蛋白质纯化的制作方法

专利名称：蛋白质纯化的制作方法
蛋白质纯化发明领域
本发明为蛋白质纯化领域。更具体地，其涉及用于纯化抗体片段的方法。
发明背景
对蛋白质进行大规模的经济型纯化已经成为生物技术工业中越来越重要的问题。 通常，蛋白质是由细胞培养物生产的，使用的是通过插入含有编码所述蛋白质的基因的重组质粒而工程改造为生产目的蛋白质的哺乳动物或细菌细胞系。由于所使用的细胞系为活的生物体，所以其必须以复杂的生长基质进行饲养，所述生长基质含有糖类、氨基酸，以及生长因子。必须将目的蛋白质从饲养给细胞的化合物的混合物中及从细胞自身的副产物 (原料流)中分离出来以达到可足够用于人类治疗剂的纯度。卫生当局对用于人类施用的蛋白质中原料流的杂质设立的标准非常高。本领域已知的许多用于蛋白质的纯化方法包括的步骤要求应用例如低或高pH、高盐浓度或其他可能不可逆地损害要纯化的蛋白质的生物学活性的极端条件，因此并不适合。所以，分离所需蛋白质达到足够的纯度提出了艰难的挑战。在历史上，认为蛋白质纯化方案是基于分子特性如大小、电荷及溶解性在要纯化的蛋白质与不期望的蛋白质污染物之间的差异。基于这些参数的操作流程包括大小排阻色谱、离子交换色谱、差异沉淀等等。
抗体及抗体片段在广泛的治疗领域中越来越重要。生产抗体、抗体片段的最重要的 方法之一是通过重组技术。这些技术使用宿主细胞表达所需的抗体或抗体片段，然后将其从生产基质中分离并进行纯化。
抗体需要进行糖基化，因此通常使用真核细胞在真核表达系统中表达，特别为哺乳动物细胞如CHO、PER. C6、NSO, BHK或Sp2/0细胞。在真核表达系统中，表达的目的蛋白质如抗体通常可分泌入细胞培养基质中。随后可容易地将基质与分泌蛋白质的细胞分离， 例如通过离心或过滤。
几乎所有目前的工业抗体纯化平台都使用了蛋白质A(例如在W098/23645中有所描述)。蛋白质A为在金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)这种细菌的细胞壁中发现的细胞表面蛋白质，其结合哺乳动物免疫球蛋白的Fe部分。蛋白质A对人IgG1和IgG2 有高亲和性，而对人IgM、IgA和IgE抗体具有中等的亲和性。因此，蛋白质A纯化不能很好地适合缺乏Fe部分的抗体片段。
不需要糖基化的蛋白质优选地是采用原核细胞如革兰氏阴性细菌在原核表达系统中表达的。特别地，不需要糖基化的抗体例如抗体片段如Fab、Fab’或scFv优选地在这种系统中表达。原核表达系统特别为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(大肠杆菌(E. coli))系统或其他革兰氏阴性细菌允许以有经济吸引力的方式制造不需要糖基化的蛋白质，例如抗体片段。在大肠杆菌中制造蛋白质是有益的，特别是因为物资成本较低，而药物开发进程更快(Humphreys, 2003; Humphreys, 2003)。原核表达系统,特别为大肠杆菌蛋白质表达系统在本领域已熟知(Swartz, 2001; Jana和Deb, 2005; Terpe, 2006)。原核细胞不会活性地分泌所述细胞中表达的异源目的蛋白质。然而可将革兰氏阴性原核细胞如大肠杆菌工程改造为异源蛋白质如抗体片段在细胞中表达并运出进入周质空间，在其中其能形成二硫键。将这些异源蛋白质从周质空间分离需要破坏原核细胞的外膜，这导致宿主蛋白质 (HCP)也基本上释放出来。用于破坏革兰氏阴性原核细胞的外膜并随后收获含有异源蛋白质的细胞培养液的方法在本领域已熟知。在大肠杆菌中制造抗体片段还导致副产物如截短的轻链、轻链的谷胱甘肽添加物及轻链二聚体的产生(Battersby等人，2001)。
从原核表达系统如大肠杆菌表达系统中收获的细胞培养液(原料流)，特别是来自革兰氏阴性细菌的周质细胞提取物与收获自真核表达系统的细胞培养液在HCP的相对量和组合、需要与表达于所述原核或真核表达系统中的目的异源蛋白质分离的细菌DNA和内毒素上有本质的差异。HCP的浓度及HCP的复杂度和异质性取决于表达系统或细胞系及细胞培养条件(Arunakumari, 2009)。表达于原核表达系统特别为革兰氏阴性原核表达系统的抗体片段的纯化因此面对着不同的一组挑战并需要不同的手段(Humphreys和 Glover, 2001)。单克隆抗体片段的纯化的基本原则在本领域已知(Spitali，2009)。目前有两种由美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)批准的包含抗体片段作为活性成分的医疗产品，所述抗体片段是在微生物细胞中生产的妥珠单抗(certolizumabpegol Γ Imzia li )包含了特异性结合TNF α的Fab,而雷珠单抗(ranibizumab,Lucentis * )为特异性结合血管内皮生长因子(vegf)的Fab片段。妥珠单抗从微生物原料流中的纯化是使用四步色谱的方法进行的(Walsh，2007)。医疗产品阿昔单抗 (abciximab, ReoFro")包括嵌合人_小鼠单克隆抗体7E3的Fab片段，其结合人血小板的糖蛋白(GP) Ilb/IIIa受体并抑制血小板聚集。所述嵌合7E3抗体是通过在哺乳动物细胞培养物中进行连续灌注生产的。在用木瓜蛋白酶和柱色谱后从纯化的全长抗体中获得48Kd 的Fab片段。
亲和色谱是基于目的蛋白质(或一组蛋白质)与偶联于色谱基质的特异配体之间的可逆的相互作用分离蛋白质的。目的蛋白质与偶联于色谱基质的特异配体之间的相互作用可为静电或疏水相互作用、范德华力和/或氢键键合的结果。为从亲和基质中洗脱靶标分子，所述相互 作用可被逆转，是特异性地使用竞争性配体或非特异性地通过改变pH、离子强度或剂型。亲和纯化需要能共价连接于色谱基质的生物特异性配体。偶联配体必须保留其特异性结合靶标分子的亲和性，且在洗涤去未结合材料后，配体和靶标分子之间的结合必须被逆转以使靶标分子以活性形式移除。尽管通常都会使用，但是亲和色谱很昂贵，尤其是在要纯化治疗性蛋白质的工业规模上。
离子交换色谱可用于纯化可电离分子。离子化分子是基于其带电基团与连接于固相支持介质的带相反电荷的分子之间的非特异性静电相互作用，由此滞留了与固相相互作用更强的离子化分子而分离的。每种类型的离子化分子的净电荷及其对基质的亲和性根据带电基团数、每种基团的电荷以及竞争与带电固相基质相互作用的分子性质而变化。这些差异使得离子交换色谱能分辨多种分子类型。结合于固相的分子的洗脱通常是通过增加缓冲液的离子强度(即，电导率)以与溶质竞争离子交换基质的带电位点而实现。改变pH并由此改变溶质电荷是另一种实现溶质洗脱的方式。电导率或PH的变化可为渐变(梯度洗脱) 或逐步的(分步洗脱)。已知的有两种常见的相互作用类型由带负电氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)侧链介导的阴离子交换色谱，其与带正电的表面相互作用，以及由带正电氨基酸残基(如赖氨酸和精氨酸)介导的阳离子交换色谱，其与带负电的表面相互作用。可将阴离子交换柱分类为弱或强。在弱的阴离子交换柱上的带电基团为弱碱，其会去质子化并因此在搞PH下丢失其电荷。二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素是一个弱阴离子交换剂的实例，其中氨基基团可在ρΗ 9下带正电，而在较高pH值下逐渐丢失其电荷。DEAE或二乙基-(2-羟-丙基)胺乙基(QAE)具有例如氯离子作为反荷离子。
通过增加洗脱缓冲液的离子强度(洗脱色谱)洗脱的备选方式是使用具有比结合蛋白质更高的对静止相的动态亲和性的分子进行洗脱。这种进行离子交换色谱的模型被称为取代色谱。取代色谱与任何其他的色谱模式有根本的不同，其中的溶质不是于流动相中解吸附并通过迁移速率的差异而分离的(Tugcu，2008)。在取代方法中，分子受到取代子分子的推进激波的力沿着色谱柱向下迁移，后者比原料流中任何组分对静止相的亲和力都高。此种推进的迁移导致产品浓度和纯度比其他操作模式更高。高滞留，随后有取代子溶液恒定灌注进入柱子。
动态结合能力描述的是在限定的流动条件下结合于柱中色谱树脂的目标蛋白质量。对色谱树脂的动态结合能力依赖于运行条件(例如，流动速率、pH和电导率)、样品来源、 样品制备及其他存在的结合杂质。动态结合能力是由加样含有已知浓度的目的蛋白质的样品并检测柱子流出液中浓度而确定的(Do等人，2008)。离子交换树脂的动态结合能力被限定为加样方法中目的蛋白质开始在流出液中恢复的点。通常，流出液中目的蛋白质为加样物中比例为10%的值用作这个点的限定量(McCue等人，2003)。为移除杂质，流出液中杂质的阈值是根据特异于应用的标准设定的。
W099/57134、W02004/024866 和 W02007/117490 涉及用于蛋白质或抗体纯化的方法，其包含离子交换色谱。使用生产于哺乳动物细胞的抗体对这些方法进行示例说明。 W02009/058812涉及用于抗体纯化的方法，其包含阳离子交换色谱。使用生产于哺乳动物细胞的抗体对这些方法进行示例说明。W02007/108955涉及用于蛋白质纯化的两步法非亲和离子交换色谱方法，其包含阳离子交换色谱随后进行离子交换 色谱。W02007/108955中的实施例描述了对生产于哺乳动物细胞的全长人抗体的纯化。在阳离子交换色谱中要进行多重洗涤步骤，在离子交换色谱之前要稀释洗脱物。Humphreys等人描述了使用阳离子交换色谱和离子交换色谱以在实验室规模上纯化了 Fab’(Humphreys等人，2004)。W02004/035792 涉及生成表达突变体PhoSa蛋白质的大肠杆菌菌株，以减少从细菌细胞培养物中纯化的抗体片段制备物中的PhoS蛋白质杂质。
CDP870为一种化学连接于PEG部分的遗传改造的抗体片段(Fab’)，如W001/94585 中描述的(以其全文通过引用并入本文)。⑶P870具有有效的人TNFa中和特性。
在本领域中需要方法以从收获自原核细胞特别是革兰氏阴性细菌如大肠杆菌表达系统的细胞培养液中纯化抗体片段。本领域特别需要方法以从收获自原核细胞特别是革兰氏阴性细菌如大肠杆菌表达系统的周质细胞提取物中纯化抗体片段，这些方法适合于操作含有非常高滴度的抗体片段或HCP或者抗体片段和HCP 二者的细胞提取物。抗体片段的高滴度表达需要适合用于以经济的方式纯化大量抗体片段的方法减少柱大小、缓冲液的使用及处理时间(GE Healthcare数据文件11-0025-76AE, 2007)。
发明概述
需要从细菌细胞培养物纯化的蛋白质和需要从真核细胞培养物中纯化的蛋白质的纯化要求和挑战有本质的差异。当蛋白质需要从革兰氏阴性细菌的周质细胞提取物中纯化时尤其面对了一些困难，这是因为例如存在一些量的细菌宿主细胞蛋白质。当蛋白质需要从表达很高浓度的异源蛋白质的革兰氏阴性细菌培养物中纯化时还有其他要困难要克服。
本发明者意外地发现了用于从周质细胞提取物中纯化抗体片段的新方法，其中所述方法对于包含高浓度的抗体片段的周质细胞提取物非常高效且合适。
在一方面。本发明提供了用于从周质细胞提取物中纯化抗体片段的方法，其包括捕获抗体片段的第一色谱步骤，其中含有抗体片段的混合物进行阳离子交换色谱并随后洗脱以产生含有所述抗体片段的第一洗脱物；以及第二色谱步骤，其中第一洗脱物进行阴离子交换色谱以捕获杂质并产生含有抗体片段的流出液，并回收所述抗体片段。
在另一方面，本发明提供了用于从周质细胞提取物中纯化抗体片段的方法，其基本上由以下步骤构成第一色谱步骤以捕获抗体片段，其中含有抗体片段的混合物进行阳离子交换色谱并随后洗脱以产生含有所述抗体片段的第一洗脱物；对第一洗脱物应用第一次超滤；第二色谱步骤，其中纯化的第一洗脱物进行阴离子交换色谱以捕获杂质并产生含有抗体片段的流出液；以及对流出液应用第二超滤方法，并回收所述抗体片段。
附图简述


图1显示了蛋白质(包含Fab’)的色谱图，这是通过阳离子交换色谱柱(Capto S ) 上第一次捕获步骤中随电导率(虚线)的UV光吸收值[以毫吸光度单位(mAU)测量](实线)而监测的。该色谱图显示了可向柱加样大体积，其中一些蛋白质不结合，随后使用电导率增加以小体积回收包括Fab’的结合的蛋白质。
图2显示了阴离子交换色谱柱(Capto Q )上进行的步骤中的色谱图。该色谱图显示了 Fab’不结合，并显示了其在加样后洗涤中与再生峰中回收的结合杂质一同出现。
图3显示了加样捕获物、洗脱捕获物及阴离子交换流出液的SDS-PAGE分析。
图4显示了蛋白质杂交，检测阴离子交换色谱前(泳道2)后(泳道3)的样品中存在的宿主细胞蛋白质。
图5显示了⑶P870的氨基酸序列。
序列简述
SEQ ID NO:1显示CDP870的CDRHl的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2显示CDP870的CDRH2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3显示CDP870的CDRH3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4显示CDP870的CDRLl的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5显示CDP870的CDRL2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6显示CDP870的CDRL3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7显示⑶P870的轻链可变区的核苷酸和预测氨基酸序列。
SEQ ID NO:8显示⑶P870的重链可变区的核苷酸和预测氨基酸序列。
SEQ ID NO: 9显示移植的抗-TNF a Fab的CDP870轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 10显示移植的抗-TNF a Fab的CDP870重链的氨基酸序列。
发明详述
在第一方面，本发明涉及用于从周质细胞提取物中纯化抗体片段的方法，其包括第一色谱步骤以捕获抗体片段，其中含有抗体片段的混合物如周质细胞提取物进行阳离子交换色谱并随后洗脱以产生含有抗体片段的第一洗脱物；以及第二色谱步骤，其中第一洗脱物进行阴离子交换色谱以捕获杂质并产生含有抗体片段的流出液，并回收所述抗体片段。
在第二方面，本发明提供了用于从周质细胞提取物中纯化抗体片段的方法，其基本上由以下步骤构成第一色谱步骤以捕获抗体片段，其中含有抗体片段的混合物如周质细胞提取物进行阳离子交换色谱并随后洗脱以产生含有所述抗体片段的第一洗脱物；对第一洗脱物应用第一次超滤；第二色谱步骤，其中纯化的第一洗脱物进行阴离子交换色谱以捕获杂质并产生含有抗体片段的流出液；以及对流出液应用第二超滤方法，并回收所述抗体片段。
在本发明第一方面的第一个实施方式中，根据本发明第一方面的方法只包括两个色谱步骤。
在本发明第二方面的第一个实施方式中，根据本发明第二方面的方法中阳离子交换色谱后的超滤及阴离子交换色谱后的超滤是通过正切流动过滤(TFF)进行的。
在本发明第一或第二方面的第二个实施方式中，在根据本发明第一或第二方面的第一个实施方式的方法中所有色谱步骤都是在色谱柱上进行的。
在本发明第一或第二方面的第三个实施方式中，在根据本发明第一或第二方面的第一或第二个实施方式的方法中第一色谱步骤中的阳离子交换色谱是以洗脱模式进行的。
在本发明第一或第二方面的第四个实施方式中，在根据本发明第一或第二方面的第二或第三个实施方式的方法中第一色谱步骤中的阳离子交换色谱按顺序包括以下步骤
a)将含有抗体片段的混合物如周质细胞提取物加样至阳离子交换柱，
b)用洗涤缓冲液洗涤阳离子交换柱，其中在洗涤期间洗涤缓冲液的电导率、pH和盐浓度不改变，以及
c)用洗脱缓冲液洗脱抗体片段。
在本发明第一或第二方面的第五个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第四个实施方式的方法中在第一色谱步骤前，洗涤缓冲液的PH与含有抗体片段的混合物如周质细胞提取物的PH相同。
在本发明第一或第二方面的第六个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四或第五个实施方式的方法中含有抗体片段的混合物如周质细胞提取物在第一色谱步骤前具有的PH为4. 0-5. 0，优选地pH为4. 3-4. 7，更优选地其pH为4. 3-4. 5， 最优选地为4. 5。
在本发明第一或第二方面的第七个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四、第五或第六个实施方式的方法中含有抗体片段并进行阳离子交换色谱(为初级捕获步骤)的混合物含有的总蛋白质浓度为至少1. 5g/L、或至少3g/L、或至少4g/L、或至少5g/L、或至少7. 5g/L、或至少10g/L或至少20g/L、或至少40g/L，浓度为 3-40g/L，或浓度为4-20g/L，或浓度为5_15g/L。
在本发明第一或第二方面的第八个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七个实施方式的方法中含有抗体片段并进行阳离子交换色谱(为初级捕获步骤)的混合物含有的抗体浓度为至少3g/L、或至少4g/L、或至少5g/L、或至少7. 5g/L、或至少10g/L或至少20g/L，或浓度为3_20g/L，或浓度为4_50g/L，或浓度为 5-10g/L。
在本发明第一或第二方面的第九个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八个实施方式的方法中初级捕获步骤的阳离子交换色谱进行的流速为至少300cm/h、优选地300-2000cm/h，更优选地350-1500cm/h、甚至更优选地 350-1000cm/h、最优选地 400_700cm/h。
在本发明第一或第二方面的第十个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九个实施方式的方法中初级捕获步骤的阳离子交换色谱进行的电导率为不超过6mS/cm、优选地为6_2mS/cm、更优选地为5-3mS/cm, 甚至更优选地为4. 5-3. 5mS/cm。
在本发明第一或第二方面的第i^一个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十个实施方式的方法中初级捕获步骤的阳离子交换色谱是在树脂上进行的，所述树脂包含偶联于本领域已知的合适材料的树脂的磺酰基、磺丙基或羧甲基，所述材料包括但不限于交联的、珠状琼脂糖(例如 Sepharose 或Superose )、修饰的甲基丙烯酸酯多聚物(例如触手状、轻基化)；二氧化娃； 陶土和苯乙烯二乙烯基苯。
在本发明第一或第二方面的第十二个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第十一个实施方式 的方法中初级捕获步骤的阳离子交换色谱的树脂对抗体片段的动态结合能力为至少50g/L树脂、或至少60g/L树脂、或至少75g/L树脂、或至少150g/L树脂、或为50-150g/L树脂，或为60-100g/L树脂，或为50_75g/L树脂。
在本发明第一或第二方面的第十三个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第十一或第十二个实施方式的方法中初级捕获步骤的阳离子交换色谱的树脂平均颗粒尺寸为至少50 μ m，优选地为60-300 μ m、更优选地为70-200 μ m、甚至更优选地为80-100 μ m。
在本发明第一或第二方面的第十四个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二或第十三个实施方式的方法中进行初级捕获步骤中的阳离子交换色谱的含有抗体片段的混合物含有的细菌宿主细胞蛋白质的量为大约200 μ g/ml-10, 000 μ g/ml、大约500 μ g/ml-5000 μ g/ml、大约 1000 μ g/ml-4000 μ g/ml 或大约 2000 μ g/ml-4000 μ g/ml。
在本发明第一或第二方面的第十五个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四个实施方式的方法中初级捕获步骤的阳离子交换色谱中，加样5-100g抗体片段每升树脂、10-9g抗体片段每升树脂或20-75g抗体片段每升树脂。
在本发明第一或第二方面的第十六个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四或第十五个实施方式的方法中第二色谱步骤的阴离子交换色谱是在树脂上进行的，所述树脂包含偶联于本领域已知的合适材料的树脂的季铵(Q)、二乙氨乙基(DEAE)或三甲胺乙基 (TMAE),所述材料包括但不限于交联的、珠状琼脂糖(例如Sepharose 或Superose )、修饰的甲基丙烯酸酯多聚物(例如触手状、羟基化)；二氧化硅；陶土和苯乙烯二乙烯基苯。第二色谱步骤也可在膜上进行，其包含偶联于本领域已知的合适的材料的膜的季铵或聚(烯丙胺)，所述材料包括但不限于纤维素和聚乙烯。
在本发明第一或第二方面的第十七个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五或第十六个实施方式的方法中第二色谱步骤的阴离子交换色谱柱具有的平均颗粒尺寸为至少50 μ m、优选地为60-300 μ m，更优选地为70-200 μ m，甚至更优选地为 80-100 μ mD
在本发明第一或第二方面的第十八个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六或第十七个实施方式的方法中第二色谱步骤的阴离子交换色谱进行的PH为6-10、优选地其pH为7-9、更优选地其pH为8_9、甚至更优选地其pH为8. 5。
在本发明第一或第二方面的第十九个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七或第十八个实施方式的方法中进行的第二色谱步骤的阴离子交换色谱具有对方法相关杂质的结合能力为大于20g/L树脂、优选地大于30g/L树脂、甚至更优选地大于40g/L树脂，或20-80g/L树脂，或为20-40g/L树脂。
在本发明第一或第二方面的第二十个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八或第十九个实施方式的方法不包括高效正切流动过滤(HPTFF)步骤。
在本发明第一或第二方面的第二 i^一个实施方式中，根据本发明第一或第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九或第二十个实施方式的方法中回收的抗体片段含有的宿主细胞蛋白质(HCP)的量不超过百万分之150 (ppm)、或不超过120ppm或不超过 IOOppm0
在其他实施方式中，根据本发明第一或第二方面的任何实施方式的方法中的抗体片段为Fab、Fab’、F (ab’)2、Fv、scFv或骆驼科抗体。
如本文所使用的，术语“亲和色谱”指代一项蛋白质分离技术，其中目的蛋白质或目的抗体可逆并特异地结合于生物特异配体。优选地，所述生物特异配体共价连接于色谱固相材料并在溶液接触色谱固相材料时能接触溶液中的目的蛋白质。目的蛋白质(例如， 抗体)在色谱步骤中保留其对所述生物特异配体(例如抗原、底物、辅因子或急速)的特异性结合亲和性，而混合物中的其他溶质和/或蛋白质与配体的结合并不显著或特异。目的蛋白质对固定化配体的结合使得污染性蛋白质或蛋白质杂质穿过色谱基质而目的蛋白质仍然特异性结合于固相材料上的固定化配体。然后采用低pH、高pH、高盐、竞争性配体等等将特异性结合的目的蛋白质从固定化配体上以活性形式移除，并用洗脱缓冲液使其穿过色谱柱，不含污染性蛋白质或蛋白质杂质，后者早先已从柱子中流穿。任何物质都可用作纯化其相应的特异性结合蛋白质(例如抗体)的配体。
术语“无糖基化的”和“非糖基化的”在本文交换使用，指的是缺乏糖基-或碳水化合物部分向蛋白质如抗体的特异性翻译后添加。
如本文所使用的，术语“抗体”或“多种抗体”指代包含两条重链和两条轻链的单克隆或多克隆四聚物全长抗体。术语免疫球蛋白或多种免疫球蛋白在本文分别与“抗体”或 “多种抗体”以同义使用。如本文使用的，术语“抗体”或“多种抗体”包括但不限于由本领域已知的重组技术生产的重组抗体。“抗体”或“多种抗体”可以为任何来源，包括从哺乳动物种属如人、非人灵长类(例如黑猩猩、狒狒，恒河猴和食蟹猴)、啮齿类(如小鼠，大鼠，兔或豚鼠)、山羊、牛、马种属。本文的抗体针对的是目的“抗原”。优选地，所述抗原为生物学上重要的多肽，并且对患有某种疾病或障碍的哺乳动物施用所述抗体可在所述哺乳动物中产生治疗益处。然而，针对非多肽抗原的抗体也在预期之内。当抗原是多肽时，其可为跨膜分子(例如受体)或配体如生长因子或细胞因子。本发明范围内的抗体的优选的分子靶标包括 CD 多肽如 CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD38、CD40 和 CD40-L ；FcRN ；0X40 ;HER 受体家族成员如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子如LFA-1、Macl、pl50，95、 ￥1^-4、1041-1、￥0411和&￥/133整合素，包括其α或β亚基(例如，抗-CDlla、抗-CD18或抗-⑶IIb抗体)；趋化因子和细胞因子或其受体如IL-1 α和β、IL-2、IL_6、IL-6受体、 IL-12、IL-13、IL-17BS、IL-18、IL-21、IL-23、TNFa 和 TNFP ;生长因子如 VEGF ;IgE ;血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(( )受体;mpl受体；CTLA-4 ;多肽C等。
如本文所使用的，术语“抗体片段”或“多种抗体片段”指代无糖基化抗体或抗体的无糖基化部分，通常是其抗原结合或可变区域。抗体片段的实例包括缺少或不具有Fe部分的任何抗体。抗体片段的实例还包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和scFv片段；双价抗体； 三价抗体；四价抗体；微小抗体；基本上由单个、两个或三个免疫球蛋白结构域构成的抗体如Domain Antibodies ;单链抗体；以上任何抗体的双特异性、三特异性、四特异性或多特异性变体。如本所使用的，术语“抗体片段”或“多种抗体片段”还指的是骆驼抗体(例如来自骆骑或美洲骑如Nanobodies )及其衍生物。抗体片段在本领域已熟知(Holliger 和Hudson, 2005)。已经开发了多种技术用于生产抗体片段,这些在本领域已知(Glover和 Humphreys, 2004)。如本文所使用的，术语“抗体片段”或“多种抗体片段”包含人、人源化、 灵长类化及嵌合抗体片段。
如本文所使用的，术语“缓冲液”指的是一种物质，其存在于溶液中能增加必须要添加的酸或碱的量以引起PH的单位变化。缓冲的溶液能抵抗其酸碱缀合物组分起作用造成的PH的变化。与生物学反应剂一同使用的经缓冲溶液通常能够维持氢离子的恒定浓度以使溶液的PH在生理范围内。传统缓冲液组分包括但不限于有机和无机盐类、酸和碱。
如本文所使用的，术语“色谱”指一种方法，由此可通过混合物中各种溶质在流动相的影响下迁移穿过静止基质的速率差异或在结合和洗脱方法中的速率差异，将混合物中目的物质与混合物中其他物质相分离。
如本文所使用的，与色谱相关的术语“色谱柱”或“柱子”指代常常为圆柱或空心柱形的容器，其填充有色谱介质或树脂。所述色谱介质或树脂是提供了用于纯化的物理和 /或化学特性的材料。
如本文所使用的，术语“导电率”指代水溶液在两个电极间传导电流的能力。在溶液中，电流是通过离子传输流动的。因此，水溶液中离子量越多，溶液具有的导电率越高。导电率的测量单位是毫西门子每厘米(mS/cm)，可使用导电率计而测量。溶液的导电率可通过改变其中离子浓度而改变。例如，可改变溶液中缓冲试剂浓度和/或盐(如NaCl或KCl)浓度以达到所需的导电率。
如本文所使用的，术语“洗脱物”指代包含特定物质(如抗体片段或污染性物质)的液体组合物，这是在所述物质结合于色谱材料并添加洗脱缓冲液将该物质从色谱材料中解离后得到的。在纯化步骤相关时可提到洗脱物。例如，术语“第一洗脱物”指代第一色谱步骤的洗脱物；术语“第二洗脱物”指代第二色谱步骤的洗脱物，等等。
如本文所使用的，术语“流出液”指代包含特定物质(如抗体片段或污染性物质)的液体组合物，这是将包含所述物质的混合物通过色谱材料使所述分子经过所述材料而不结合得到的。
如本文所使用的，术语“混合物”指代一种至少部分液体的组合物，其包含至少一种试图从其他也可能存在的物质中纯化出的目的抗体片段。混合物可为例如悬液、水溶液、 有机溶剂系统或水/有机溶剂混合物或溶液。这些混合物经常为包含很多生物学分子(如蛋白质、抗体、激素和病毒)、小分子(如盐类、糖类、脂类等等)及甚至颗粒物质的复合混合物或溶液。虽然典型的生物来源混合物开始为水溶液或悬液，但是其也可含有在更早制备步骤如溶剂沉淀、萃取等中使用的有机溶剂。
如本文所使用的，术语“周质细胞提取物”指代破坏外膜并从周质空间释放材料后，从革兰氏阴性原核细胞的细胞培养物中获得的组合物。周质细胞提取物常常为液体的， 也可含有颗粒物质或气体。术语“周质细胞提取物”也包括这样的液体组合物，其在从周质空间收集后可能受到其他处理，如，移除了不可溶材料。

术语“纯化”或“精制”或“纯化的”指代一种方法，其中从含有目的蛋白质如抗体或抗体片段的混合物中，移除或减少不期望的物质如HCP、DNA或盐类。“纯化步骤”可为总体纯化方法中部分，此步骤中产生“均一的”组合物，后者在本文用于指代组合物，其在包含目的蛋白质的组合物中包含少于150ppm HCP，备选地少于120ppm、少于lOOppm、少于90ppm、 少于80ppm、少于70ppm、少于60ppm、少于50ppm、少于40ppm、少于30ppm、少于20ppm、少于 lOppm、少于5ppm或少于3ppm。
如本文所使用的，术语“超滤”指代一种压力驱动的方法，其中混合物如溶液(其含有例如目的蛋白质)穿过膜用于浓缩或纯化目的。超滤膜通常具有的平均孔径大小为 l-50nm，这介于反向渗透和微滤膜的平均孔径大小之间。孔径大小通常是通过其滞留特定分子量的蛋白质的能力定量的，一般以标称的分子量(kD)截断(NMWCO)表示。超滤基于不同物质响应给定压力驱动力并穿过膜时过滤速率的差异分离溶质，所述速率取决于溶质大小。因此，混合物或溶液中的溶质是基于大小差异而分离的。超滤常常在下游加工中使用以进行蛋白质浓缩、缓冲液交换及脱盐、蛋白质纯化、病毒清除及澄清方法。术语“超滤”包括正切流动过滤(TFF)，混合物如溶液水平沿着超滤膜穿过。术语“超滤”不包括高效正切流动过滤(HPTFF)，其中溶质不仅是基于尺寸，而是基于尺寸和电荷而分离的。
如本文所使用的，术语“总蛋白质”基本上指代样品中所有蛋白质，包括任何大小的蛋白质片段。经常在与周质细胞提取物或其他细胞培养收获物相关时，“总蛋白质”指代样品中包含的细胞培养物表达的HCP和异源蛋白质二者。可以使用本领域已知的方法确定总蛋白质
可根据本发明的方法纯化的抗体片段能够通过培养经转化具有一种或多种编码所述重组抗体片段的表达载体的宿主细胞而生产。所述宿主细胞优选地为原核细胞，优选地为革兰氏阴性细菌。更优选地，宿主细胞为大肠杆菌(E. coli)细胞。用于蛋白质表达的原核宿主细胞在本领域已熟知(Terpe，2006)。宿主细胞为遗传改造为生产目的蛋白质如抗体片段的重组细胞。重组大肠杆菌宿主细胞可来源于任何适合的大肠杆菌菌株，包括来源 iMC4100、TGl、TG2、DHB4、DH5a、DHl、BL21、K12、XLlBlue 和 JM109。一个实例为大肠杆菌菌株W3110(ATCC27，325)，一种通常用于重组蛋白质发酵的宿主菌株。抗体片段还可通过培养修饰的大肠杆菌菌株例如代谢突变体或蛋白酶缺陷大肠杆菌菌株而生产。
可根据本发明的方法纯化的抗体片段通常存在于大肠杆菌宿主细胞周质或宿主细胞培养物上清中，取决于蛋白质的性质、生产规模以及所使用的大肠杆菌菌株。用于将蛋白质革巴向这些区室的方法在本领域已熟知(Makrides, 1996)。将蛋白质导向大肠杆菌周质的合适的信号序列实例包括大肠杆菌？1104、011^^、011^|1\]^11]113和OmpF信号序列。将蛋白质革巴向上清的方式可依赖于天然分泌途径或通过诱导诱导外膜的限制性渗漏引起蛋白质分泌， 实例有使用PelB先导序列，蛋白质A先导序列，细菌素释放蛋 白质、丝裂霉素诱导的细菌素释放蛋白质的共表达同时向培养基添加甘氨酸，以及共表达kil基因用于细胞膜透化。最优选地，在本发明的方法中，重组蛋白质表达于宿主大肠杆菌周质。
重组蛋白质在大肠杆菌宿主细胞中的表达还可受到可诱导系统的控制，其中重组抗体在大肠杆菌中的表达受到可诱导启动子的控制。很多适合用于大肠杆菌的可诱导启动子在本领域已熟知并取决于启动子；重组蛋白质的表达可由多种因子诱导，如温度或具体物质在生长基质中的浓度。可诱导启动子的实例包括大肠杆菌lac、tac和trc启动子,其是乳糖或不可水解的乳糖类似物、异丙基-b-D-Ι-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导的，以及phoA,、trp和araBAD启动子,其分别是由磷酸、色氨酸和L-阿拉伯糖可诱导的。表达可由例如添加诱导子或温度的变化(其中的诱导依赖于温度)而诱导。当重组蛋白质的诱导是通过向培养物中添加诱导子而实现时，诱导子可通过任何适合的方法添加，这取决于发酵系统和诱导子，例如诱导子可通过单一或多次添加通过通过饲料逐渐添加。清楚的是，在诱导子的添加和蛋白质表达的实际诱导逐渐可能有延迟，例如在诱导子是乳糖时，在蛋白质表达的诱导发生前可能有延迟，此时任何预先存在的碳源都在乳糖之前被利用。
大肠杆菌宿主细胞培养物(发酵物)可在任何支持大肠杆菌生长及重组蛋白质表达的基质中培养。所述基质可为化学限定基质如(Durany O, 2004)描述的。
大肠杆菌宿主细胞的培养可在任何合适的容器中发生，如摇瓶或发酵罐，这取决于所需要的生产规模。有多种可用的大规模发酵罐，容积为超过1，000升-约100，000升。 优选地，使用的是1，000-50, 000升的发酵罐，更优选地为1，000-10, 000或12，000升。也可使用较小规模的发酵罐，容积为O. 5-1，000升。
大肠杆菌的发酵可在任何合适的系统中进行，例如连续、分批或补料分批的形式， 这取决于所需的蛋白质和产量。使用分批形式时，营养物或诱导子(需要时)一次加入。备选地，可使用补料分批培养，诱导前的培养物可在分批形式中以最大特异生长速率而生长， 该速率可使用发酵罐中起始存在的营养物及用于控制生长速率的一种或多种营养给料方案维持直到发酵完成。补料分批形式还可使用诱导前以控制大肠杆菌宿主细胞的新陈代谢并使之达到更高的细胞密度。
如果需要，可从发酵基质中收集宿主细胞,例如,可通过离心、过滤或浓缩从样品中收集宿主细胞。特别，本发明的方法适合进行治疗性品质的抗体的大规模工业制造。
在一个实施方式中，根据本发明的方法包括在阳离子交换色谱捕获步骤前离心细胞培养收获物，并在随后添加提取缓冲液悬起宿主细胞的步骤。
对于其中目的蛋白质如抗体片段存在于宿主细胞的周质空间的大肠杆菌发酵方法，需要从宿主细胞中释放所述蛋白质。所述的释放可通过任何合适的方法达到，如进行细胞裂解，这可通过机械或压力处理、冻融处理、渗透压冲击、提取试剂或热处理而进行。这些用于蛋白质释放的提取方法在本领域已熟知。
在一个优选的实施方式中，先将提取缓冲液加入样品，然后对样品进行热处理步骤。该热处理步骤优选地为如US5，655，866中详述的。热处理步骤通过促进其他抗体相关材料的移除使得能够获得可溶的、正确折叠和装配的抗体片段的样品。
热处理步骤是通过使样品经受所需的升高的温度而进行。最优选地，热处理步骤是在30°C -70°C的范围内进行的。温度的选择可根据需要并取决于用于纯化的抗体的稳定性。在另一个实施方式中，温度在40°C _65°C的范围内，或优选地在40°C -60°C的范围内，更优选地在45 V -60 °C的范围内，甚至更优选地在50 V -60 °C的范围内，最优选地为 550C -600C>580C -60°C或59°C。因此，最低温度为30°C、35°C或40°C而最高温度为60°C、 65°C或 70°C。
优选地，热处理步骤是在长期的时间段内进行。热处理的时间长度优选地为1-24 小时，更优选地为4-18小时，甚至更优选地为6-16小时，最优选地为10-14小时或10-12 小时，例如为12小时。因此，热处理的最短时间为1、2或3小时，而最长为20、22或24小时。
在一个具体的实施方式中，在50°C _60°C下进行10-16小时的热处理，更优选地为在59°C下进行10-12小时。本领域技术人员会理解选择温度和时间的以适合要处理的样品及生产中的抗体的特征。
在提取步骤后，含有目的蛋白质如抗体片段的混合物可进行离心步骤和/或过滤，之后再进行PH调整步骤。
在其他实施方式中，根据本发明第一或第二方面的任何实施方式的方法是对抗体片段进行的，例如Fab或s Fab’，其特异性结合VEGF-A、糖蛋白Ilb/IIIa受体、C5、HER2/ neu、TNF a、ILl β、CD40-L、0X40 或 ICOS。
在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明第一或第二方面的任何实施方式的方法是对包含抗体片段的周质细胞提取物进行的，所述抗体片段是对人TNFa具有特异性的抗体，更优选地其为W001/094585(其内容通过引用并入本文)中所描述的⑶P870。
在一个实施方式中，具有对人TNFa的特异性的抗体片段包含重链，其中可变结构域包含的⑶R具有SEQ ID NO:1中所示的⑶RHl的序列、SEQ ID NO: 2中所示的⑶RH2序列或SEQ ID NO:3中所示的CDRH3序列。
在一个实施方式中，所述抗体片段包含的⑶R具有SEQ ID N0:4中所示的⑶RLl 的序列、SEQ ID NO: 5中所示的CDRL2序列或SEQ ID NO:6中所示的CDRL3序列。
在一个实施方式中，所述抗体片段包含具有SEQ ID NO:1中所示的⑶RHl的序列、 SEQ ID N0:2中所示的CDRH2序列或SEQ ID NO: 3中所示的CDRH3序列的CDR以及具有SEQ ID N0:4中所示的CDRLl的序列、SEQ ID NO:5中所示的CDRL2序列或SEQ ID N0:6中所示的⑶RL3序列的⑶R。
在一个实施方式中，所述抗体片段包括SEQ ID NO:1的CDRHl、SEQ ID N0:2的CDRH2、SEQ ID NO: 3 的 CDRH3、SEQ ID N0:4 的 CDRL1、SEQ ID NO: 5 的 CDRL2 及 SEQ ID NO: 6 的 CDRL3。
所述抗体片段优选地为CDR-移植抗体片段分子，并且通常可变结构域包含人受体骨架区及非人的供体CDR。
优选地，所述抗体片段包含轻链可变结构域⑶P870 (SEQ IDNO: 7)及重链可变结构域 CDP870(SEQ ID NO:8)
优选地，抗体片段为修饰的Fab片段，其中的修饰为向其重链C-末端添加一个或多个氨基酸以使效应子或报告子分子能连接上。优选地，所添加的氨基酸形成了修饰的铰链区域，其含有一个或两个效应子或报告子分子可连接的半胱氨酸残基。这样一种修饰的 Fab片段优选地具有的重链包含如SEQ ID NO: 10给出的序列或由其构成的重链，和如SEQ ID N0:9给出的序列或由其构成的轻链。
在其他实施方式中，根据本发明第一或第二方面的任何实施方式的方法是使用阿昔单抗、雷珠单抗、培克珠单抗、⑶P484或⑶P7657而进行。
在本发明的其他实施方式中，用于初级捕获步骤的阳离子交换色谱是用合适组合的阴离子缓冲液平衡并缓冲在所需PH和导电率(例如pH5的50mM醋酸钠或pH4. O的50mM 醋酸钠)。平衡可使用至少2倍柱体积的平衡缓冲液完成，但也可包括两步平衡方法，其在至少2倍柱体积平衡缓冲液后还使用了两倍柱体积的含有IM NaCl的缓冲液(以确保柱子上带上了充足的相关的抗衡阳离子)。
在本发明的其他实施方式中，第二色谱步骤的阴离子交换色谱是以相同方式平衡的，只是其中的平衡缓冲液理想地为阳离子缓冲液如PH8. O的20mM Tris HCl或pH7. O的 20mM bis-Tris HCl0阴离子交 换色谱柱的平衡也可使用两步平衡方法完成，其在平衡缓冲液后使用含有IM NaCl的缓冲液(以确保柱子上带上了充足的相关的抗衡阴离子)；或直接使用平衡缓冲液进行单一步骤完成。
在本发明的其他实施方式中，对阳离子交换色谱柱加样进行初级步骤后，以至少2 倍柱体积的平衡缓冲液洗涤。使用更高导电率如O. 5mScm或再更高导电率的洗涤缓冲液可移除其他杂质。
在本发明的其他实施方式中，对阴离子交换色谱柱加样进行第二色谱步骤后，以多至2倍柱体积的平衡缓冲液洗涤。也可使用具有相似pH和导电率的其他缓冲液。如果需要最大量地移除方法相关杂质，则不推荐使用具有更高导电率的缓冲液。
洗脱
在本发明的其他实施方式中，使用更高pH、更高导电率或二者组合的缓冲液将抗体从初级捕获步骤中阳离子交换色谱柱上洗脱。可向平衡缓冲液中添加NaCl (或其他盐类)达到超过50mM的浓度、优选地超过IOOmM,甚至更优选地超过200mM而实现增加的导电率。
在本发明其他实施方式中，抗体从第二色谱步骤中阴离子交换色谱上的洗脱发生于加样和洗涤步骤中。所结合的方法相关杂质可使用更低pH、更高导电率或二者组合的缓冲液进行洗脱。理想地，所述更高导电率应当为至少70mS/cm。
在对本发明进行完全描述后，本领域技术人员清楚的是，相同的步骤可在广泛的等价参数、浓度和条件范围内进行而不偏离本发明的精神和范围，也无需过度试验。尽管本发明是与其特定实施方式相关而描述的，然而要理解的是其能进行其他的修饰。本申请意欲涵盖本发明的任何变动、用途或改良，通常只要其遵循本发明的原则并且所包括的这些与本公开的偏离之处是在本发明涉及的领域中的已知或习惯的实践方式之内，并可应用于本文前面提出的关键特征，且在附随的权利要求范围之内。
如本文所使用的，“一”或“一个”指的是一个或多个。虽然本公开支持仅仅指代备选项的一项定义以及“和/或”，但是术语“或”在本文的用途时用于指代“和/或”，除非有明确的表示其只指代备选项，或备选项是相互排斥的。如本文所使用的，“另一个”可只至少第二个或更多。
如本文所使用的，“X-Y之间”可指代包括X和Y的范围。
本文引用的所有参考文献，包括期刊文章或摘要、发表或未发表、美国或外国专利申请、发行的美国或外国专利或任何其他参考文献都以其全文通过引用并入本文，包括所引用参考文献中提出的所有数据、表格、附图及文字。此外，本文引用的参考文献之内引用的参考文献的全部内容也以其全文通过引用而并入。
对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的参考不以任何方式承认本发明的任何方面、描述或实施方式已在相关领域中公开、教授或提出。实施例
实施例1
CDP870Fab’以1.9g/L的浓度在大肠杆菌W3110宿主细胞中作为异源蛋白质表达。 通过添加Tris-EDTA并在5 0°C下进行热处理将该异源蛋白质从宿主细胞的周质空间释放出来。通过离心移除细胞材料，通过添加醋酸调整含有异源蛋白质的细胞提取物至PH4. 5。 然后使用离心及O. 2 μ m滤膜的深层过滤的组合对经pH调整的细胞提取物进行澄清。
对澄清的提取物(原料流)用水进行稀释系数为4的稀释，达到导电率为3. 5mS/ cm。
然后将含有⑶P870Fab’的原料流以400cm/h的流速加样至大约75g/L树脂，在来自GE Healthcare的Capto S 阳离子交换柱上[高交联刚性琼脂糖凝珠(平均颗粒大小为 90 μ m)，具有经葡聚糖连接子连接的磺酸盐阳离子交换配体(离子容量为O. 11 - O. Hmmol NaVml) ] 0 Capto S 阳离子交换柱的柱床高度为20cm，直径为7. 7mm。在原料流加样之前， 用6倍柱体积的以醋酸调整到pH4. 5的50mM醋酸钠缓冲液进行柱平衡。
在加样后，用5倍柱体积的以醋酸调整到pH4. 5的50mM醋酸钠缓冲液洗涤柱子， 直到洗去所有未结合材料。CDP870Fab’级分是以20倍柱体积的缓冲液洗脱的，其梯度浓度高至50mM醋酸钠和250mM NaCl,以醋酸调整至pH4. 5。当280nm处的UV吸收值超过O. 26AU/ cm时收集洗脱的⑶P870Fab’，直到其降至O. 54AU/cm以下。
将⑶P870Fab’混合物在离心浓缩机中进行超滤，使用标注截断分子量为IOkDa的聚醚砜基的超滤膜，产生的⑶P870Fab’混合物的浓度为6mg/mL。随后进行透析，直到20mM Tris中的CDP870Fab’混合物达到pH8. O及导电率1. lmS/cm。透析需要6倍体积的缓冲液。
将CDP870Fab’混合物以500cm/h的流速加样至来自GE Healthcare的Capto Q 阴离子交换色谱柱[高交联刚性琼脂糖凝珠(平均颗粒大小为90 μ m)，具有经葡聚糖连接子连接的季铵盐阴离子交换配体(离子容量为O. 16 - O. 22mmol CF/ml)]，并对每升树脂应用大约5g的⑶P870Fab’。Capto Q 阴离子交换柱的柱床高度为10cm，直径为7. 7mm。在阴离子交换色谱步骤之前，用3倍柱体积的以盐酸调整到pH8. O的20mM Tris/1M NaCl缓冲液及5倍柱体积的以盐酸调整到pH8. O的20mM Tris缓冲液进行柱平衡。
然后用5倍柱体积的平衡缓冲液洗涤柱子以回收⑶P870Fab’。
当加样开始后很短时间内280nm处的UV吸收值超过O. 5AU/cm时，收集 ⑶P870Fab’部分。在洗涤期间，当UV吸收值降到O. 5AU/cm以下时终止对此级分的收集。 此步骤中抗体片段产量为90. 5%。
实施例2
⑶P870Fab’以1. 9g/L的浓度在大肠杆菌宿主细胞中作为异源蛋白质表达。通过添加Tris-EDTA并在50°C下进行热处理将该异源蛋白质从宿主细胞的周质空间释放出来。 通过离心移除细胞材料，通过添加醋酸调节含有异源蛋白质的细胞提取物至PH4. 5。然后使用离心及O. 2 μ m滤膜的深层过滤的组合对经pH调整的细胞提取物进行澄清。
对澄清的提取物(原料流)用水进行稀释系数为4的稀释，达到导电率为3. 5mS/ cm。
然后将含有⑶P870Fab’的原料流以300cm/h的流速加样至大约51g/L树脂，在来自GE Healthcare的Capto S阳离子交换柱上[高交联刚性琼脂糖凝珠(平均颗粒大小为 90 μ m)，具有经葡聚糖连接子连接的磺酸盐阳离子交换配体(离子容量为O. 11 - O. Hmmol NaVml) ] 0 Capto S阳离子交换柱的柱床高度为20cm，直径为16mm。在原料流加样之前，用 3倍柱体积的以醋酸调整到pH4. 5的50mM醋酸钠/IM N aCl缓冲液，并随后使用4倍柱体积的以醋酸调整到PH4. 5的50mM醋酸钠缓冲液进行柱平衡。
在加样后，用6倍柱体积的以醋酸调整到pH4. 5的50mM醋酸钠缓冲液洗涤柱子， 直到洗去所有未结合材料。⑶P870Fab’级分是以多至8倍柱体积的以醋酸调整至pH4. 5的 50mM醋酸钠和200mM NaCl缓冲液洗脱的。当280nm处的UV吸收值超过O. 5AU/cm时，收集洗脱的CDP870Fab’，直到其降至O. 5AU/cm以下。
将⑶P870Fab’混合物在离心浓缩机(Amicon)中进行超滤，使用标注截断分子量为IOkDa的聚醚砜基的超滤膜，产生的⑶P870Fab’混合物的浓度为18mg/mL。随后进行透析，直到20mM Tris中的CDP870Fab’混合物达到pH8. 3及导电率1. OmS/cm。透析需要6倍体积的缓冲液。
将CDP870Fab’混合物以250cm/h的流速加样至来自GE Healthcare的Capto Q 阴离子交换色谱柱[高交联刚性琼脂糖凝珠(平均颗粒大小为90 μ m)，具有经葡聚糖连接子连接的季铵盐阴离子交换配体(离子容量为O. 16 - O. 22mmol CF/ml)]，并对每升树脂应用大约30g的⑶P870Fab’。Capto Q 阴离子交换柱的柱床高度为10cm，直径为7. 7mm。在阴离子交换色谱步骤之前，用3倍柱体积的以盐酸调整到pH8. 3的20mM Tris/1M NaCl缓冲液及5倍柱体积的以盐酸调整到pH8. 3的20mM Tris缓冲液进行柱平衡。
然后用5倍柱体积的平衡缓冲液洗涤柱子以回收⑶P870Fab’。
当加样开始后很短时间内280nm处的UV吸收值超过O. 5AU/cm时，收集 ⑶P870Fab’级分。在洗涤期间，当UV吸收值降到2. OAU/cm以下时，终止对此级分的收集。
实施例3
⑶P870Fab’以2. 5g/L的浓度在大肠杆菌宿主细胞中作为异源蛋白质表达。通过添加Tris-EDTA并在50°C下进行热处理将该异源蛋白质从宿主细胞的周质空间释放出来。 通过离心移除细胞材料，通过添加醋酸调整含有异源蛋白质的细胞提取物至PH4. 5。然后使用离心及O. 2 μ m滤膜的深层过滤的组合对经pH调整的细胞提取物进行澄清。
对澄清的提取物(原料流)用水进行稀释系数为4的稀释，达到导电率为4. OmS/ cm。
然后将含有⑶P870Fab’的原料流以400cm/h的流速加样至大约60g/L树脂，在来自GE Healthcare的Capto S阳离子交换柱上[高交联刚性琼脂糖凝珠(平均颗粒大小为 90 μ m)，具有经葡聚糖连接子连接的磺酸盐阳离子交换配体(离子容量为O. 11 - O. Hmmol NaVml) ] 0 Capto S阳离子交换柱的柱床高度为24cm，直径为20cm。在原料流加样之前，用 3倍柱体积的以醋酸调整到pH4. 5的50mM醋酸钠/IM NaCl缓冲液，并随后使用4倍柱体积的以醋酸调整到PH4. 5的50mM醋酸钠缓冲液进行柱平衡。
在加样后，用6倍柱体积的以醋酸调整到pH4. 5的50mM醋酸钠缓冲液洗涤柱子， 直到洗去所有未结合材料。⑶P870Fab’级分是以多至5倍柱体积的以醋酸调整至pH4. 5的 50mM醋酸钠和250mM NaCl缓冲液洗脱的。当280nm处的UV吸收值超过1. 75AU/cm时，收集洗脱的CDP870Fab’，直到其降至O. 55AU/cm以下。
然后然后使用O. 4m2的标注截断分子量为IOkDa的聚醚砜膜(PalllOk Omega Centramate T-Series)以正切流动模式对CDP870Fab’进行超滤。CDP870Fab’被浓缩到 51mg/mL,之后以5. 8倍体积的20mM Tris pH8. 5进行透析,直到Fab’溶液的pH为ρΗ8· 5 且导电率为O. 8mS/cm。将Fab’从超滤装置中回收，并使用600mL的20mM Tris pH8. 5缓冲液从系统中洗涤任何残留的Fab’将其合并。
将CDP870Fab’混合物以200cm/h的流速加样至来自GE Healthcare的Capto Q 阴离子交换色谱柱[高交联刚性琼脂糖凝珠(平均颗粒大小为90 μ m)，具有经葡聚糖连接子连接的季铵盐阴离子交换配体(离子容量为O. 16 - O. 22mmol CF/ml)]，并对每升树脂应用大约37g的CDP870Fab’。Capto Q 阴离子交换柱的柱床高度为24cm，直径为20cm。在阴离子交换色谱步骤之前，用3倍柱体积的以盐酸调整到pH8. 5的20mM Tris/1M NaCl缓冲液及5倍柱体积的以盐酸调整到pH8. 5的20mM Tris缓冲液进行柱平衡。
然后用5倍柱体积的平衡缓冲液洗涤柱子以回收⑶P870Fab’。
当加样开始后很短时间内280nm处的UV吸收值超过O. 5AU/cm时，收集 ⑶P870Fab’级分。在洗涤期间，当UV吸收值降到2. OAU/cm以下时终止对此级分的收集。
实施例4
参考文献列表
Battersby, J. E. , Snedecor, B. , Chen, C. , Champion, K. M. , Riddle, L. , and Vanderlaan, M. (2001). Affinity-reversed-phase liquid chromatography assay to quantitate recombinant antibodies and antibody fragments in fermentation broth. J Chromatogr A927,61-76.
Do, T. , Ho, F. , Heidecker, B. , Witte, K. , Chang, L. , and Lerner, L. (2008). A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purificationof proteins. Protein Expr. Purif. 60，147-150.
Durany 0, C. G. d. M. C. L. -S. J. (2004) · Studies on the expression of recombinant fuculose-1-phosphate aldolase in Escherichia col1.Process Biochem39， 1677-1684.
GE Healthcare data filell-0025_76AE.1on exchange chromatography. [11-0025-76AE]. 2007.
Ref Type:Data File
Glover, D. J. and Humphreys, D. P. (2004) . Antibody fragment s.1n Antibodies,Volumel: Production and purification, G. Subramanian，ed. (New York:KluwerAcademic/Plenum Publishers), pp.25-73.
Holligerj P. and Hudson, P. J. (2005). Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nat Biotechnol23，1126-1136.
Humphreys, D. P. (2003). Production of antibodies and antibody fragments in Escherichia coli and a comparison of their functions,uses and modification. Curr Opin Drug Discov Devel6,188-196.
Humphreys, D. P. and Glover, D. J. (2001). Therapeutic antibody production t echnologies:molecules, applications, expression and purification. Curr Opin Drug Discov Devel4, 172-185.
Humphreys, D. P.，Heywoodj S. P.，King, L. M.，Bowering，L. C.，Turner, J. P.，and Lane, S. E. (2004). Engineering of Escherichia coli to improve the purification of periplasmic Fab’fragments: changing the pi of the chromosomalIy encoded PhoS/ PstS protein. Protein Expr.Purif. 37，109-118.
Jana, S. and Deb，J. K. (2005). Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia col1.Appl Microbiol Biotechnol 67， 289-298.
Makrides，S. C. (1996). Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia col1. Microbiol Rev60, 512-538.
McCue，J. T.，Kemp，G.，Low，D.，and Quinones-Garciaj1. (2003). Evaluation of protein-A chromatography media. J Chromatogr A989，139-153.
Spitali,M. (2009). Downstream Processing of Monoclonal Antibody Fragments.1n Process scale purification of antibodies,U. Gottschalkjed. John Wiley&Sons, Inc.)，pp. 349-372.
Swartz, J. R. (2001). Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins. Curr Opin Biotechnoll2，195-201.
Terpe，K. (2006). Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production:from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol72,211-222.
Tugcuj N. (2008). Purification of proteins using displacement chromatography. Methods Mol Biol421,71-89.
Walsh, G. (2007). Biopharmaceuticals : Approval Trends in2006.BioPharm Internati onal2L
权利要求
1.用于从周质细胞提取物中纯化抗体片段的方法，其包括 a)第一色谱步骤以捕获抗体片段，其中含有抗体片段浓度为至少1.5g/L的混合物进行阳离子交换色谱并随后洗脱以产生含有所述抗体片段的第一洗脱物；以及 b)第二色谱步骤，其中第一洗脱物进行阴离子交换色谱以捕获杂质并产生含有抗体片段的流出液。
2.根据权利要求1的方法，其中的方法包含不超过两个色谱步骤。
3.用于从周质细胞提取物中纯化抗体片段的方法，其基本上由以下步骤构成 a)第一色谱步骤以捕获抗体片段，其中含有抗体片段浓度为至少1.5g/L的混合物进行阳离子交换色谱并随后洗脱以产生含有所述抗体片段的第一洗脱物 b)对第一洗脱物进行的第一次超滤； c)第二色谱步骤，其中纯化的第一洗脱物进行阴离子交换色谱以捕获杂质并产生含有抗体片段的流出液；以及 d)对流出液进行的第二次超滤。
4.根据权利要求1-3中任何一项的方法，其中所有色谱步骤都是在色谱柱上进行的。
5.根据权利要求1-4中任何一项的方法，其中阳离子交换色谱是以洗脱模式进行的。
6.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中第一阳离子色谱步骤按顺序包含以下步骤 a)将含有抗体片段的混合物如周质细胞提取物加样至阳离子交换柱， b)用洗涤缓冲液洗涤阳离子交换柱，其中在洗涤期间缓冲液的导电率、pH和盐浓度基本上保持不变，以及 c)用洗脱缓冲液洗脱抗体片段。
7.根据权利要求6的方法，其中在第一色谱步骤之前，洗涤缓冲液的pH与含有抗体片段的混合物的PH相同。
8.根据权利要求6或7的方法，其中含有抗体片段的混合物在第一色谱步骤前具有的pH 为 4. 0-5. O。
9.根据权利要求1-8中任何一项的方法，其中第一色谱步骤中，含有抗体片段的混合物在进行阳离子交换色谱前含有的细菌宿主细胞蛋白质的量为大约200 yg/ml-10, 000u g/ml。
10.根据权利要求1-9中任何一项的方法，其中第一色谱步骤中的阳离子交换色谱是在至少300cm/h的流速下进行的。
11.根据前述权利要求中任何项的方法，其中第一色谱步骤中的阳离子交换色谱是在不超过6mS/cm的导电率下进行的。
12.根据前述权利要求中任何项的方法，其中第一色谱步骤中的阳离子交换色谱是在包含偶联于树脂的磺酰基、磺酰丙基或羧甲基的色谱柱中进行的。
13.根据前述权利要求中任何项的方法，其中第一色谱步骤中的阳离子交换色谱柱具有对所述抗体片段的动态结合能力为50-75g/L树脂。
14.根据权利要求12-13的方法，其中第一色谱步骤中的阳离子交换色谱柱树脂的平均颗粒尺寸为至少50 V- m。
15.根据前述权利要求中任何项的方法，其中初级捕获步骤的阳离子交换色谱中，加样5-100g抗体片段每升树脂。
16.根据前述权利要求中任何项的方法，其中第二色谱步骤中的阴离子交换色谱是在包含季铵(Q)、二乙氨乙基(DEAE)或三甲胺乙基(TMAE)的树脂上进行的。
17.根据前述权利要求中任何项的方法，其中抗体片段为Fab、Fab’或scFv。
18.根据权利要求17的方法，其中Fab或Fab’特异性结合VEGF-A、FcRn、0X40、糖蛋白Ilb/IIIa 受体、C5、HER2/neu、TNF a、ILl P 或 CD40-L。
19.根据权利要求18的方法，其中Fab或Fab’为阿昔单抗、雷珠单抗、培克珠单抗、CDP870、CDP484 或 CDP7657。
20.根据前述权利要求任何项的方法，其中回收自该方法的抗体片段含有的宿主细胞蛋白质的量不超过百万分之150。
全文摘要
本发明涉及从周质细胞提取物中纯化抗体片段的方法，其包括第一阳离子交换色谱步骤及第二阴离子交换色谱步骤。
文档编号C07K1/18GK103025752SQ201180036421
公开日2013年4月3日 申请日期2011年7月26日 优先权日2010年7月27日
发明者M·斯皮塔利, J·西蒙斯, R·怀特康比, M·R·皮尔斯-黑金斯 申请人:Ucb医药有限公司