断典型地是基于临床检查发现结果和暴露于地方性莱姆区的经历。认为仅出现在所有病例的约50%中的游走性红斑(EM)红疹就足以确立莱姆病的诊断，即便是在血清学血液测试是阴性的情况下。血清学测试可以用于支持临床上疑似的病例但其自身并没有诊断性。晚期莱姆病的诊断经常因可能模仿许多其它疾病的症状的多方面表现而变得困难。为此原因，评论家将莱姆称为新的“伟大模仿者”。在一些情况下，莱姆病被误诊为多发性硬化症、类风湿性关节炎、纤维肌痛、慢性疲乏综合征(CFS)、狼疮或其它自体免疫和神经变性疾病。因此，本领域中对预防或治疗莱姆病的疫苗存在很大的需求。疏螺旋体属的外膜蛋白A (OspA)在各个方面，本发明包括疏螺旋体属的嵌合OspA分子和包含这些分子的组合物以预防和治疗莱姆病或疏螺旋体属感染。在过去十年中已鉴定了数种疏螺旋体属外膜蛋白，所述外膜蛋白在这种螺旋体被从蜱虫传播到哺乳动物时通过体温和/或哺乳动物的宿主特异性信号来进行上调。伯氏疏螺旋体的 主要外膜蛋白OspA因它作为疫苗候选物潜力而成为特别受关注的脂蛋白。来自疏螺旋体属的欧洲和北美洲菌株的OspA的血清型和基因分析已证明了抗原异质性和结构异质性。OspA被描述于已公布的PCT专利申请WO 92/14488、Jiang等(Clin.Diagn.Lab.1mmunol.1:406-12，1994)中并且在本领域中是已知的。在小鼠、仓鼠以及狗的攻击研究中已显示Osp A诱导保护性免疫。人类的临床试验已显示OspA的制剂在人体中是安全的并且具有免疫原性(Keller等，JAMA (1994) 271:17641768)。虽然OspA表达在来自北美洲的伯氏疏螺旋体的绝大多数临床分离物中，但从欧洲的临床疏螺旋体属分离物的检查中出现了不同的景象。在欧洲，莱姆病主要是由疏螺旋体属的三种同基因型种，即伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体以及阿氏疏螺旋体引起的。本发明涉及提供针对疏螺旋体属的所有同基因型种的保护性免疫的嵌合OspA分子。本发明描述了编码共有共同特点的三种相异的脂质化OspA分子的三种嵌合OspA基因的设计和合成。每个基因代表两个OspA血清型并且这些基因被设计成编码安全且高度免疫原性，并且向受试者提供针对广义伯氏疏螺旋体感染的保护的稳定的OspA分子。本发明还描述了不具有突变和不具有密码子优化的三种原始嵌合OspA基因，所述基因编码共有共同特点的三种相异的脂质化OspA分子。每个基因代表两个OspA血清型并且编码向受试者提供针对广义伯氏疏螺旋体感染的保护的分子。
已识别出欧洲分离物之中的七个主要的OspA血清型(指示为血清型I至7，Wilske 等,J.Clin.Microbiol.31:340-50，1993)。OspA 血清型与种类相关联；血清型 I 对应于狭义伯氏疏螺旋体，血清型2对应于阿氏疏螺旋体并且血清型3至7对应于伽氏疏螺旋体。欧洲疏螺旋体属分离物的流行病学研究指示基于OspA类型1、2、3、4、5以及6的疫苗在欧洲将提供98.1%的莱姆病的理论覆盖率并且覆盖96.7%的侵袭性疾病分离物。本发明提供可以提供针对所有六种血清型I至6的保护性免疫的六种嵌合OspA核酸分子(SEQ IDN0:l、3以及5和SEQ IDN0:168、170以及172)和六种嵌合OspA多肽分子(SEQ ID N0:2、4以及6和SEQ ID N0:169、171以及173)。六种合成OspA基因被设计成编码OspA分子，所述OspA分子具有来自以下的保护性表位:0spA血清型I和2 (lipB sOspA 1/2251 (SEQID NO:1 (核酸)和 2(氨基酸))和 orig sOspA 1/2 (SEQ ID NO: 168 (核酸)和 169 (氨基酸)));0spA 血清型 6 和 4(lipB sOspA 6/4(SEQ ID NO:3 (核酸)和 4(氨基酸))和 origs0spA6/4 (SEQ ID NO: 170 (核酸)和 171 (氨基酸)));以及 OspA 血清型 5 和 3 (lipB sOspA5/3 (SEQ ID NO: 5 (核酸)和 6(氨基酸))和 orig sOspA 5/3 (SEQ ID NO: 172 (核酸)和173(氨基酸)))。嵌合OspA基因是使用合成的重叠寡核苷酸来制作的。在某些方面，以高产率和纯度产生这些重组蛋白，并且在各个方面，可操纵所述重组蛋白来最大化合意的活性并最小化不合意的活性。嵌合OspA核 酸分子和多肽分子在各个方面，本发明包括疏螺旋体属的嵌合OspA核酸和多肽分子。本发明的OspA核酸包括核酸分子，所述核酸分子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成JnSEQ IDNO:1 (lipB sOspA 1/2251)、SEQID N0:3(lipB sOspA 6/4) ,SEQ ID N0:5(lipB sOspA 5/3)、SEQ ID NO: 7 (sOspA 1/2251)、SEQ ID NO: 9 (sOspA 6/4)、SEQ ID NO: 11 (s0spA5/3)、SEQID NO:168(orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO:170(orig sOspA 6/4)或 SEQ ID NO:172 (origsOspA 5/3)中阐述的核苷酸序列或如 SEQ IDN0:2(lipB sOspA 1/2251)、SEQ ID N0:4(lipBsOspA 6/4)、SEQ ID N0:6(lipB sOspA 5/3)、SEQ ID NO: 8 (sOspA 1/2251)、SEQ IDN0:10(s0spA6/4)、SEQ ID NO: 12 (sOspA 5/3)、SEQ ID NO: 169 (orig sOspA 1/2)、SEQ IDNO: 171 (orig sOspA 6/4)或SEQ ID NO: 173 (orig sOspA 5/3)中阐述的编码多肽的核苷酸序列。SEQ ID N0:7、9以及11的核酸序列缺少编码IipB前导序列(MRLLIGFALALALIG(SEQ ID NO: 13)的核酸序列。此外，代替在SEQID N0:2、4以及6中的IipB前导序列的羧基末端处存在的半胱氨酸残基，SEQ ID N0:7、9以及11的核酸序列对在SEQ ID N0:8、10以及12的氨基末端处的甲硫氨酸残基进行编码。SEQ ID N0:l、3以及5是IipB sOspA多核苷酸，并且SEQ ID NO:2、4以及6是IipB sOspA多肽。在一些方面，本发明包括不具有突变并且不具有密码子优化的疏螺旋体属的原始(“orig”)嵌合OspA核酸分子和多肽分子。因此，本发明的OspA核酸包括核酸分子，所述核酸分子包含以下，基本上由以下组成或由以下组成:如SEQ ID NO: 168 (orig sOspA1/2)、SEQ ID NO: 170 (orig sOspA 6/4)或 SEQ ID NO: 172 (orig sOspA 5/3)中阐述的核苷酸序列或如 SEQ ID NO: 169 (orig sOspA 1/2)、SEQ ID NO: 171 (origsOspA 6/4)或 SEQID NO: 173 (orig sOspA 5/3)中阐述的编码多肽的核苷酸序列。下表I中陈述了用于嵌合OspA分子的DNA和氨基酸序列的序列鉴定编号。
表1.嵌合OspA DNA和氨基酸序列
权利要求
1.一种分离的核酸分子，其包含选自由SEQ ID NO: 1、3以及5中阐述的序列组成的组的核苷酸序列。
2.一种分离的核酸分子，其由选自由SEQ ID NO: 1、3以及5中阐述的序列组成的组的核苷酸序列组成。
3.一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列: (a)与包含SEQID NO: 1、SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:5中阐述的核苷酸序列的核酸分子具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核苷酸序列；和 (b)与(a)互补的核苷酸序列。
4.一种分离的 核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列: (a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽与包含SEQID NO:2,SEQID N0:4或SEQ ID NO:6中阐述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一 I"生；和 (b)与(a)互补的核苷酸序列。
5.一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列: (a)编码包含SEQID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个保守氨基酸的取代； (b)编码包含SEQID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个保守氨基酸的插入； (c)编码包含SEQID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个保守氨基酸的内部缺失； (d)编码包含SEQID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个氨基酸的C末端和/或N末端截短； (e)编码包含SEQID NO:2,SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:6中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个氨基酸的修饰，所述修饰选自氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、C末端截短或N末端截短；以及 (f)与(a)至(e)中任何一个互补的核苷酸序列。
6.一种分离的核酸分子，其包含选自由SEQ ID NO:7、9以及11中阐述的序列组成的组的核苷酸序列。
7.一种分离的核酸分子，其由选自由SEQ ID NO:7、9以及11中阐述的序列组成的组的核苷酸序列组成。
8.一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列: (a)与包含SEQID NO: 7,SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 11中阐述的核苷酸序列的核酸分子具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核苷酸序列；和 (b)与(a)互补的核苷酸序列。
9.一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列: (a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽与包含SEQ ID NO:8, SEQID N0:10或SEQ IDNO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性；和 (b)与(a)互补的核苷酸序列。
10.一种分离的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的核苷酸序列: (a)编码包含SEQID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个保守氨基酸的取代； (b)编码包含SEQID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个保守氨基酸的插入； (c)编码包含SEQID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个保守氨基酸的内部缺失； (d)编码包含SEQID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个氨基酸的C末端和/或N末端截短； (e)编码包含SEQID NO:8、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述多肽具有I至25个氨基酸的修饰，所述修饰选自氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、C末端截短或N末端截短；以及 (f)与(a)至(e)中任何一个互补的核苷酸序列。
11.一种载体，其包含如权利要求1至10中任一项所述的核酸分子。
12.—种宿主细胞，其包含如权利要求11所述的载体。
13.如权利要求12所述的宿主细胞，其是真核细胞。`
14.如权利要求12所述的宿主细胞，其是原核细胞。
15.—种产生多肽的方法,其包括在适于表达所述多肽的条件下培养如权利要求12所述的宿主细胞，并且任选地使所述多肽与培养物分离。
16.一种组合物，其包含如权利要求1至10中任一项所述的核酸分子或如权利要求11所述的载体(vector)以及药学上可接受的载体(carrier)。
17.—种组合物，其包含如权利要求1至10中任一项所述的核酸分子中的至少两种和药学上可接受的载体，其中所述核酸分子具有不同的核苷酸序列。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述组合物包含SEQIDN0:1、3以及5中阐述的核苷酸序列的组合。
19.一种分离的多肽，其包含选自由SEQ ID NO:2、4以及6中阐述的序列组成的组的氨基酸序列。
20.一种分离的多肽，其由选自由SEQ ID N0:2、4以及6中阐述的序列组成的组的氨基酸序列组成。
21.一种分离的多肽，其包含具有至少200个氨基酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列与包含SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4或SEQID N0:6中阐述的氨基酸序列的多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性。
22.—种分离的多肽，其包含选自由SEQ ID N0:8、10以及12中阐述的序列组成的组的氨基酸序列。
23.一种分离的多肽，其由选自由SEQ ID N0:8、10以及12中阐述的序列组成的组的氨基酸序列组成。
24.一种分离的多肽，其包含具有至少200个氨基酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列与包含SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10或SEQID NO: 12中阐述的氨基酸序列的多肽具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性。
25.一种组合物，其包含如权利要求19至24中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体。
26.一种组合物，其包含如权利要求19至24中任一项所述的多肽中的至少两种和药学上可接受的载体，其中所述多肽具有不同的序列。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述组合物包含多肽的组合，所述多肽包含SEQID NO:2、4以及6中阐述的氨基酸序列。
28.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求16至18和25至27中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体。
29.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求16至18和25至27中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体，其中所述组合物诱导特异地结合外膜蛋白(Osp)A蛋白的抗体的产生。
30.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求16至18和25至27中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体，其中所述组合物诱导特异地结合疏螺旋体属的抗体的产生。
31.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求16至18和25至27中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体，其中所述组合物诱导中和疏螺旋体属的抗体的产生。
32.如权利要求30或31所述的组合物，其中疏螺旋体属是广义伯氏疏螺旋体。
33.如权利要求30或31所述的组合物，其中疏螺旋体属是阿氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体或狭义伯氏疏螺旋体。
34.如权利要求30或31所述的组合物，其中疏螺旋体属是日本疏螺旋体、安德森疏螺旋体、比塞蒂疏螺旋体、西尼伽疏螺旋体、土德疏螺旋体、塔卢基疏螺旋体、法雷斯疏螺旋体、卢西塔尼疏螺旋体、斯柏曼疏螺旋体、宫本疏螺旋体或孤星疏螺旋体。
35.一种疫苗组合物，其包含如权利要求28至34中任一项所述的免疫原性组合物和药学上可接受的载体。
36.一种联合疫苗，其包含如权利要求35所述的疫苗组合物联合至少一种第二疫苗组合物。
37.如权利要求36所述的联合疫苗，其中所述第二疫苗组合物防御蜱传疾病。
38.如权利要求37所述的联合疫苗，其中所述蜱传疾病是落基山斑疹热、巴贝斯虫病、回归热、科罗拉多蜱热、人单核细胞埃立克体病(HME)、人粒细胞埃立克体病(HGE)、南方蜱叮咬相关的皮疹疾病(STARI)、兔热病、蜱瘫痪、波瓦桑脑炎、寇热病、克里米亚刚果出血热、胞裂虫病、南欧斑疹热或蜱传脑炎。
39.如权利要求37所述的联合疫苗，其中所述第二疫苗组合物是选自由以下组成的组的疫苗:蜱传脑炎疫苗、日本脑炎疫苗以及落基山斑疹热疫苗。
40.如权利要求36所述的联合疫苗，其中所述第二疫苗组合物具有与针对疏螺旋体属感染或莱姆病的免疫相容的季节性免疫程序。
41.一种用于诱导受试者体内的免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤:向所述受试者施用有效诱导免疫反应的量的如权利要求28至34中任一项所述的组合物。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述免疫反应包括产生抗OspA抗体。
43.一种用于预防或治疗受试者体内的疏螺旋体属感染或莱姆病的方法，所述方法包括以下步骤:向所述受试者施用有效预防或治疗所述疏螺旋体属感染或莱姆病的量的如权利要求35或36所述的疫苗组合物。
44.一种抗体或其片段，其特异地结合如权利要求19至24中任一项所述的多肽。
45.一种用于预防或治疗受试者体内的疏螺旋体属感染或莱姆病的方法，所述方法包括以下步骤:向所述受试者施用有效预防或治疗所述疏螺旋体属感染或莱姆病的量的如权利要求44所述的抗体或其片段。
46.一种用于预防或治疗受试者体内的疏螺旋体属感染或莱姆病的方法，所述方法包括以下步骤:向所述受试者施用有效预防或治疗所述疏螺旋体属感染或莱姆病的量的抗体或其片段，所述抗体或 其片段是通过用如权利要求28至34中任一项所述的疫苗组合物使哺乳动物免疫来产生。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述抗体或其片段是高免疫血清、高免疫血浆或其纯化的免疫球蛋白部分。
48.一种用于被动地预防受试者体内的疏螺旋体属感染或莱姆病的方法，所述方法包括以下步骤:向所述受试者施用有效预防所述疏螺旋体属感染或莱姆病的量的抗OspA抗体或其片段，所述抗OspA抗体或其片段是通过用如权利要求28至34中任一项所述的疫苗组合物使哺乳动物免疫来产生，其中所述抗体或其片段是纯化的免疫球蛋白制剂或免疫球蛋白片段制剂。
49.一种用于预防受试者体内的疏螺旋体属感染或莱姆病的方法，所述方法包括以下步骤:向所述受试者施用有效预防所述疏螺旋体属感染或莱姆病的量的抗OspA单克隆抗体或其片段，所述抗OspA单克隆抗体或其片段是在用如权利要求28至34中任一项所述的疫苗组合物使受试者免疫之后产生。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述单克隆抗体或其片段是人源化的。
51.如权利要求49所述的方法，其中所述单克隆抗体是F237/BK2。
全文摘要
本发明涉及用于莱姆病或疏螺旋体病疫苗中的嵌合OspA分子的开发。更明确来说，所述嵌合OspA分子包含来自一个OspA血清型的近端部分连同来自另一个OspA血清型的远端部分，同时保留了这两个亲本多肽的抗原性质。所述嵌合OspA分子被单独或以组合形式递送以便提供针对多种疏螺旋体属同基因型种的保护。
文档编号C07K14/20GK103118701SQ201180033682
公开日2013年5月22日 申请日期2011年5月13日 优先权日2010年5月14日
发明者布莱恩·A·克洛维, 伊安·利维, 马里亚·欧洛尔科, 迈克尔·施文丁格, 约翰·J·杜恩, 本杰明·J·拉夫特 申请人:巴克斯特国际公司, 巴克斯特医疗保健股份有限公司, 纽约州立大学研究基金会, 布鲁克海文科学联合有限责任公司