抗害虫植物的制作方法

专利名称：抗害虫植物的制作方法
抗害虫植物技术领域
本发明,在其一些实施方式中,涉及抗害虫植物(pest-resistant plants)以及产生抗害虫植物的方法。
背景技术：
通过在植物组织上觅食和通过传染微生物和病毒病，害虫是造成大规模产量损失的原因。杀虫剂和组合物已被开发用来控制虫害如农业园艺害虫、卫生害虫、或木材为食的害虫，并且在实践中已用作单剂或混合剂。
然而，认为，即使在化学防除的情况下，由于害虫攻击，在田地里每年也损失约十亿美元。自从在20世纪40年代引入DDT，已几乎完全由有限数目的广谱的化学杀虫剂来控制虫害，其已导致在若干重要害虫群中抗性种群的发展。化学杀虫剂的滥用和任意使用是造成天敌的环境和生态破坏以及数百万鸟类和鱼类连同虫害一起死亡的原因。另外，存在强有力的流行病学和实验证据，其表明，癌症、帕金森病和其它神经障碍的发生与杀虫剂暴露有关。因此，在这个时候重要的是，确定和表征具有杀虫活性的新化合物。
蜘蛛毒液包含大量的生物活性物质，其中的一些是毒素。它们被认为是杀虫化合物的丰富来源，这是因为蜘蛛毒液的主要作用是通过靶向这些生物体的神经系统而杀死或麻痹节肢动物猎物。一些蜘蛛毒素仅在昆虫中起作用的特异性具有用作生物杀虫剂的巨大潜力。在澳大利亚漏斗网蜘蛛(漏斗网蜘蛛(Hadronycheversuta))的毒液中发现的x_ACTX_Hvla毒素(Hvt)是昆虫特异性钙通道拮抗剂(Norton RS, Toxicon, 1998, 36, 1573 - 83)0该肽对于鞘翅目、鳞翅目和双翅目的广泛的农业上重要的节肢动物是毒性的并且已报道对许多哺乳动物没有影响(NortonRS, Toxicon, 1998，36，1573 - 83)。最近，已克隆活性重组蜘蛛毒素并表达在原核(FitchesE.et al., Insect.Biochem.Mol.Biol., 2002, 32, 1653-61, Khan et al., TransgenicRes., 2006, 15, 349-57)和真核系统(Fitches E.et al., Insect.Biochem.Mol.Biol.,2002，32，1653-61)中，以及表达蜘蛛杀虫肽的转基因植物耐昆虫侵袭(Khan etal., Transgenic Res., 2006, 15, 349-57)。
使用转基因植物来控制害虫可以减少或消除使用外部施加的化学杀虫剂的需要，所述外部施加的化学 杀虫剂对于某些物种如较大的森林树种，往往不是实用的或经济上可行的。另外，转基因植物的使用可以有效地靶向否则不容易接触到外部施加的杀虫剂的害虫。例如，某些害虫存在于保护瘿中和/或渗透入植物组织，其中经由隧道式转移(隧道工程，tunneling)或其它难以捉摸的机制，其部分或完全地保护害虫以避免外部施加的毒素。表达苏云金杆菌(Bt)Cry毒素的抗害虫转基因作物(包括稻)已成功并广泛使用超过10年。这些毒素相对于鞘翅目、双翅目和鳞翅目昆虫是高度活性的，但相对于膜翅目害虫(黄蜂和蚂蚁)则缺少任何有效活性。
蜘蛛毒液由物质的复杂混合物组成，其包含各种毒性成分。分离自不同蜘蛛物种的毒腺的具有杀虫活性的多肽呈现空间结构同源性并与可兴奋膜的离子通道相互作用，从而影响其功能。在烟草中ω-ACTX-Hvla毒素(Hvt)的转基因表达有效地保护植物免受棉铃虫(Helicoverpa armigera)和斜纹夜蛾(Spodoptera Iittoralis)幼虫的影响，并在 48 小时内具有 100% 死亡率(Khan S.A.et al., Transgenic Res.，2006，15，349-57)。在转基因植物中使用节肢动物神经毒素来控制咀嚼组织害虫(ti ssue-chewingpests)直到目前并不十分成功。

昆虫受到由壳多糖制成的硬化的外骨架表面的保护。壳多糖，连同另外的蛋白质一起，还存在于围食膜(PM)，一种膜状结构中，其将食物与肠组织分开。它保护上皮免受食物磨损和微生物影响并具有其它功能(基于酶的区室化)。壳多糖酶是这样的酶，其降解壳多糖但它们本身并不能够控制组织咀嚼害虫(Shakhbazau, (BLR) ,Rus.J.Genet.2008，44:1013-22)。对喂养壳多糖酶-转基因植物的昆虫的发育影响是轻度至重度，其取决于物理上伤害肠的消化组织的刚度，但植物并不完全抗害虫。美国专利号7，196,057教导了植物，该植物表达融合蛋白，其包含转运部分如凝集素和对昆虫有毒的部分，包括壳多糖酶。美国专利申请号20020197689教导了杀虫肽，其包括源自阴暗拟隙蛛(Pireneitega Iuctuosa)的月太。美国专利号5，177，308教导了植物，该植物表达杀虫肽，其包括源自漏斗网蜘蛛(Agelenopsis aperta)的月太。W09949035A2教导了植物，该植物表达杀虫肽，其包括源自Segestria florentina的肽。

发明内容
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了分离的多核苷，其包含:(i)编码至少一种毒性肽(toxic peptide)的核酸序列，所述毒性肽是蜘蛛毒素；以及(ii)核酸序列，其编码连接于(附着于，attach to)分泌信号序列(secretionsignal sequence)的壳多糖酶(chitinase)。按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了分离的多核苷酸，其包含:(i)编码至少一种毒性肽的核酸序列，所述毒性肽不是壳多糖酶；以及(ii)编码壳多糖酶的核酸序列。按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了核酸构建物(nucleic acidconstruct),其包含本发明的分离的多核苷酸以及顺式调节元件(cis regulatoryelement)。按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了核酸构建物系统，其包含:(i)第一核酸构建物，该第一核酸构建物包含含有编码毒性肽的核酸序列的分离的多核苷酸以及顺式调节元件；以及(ii)第二核酸构建物，该第二核酸构建物包含含有编码壳多糖酶的核酸序列的分离的多核苷酸以及顺式调节元件。按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含毒性肽的分离的多肽，所述毒性肽包含利用国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation) (NCBI)的BlastP软件利用默认参数(缺省参数，default parameters)确定的与选自由SEQ ID N0:9、15、24、30、55和56-60组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的序列，所述毒性肽连接于植物凝集素(plant lectin)。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种杀虫组合物(insecticidalcomposition),该组合物包含:
(i)毒性肽；以及
(ii)壳多糖酶。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了控制或消灭昆虫的方法，该方法包括在昆虫的寄生植物中表达本发明的任何分离的多核苷酸，从而控制或消灭昆虫。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了控制或消灭昆虫的方法，该方法包括在昆虫的寄生植物中表达分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码毒性肽的核酸序列，所述毒性肽选自由SEQ ID N0:9、15、24、30和55-57组成的组。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了控制或消灭昆虫的方法，该方法包括使昆虫与本发明的任何杀虫组合物接触，从而控制或消灭昆虫。
按照本发明的一些实施方式，毒性肽源自昆虫，该昆虫选自由蜜蜂、黄蜂、蟑螂、丽蚬、蚊子、结网毛虫(结网虫，webworm)、甲虫、对映体(antipode)、千足虫(millipede)、螃蟹、龙奸、小奸、对奸、蜘蛛、蝎子、螨(mite)和蝶(tick)组成的组。
按照本发明的一些实施方式，毒性肽源自蜘蛛。
按照本发明的一些实施方式，毒性肽包含利用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQ ID NO:9、15、24、30、55、56和57组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的氨基酸序列。
按照本发明的一些实施方式，毒性肽连接于植物凝集素。
按照本发明的一些实施方式，壳多糖酶并不连接于植物凝集素。
按照本发明的一些实施方式,植物凝集素包括雪花莲凝集素(Galanthus nivalisagglutinin) (GNA)0
按照本发明的一些实施方式，毒性肽连接于分泌信号序列。
按照本发明的一些实施方式，壳多糖酶连接于分泌信号序列。
按照本发明的一些实施方式，分泌信号序列由在SEQ ID NO: 7、21和61_68中陈述的核酸加以编码。
按照本发明的一些实施方式，壳多糖酶包含利用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQ ID NO: 36、42和58-60组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的氨基酸序列。
按照本发明的一些实施方式，上述至少一种毒性肽包括第一毒性肽和第二毒性肽，其中第一毒性肽靶向在钠(Na V)通道中的第一位点(site)以及第二毒性肽靶向在NaV通道中的第二位点。
按照本发明的一些实施方式，上述至少一种毒性肽包括第一毒性肽、第二毒性肽和第三毒性肽，其中第一毒性肽靶向在钠(Na V)通道中的第一位点，第二毒性肽靶向在NaV通道中的第二位点以及第三毒性肽靶向在Na V通道中的第三位点。
按照本发明的一些实施方式，第一毒性肽是P83591，第二毒性肽是P83558以及第三毒性肽是Pl 1060。按照本发明的一些实施方式，上述至少一种毒性肽包括至少4种毒性肽，其中至少4种毒性肽中的第一种是P83591，至少4种毒性肽中的第二种是P83558，至少4种毒性肽中的第三种是Pl 1060，以及至少4种毒性肽的第一种是P61095。按照本发明的一些实施方式，毒性肽连接于植物凝集素。按照本发明的一些实施方式，毒性肽连接于分泌信号序列。按照本发明的一些实施方式，壳多糖酶连接于分泌信号序列。按照本发明的一些实施方式，分离的多肽进一步包括分泌信号肽。按照本发明的一些实施方式，分离的多核苷酸包含编码本发明的分离的多肽的核酸序列。按照本发明的一些实施方式，分离的多核苷酸进一步包括编码壳多糖酶的核酸序列。按照本发明的一些实施方式，核酸构建物包含本发明的分离的多核苷酸和顺式调节元件。按照本发明的一些实施方式，核酸构建物系统包含:
( i )本发明的核酸构建物；以及(ii)包含分离的多核苷酸的核酸构建物，所述分离的多核苷酸包含编码壳多糖酶的核酸序列；按照本发明的一些实施方式，顺式调节元件是启动子。按照本发明的一些实施方式，启动子是SVBV或sgFiMV。按照本发明的一些实施方式，启动子是植物启动子。按照本发明的一些实施方式，植物启动子是叶特异性启动子(叶特异性表达启动子，leaf-specific promoter)。按照本发明的一些实施方式，植物包含本发明的核酸构建物。按照本发明的一些实施方式，植物包含本发明的核酸构建物系统。按照本发明的一些实施方式，植物是树。按照本发明的一些实施方式,植物是桉树(eucalyptus tree)。按照本发明的一些实施方式，杀虫组合物包含本发明的分离的多肽。按照本发明的一些实施方式，昆虫包括无柄瘿筑巢昆虫(sessile gall nestinginsect)。按照本发明的一些实施方式，无柄瘿筑巢昆虫包括瘿蜂(galI wasp)。按照本发明的一些实施方式，利用包含叶特异性启动子的核酸构建物来进行表达。按照本发明的一些实施方式，寄生植物包括树。按照本发明的一些实施方式，树是桉树。除非另有限定，否则本文使用的所有技术和/或科学术语均具有如与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然在本发明的实施方式的实施或测试中可以使用类似或等价于本文所描述的方法和材料，但下文描述了示例性方法和/或材料。在发生冲突的情况下，本专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法、和实施例仅是说明性的而并不旨在是必需限制性的。


仅通常举例的方式参照附图，在本文描述了本发明的一些实施方式。现详细具体参照附图，强调的是，示出的细节是通过举例的方式并用于本发明的实施方式的说明性讨论。在这方面，连同附图的描述使本领域技术人员显而易见的是，可以如何实施本发明的实施方式。
在附图中:
图1A-B是示出按照本发明的一个实施方式的表达载体(载体#257)的结构的图解。图1A示出合成片段以及图1B示出它被插入其中的载体。
图2是限制性分析的照片，其证实了将抗昆虫6盒(AntiInsects6Cassete)插入到载体的插入和正确方向。
图3A-C是示意图，其示出按照本发明的一个实施方式的表达载体(载体#258)的结构。图3A和3B示出合成片段以及图3C示出它被插入其中的载体。
图4是限制性分析的照片，其证实了将抗昆虫6⑶S GNA (Antilnsects6⑶S GNA)插入到载体的插入。
图5是示出本发明的具有注释序列的两个示例性建构物(构建体，construct)的图解。
具体实施方式
本发明，在其一些实施方式中，涉及抗害虫植物以及产生抗害虫植物的方法。
在详细解释本发明的至少一个实施方式以前，应当理解的是，本发明的应用不一定限制于在以下描述中陈述的或通过实施例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施方式或以各种方式加以实施或进行。虫害是全球性问题，其引起对农作物的严重损害，并且它们的控制通常是基于化学杀虫剂。然而，杀虫剂对环境和人类健康的负面影响强调了发展用于虫害控制的替代方法的必要性。
通过在 植物组织上觅食以及通过传染微生物和病毒病，害虫是造成大规模产量损失的原因。
使用转基因植物来控制害虫可以减少或消除使用外部施加的化学杀虫剂的需要，所述外部施加的化学杀虫剂对于某些物种如较大的森林树种往往不是实用的或经济上可行的。另外，转基因植物的使用可以有效地靶向否则不容易接触到外部施加的杀虫剂的害虫。例如，某些害虫存在于保护瘿(protective galls)中和/或渗透入植物组织中，其中借助于隧道式转移(tunneling)或其它难以捉摸的机制，其部分或完全地保护害虫以免受外部施加的毒素。
已表达在植物中用于控制害虫的一种特定的毒素是壳多糖酶。这种毒素是通过溶解虫害的外表皮和它的围食膜(PM)(将食物与肠组织分开的膜状结构)两者来起作用。
然而，软组织和液汁饲养昆虫不太可能受到PM的破裂的影响。因此，本发明人提出在植物中壳多糖酶和蜘蛛神经毒素的共同表达以控制食草害虫。壳多糖酶将干扰完整的壳多糖，从而改善蜘蛛毒素穿透血淋巴的机会。本发明人进一步建议蜘蛛神经毒素与植物分泌前导肽的融合。这将允许毒素以ER途径被翻译并被分泌到细胞外基质。以这种方式，可以受到保护以免受内细胞剂的影响的汁液喂养和瘿筑巢害虫(gall nesting pests)可以暴露于蜘蛛神经毒素:不仅通过植物材料的消化而且通过它的外表面。因此，通过消化和表皮吸收两者，在虫瘿内发育的瘿筑巢害虫将很长时间暴露于毒素。因此，按照本发明的第一方面，提供了控制或消灭昆虫的方法，该方法包括在昆虫的寄生植物中表达壳多糖酶和至少一种毒性肽，从而控制或消灭昆虫。用于控制或消灭的预期的昆虫包括那些影响植物的生长、发育、繁殖、收获、产量或效用的昆虫。根据一个实施方式，待根除的昆虫是无柄昆虫(sessile insect)。根据另一个实施方式，昆虫是瘿筑巢昆虫，如例如无柄瘿蜂(sessile gall wasps)(瘿蜂科(Cynip i dae ))。无柄瘿蜂的特别设想的物种包括但不限于桉树枝瘿姬小蜂(Leptocybeinvasa)、按干瘦姬小蜂(Ophelimus maskelli)和 Selitrichodes globulus。用于控制或消灭的其它昆虫包括但不限于鞘翅目，例如，南方玉米根虫(Southern cornrootworm) (Diabrotica undecimpunctata)；cowpea bruchid (四纹豆象(Callosobruchusmaculatus));鳞翅目，例如，欧洲玉米螟(Ostinia nubilalis)；烟草天蛾(烟草天蛾(Manduca sexta));姓莖昆虫(Chilo partellus);同翅目害虫，例如，水稻褐飞風(Ricebrown plant hopper)(褐飞風(Nilaparvata lugens));黑尾叶蝶(黑尾叶蝶(Nephotettixcinciteps));马铃薯叶蝶(马铃薯小绿叶蝶(Empoasca fabae));桃马铃薯姆虫(peachpotato aphid)(烟虫牙(Myzus persicae))。如在本文中所使用的，术语“植物”涵盖全植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括籽、芽、茎、根(包括块茎)、以及植物细胞(plant cell)、组织和器官。植物可以具有任何形式，包括悬浮培养物、胚胎、分生组织区、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉、和小孢子。在本发明的方法中特别有用的植物包括属于总科植物界(Viridiplantee)的所有植物，尤其是单子叶和双子叶植物，包括饲料或饲料豆科植物，观赏植物，粮食作物，树，或灌木，其选自包括下述的清单:相思树(Acacia spp.)、槭木(Acer spp.)、称猴桃(Actinidia spp.)、七叶树属(Aesculus spp.)、南方贝壳杉(Agathis australis)、合欢(Albizia amara)、南洋沙稷(Alsophila 1:1'；[(30101')、蓝莖草(411(11'(^08011 spp.)、花生属(Arachis spp)、模榔树(Areca catechu)、Astelia fragrans、鹰咀黄苗(Astragaluscicer)、罗得西亚柚木(Baikiaea plurijuga)、样木属(Betula spp.)、油菜属(Brassicaspp.)、木揽(Bruguiera gymnorrhiza)、伯克苏木(Burkea africana)、豆科紫矿树(Buteafrondosa)、伞形科植物(Cadaba farinosa)、朱楼花属(Calliandra spp)、茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒(Capsicum spp.)、鸡翅木(Cassia spp.)、距瓣豆(Centroema pubescens)、Chacoomeles spp.、肉桂(Cinnamomum cassia)、咖啡(Coffea arabica)、可乐豆木(Colophospermum mopane)、小冠花(Coronillia varia)、枸子属(Cotoneaster se rotina)、山楂属(Crataegus spp.)、甜瓜属(Cucumis spp.)、柏树(Cupressus spp.)、银白树厳(Cyathea dealbata)、植梓(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香水茅(Cymbopogon spp.)、银白树蕨(Cyntheadealbata)、植梓(Cydonia oblonga)、黄擅属(Dalbergia monetaria)、马尾丝(DavalIiadivaricata)、山虫马虫皇属(Desmodium spp.)、子草(Dicksonia squarosa)、Dibeteropogonamplectens、大果豆属(Dioclea spp.)、扁豆属(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、野青茅(Echinochloa pyramidalis)、Ehraffia spp.、龙爪稷(Eleusine coracana)、幽眉草属(Eragrestis spp.)、剌桐属(Erythrina spp.)、按树属(Eucalyptus spp.)、Euclea schimper1、Eulalia vi/losa、Pagopyrum spp.、南美稳(Feijoa sellowlana)、草莓属(Fragaria spp.)、千金藤(Flemingia spp)、Freycinetia banksl1、老鹤草(Geranium thunbergii )、银杏属(GinAgo biloba)、野大豆(Glycine javanica)、南洋樓属(Gliricidia spp)、抗虫棉(Gossypium hirsutum)、银禅属(Grevillea spp.)、鞘杆古夷苏木(Guibourtia coleosperma)、岩黄甚属(Hedysarum spp.)、Hemaffhia altissima、Heteropogon contoffus、大麦(Hordeum vulgare)、红荀茅(Hyparrhenia rufa)、小连翅(Hypericum erectum)、Hypeffhelia dissolute、Indigo incamata、鸾尾类(Irisspp.)、Leptarrhena pyrolifolia、古月枝子(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、银合欢(Leucaena leucocephala)、Loudetia simplex、Lotonus bainesl1、木兰属(Lotus spp.)、扁豆(Macrotyloma axillare)、海棠(Malus spp.)、木薯(Manihot esculenta)、苜蓿(Medicago saliva)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musa sapientum)、烟草(Nicotianum spp.)、红豆草属(Onobrychis spp.)、蒿属(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)、非洲双翼豆(Peltophorum africanum)、狼尾草属(Pennisetum spp.)、鳄梨(Persea gratissima)、矮牵牛(Petunia spp.)、豆科菜豆属(Phaseolus spp.)、加拿列剌葵(Phoenix canariensis)、新西兰麻属(Phormium cookianum)、石楠属(Photiniaspp.)、白云杉(Picea glauca)、海岸松属(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativam)、桃拓罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria flecki1、Pogonaffhria squarrosa、杨树属(Populus spp.)、牧豆树(Prosopis cineraria)、花方萁松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、矮生西洋梨(Pyrus communis)、红橡木(Quercus spp.)、厚叶石斑木(Rhaphiolepsis umbel lata)、刷子椰子(Rhopalostylis sap i da)、盐肤木属(Rhus natalensis)、正醋栗(Ribes grossularia)、醋栗属(Ribes spp.)、剌槐(Robiniapseudoacacia)、蔷薇属(Rosa spp.)、黑莓属(Rubus spp.)、柳木属(Salix spp.)、红裂稃草(Schyzachyrium sa nguineum)、Sciadopitys vefficillata、北美红杉(Sequoiasempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、蜀泰(Sorghum bicolor)、疲菜属(Spinacia spp.)、鼠尾草(Sporobolus fimbriatus)、Stiburus alopecuroides、矮柱花草(Stylosanthos humilis)、金桔属(Tadehagi spp)、落习习松(Taxodium distichum)、黄背草(Themeda triandra)、三叶苜猜(Trifolium spp.)、小麦属(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越橘属(Vaccinium spp.)、巢菜属(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、Watsonia pyramidata、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、王蜀黍(Zea mays)、觅菜(amaranth)、朝鲜蓟、芦異(asparagus)、嫩莖花椰菜、芽甘蓝(Brusselssprouts)、甘蓝、油菜、胡萝卜、花椰菜、序菜、绿色芥蓝菜(collard greens)、亚麻、羽衣甘蓝(kale)、小扁豆、油菜、黄秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、西红柿、南瓜荼(squash tea)、树。可替换地，藻类和其它非绿色植物界(Viridiplantae)可以用于本发明的方法。按照一个具体实施方式
，树是桉树。
如前面提到的，通过在植物中共同表达至少一种毒性肽和至少一种壳多糖酶来实现本发明的方法。为了在植物中表达毒性肽和壳多糖酶，将编码毒性肽和壳多糖酶的多核苷酸插入表达构建物中并引入到植物(植物转化)，以致在植物中发生表达，如下文进一步描述的。本发明设想表达一种、两种、三种、四种或更多种毒性肽。毒性肽包括任何肽(包括它的代谢前体或前剂(pro-agent))，其影响昆虫的健康、生长或繁殖和/或其生活周期的任何阶段。根据一个实施方式，毒性肽源自昆虫或相关的节肢动物。在本发明的一个优选的实施方式中，在植物中表达的毒性肽具有它的成熟形式，并且，理想地，是天然或合成的节肢动物来源的肽或蛋白质或其代谢物或类似物，能够引起对虫害的生长、发育繁殖或死亡率的有害影响；如昆虫或相关的节肢动物等源性蛋白或肽或神经肽或其代谢物或类似物。适当地，毒性肽源自昆虫如蟑螂、丽蝇、蚊子、结网毛虫、甲虫、黄蜂、蜜蜂，或相关的节肢动物如对映体、千足虫、螃蟹、龙虾、小虾、对虾、蜘蛛、蝎子、螨、蜱等。可以用来实施本发明的示例性昆虫毒素描述于美国专利号6，162，430和美国专利号7，196,057中，将两者的内容以引用方式结合于本文。根据一个实施方式，毒性肽对于特定昆虫具有选择性毒性。上述毒素进一步描述于Nicholson (Toxicon49 (2007) 490 - 512)，其内容以引用方式结合于本文。根据另一个实施方式，毒性肽对于非`脊椎动物具有选择性毒性。适宜的毒性昆虫肽包括任何一种或多种以下神经肽和它们的天然或合成的代谢物或类似物:烟草天蛾(Manduca sexta)咽侧体抑制素(Manse-AS);蟑螂咽侧体抑制素如在以下物种Diplotera punctata或美洲大爐(Periplaneta americana)的任一种中发现的那些咽侧体抑制素或丽蚬咽侧体抑制素如在物种反吐丽蚬(Calliphora vomitaria)中的咽侧体抑制素；可替换地，可以使用这样的肽，其包含、或源自昆虫利尿激素如分离自任何一种或多种上述物种的昆虫利尿激素、或相关的节肢动物激素。有用的蝎子毒素是，例如，来自黄肥尾蝎(Androctonus australis)的AalT。Zlotkin等人，Biochimie，53，1073-1078 (1971)。有用的蜗牛毒液是来自蜗牛蠟黃芋螺(Conus querciones)的蜗牛毒液，其是动物通过口加以递送并且其一些个别的毒素似乎对节肢动物(包括昆虫)是有选择性的。参见，例如，Olivera等人，"Diversity of Conus Neuropeptides, "Science, 249:257-263 (1990)。按照一个特定的实施方式，毒性肽是蜘蛛毒素(例如蜘蛛神经毒素)。蜘蛛神经毒素可以通过祀向昆虫的电压门控钠(voltage gated sodium) (Nav)通道来起作用。示例性昆虫选择性蜘蛛毒素包括但不限于海南捕鸟蛛毒素(hainantoxin)(其靶向Nav通道的位点1);Τχ4 (6-1)和Magi2 (其靶向Nav通道的位点3);以及δ岩沙海葵毒素(SPalutoxin)(其革巴向Nav通道的位点4)。如前面提到的，本发明设想表达一种、两种、三种、四种或更多种毒性肽。按照一个具体的实施方式，被表达的每种肽靶向不同位点，因而可以获得毒性肽的协同效应。因此，例如，本发明设想选择蜘蛛毒素，其靶向电压门控钠通道上的不同位点如P8359U靶向钠通道的位点1)、Ρ83558 (靶向钠通道的位点3)和Ρ11060 (靶向钠通道的位点4)。
在植物中可以表达的蜘蛛毒素的示例性组合是P83591、P83558、Pl 1060和P61095。
按照一个优选的实施方式，昆虫肽源自海南捕鸟蛛(Haplopelma hainanum)、巨型上戶蜘蛛(Macrothele gigas)、巴西漫游蜘蛛(Phoneutria nigriventer)、阴暗拟隙蛛(Pireneitega luctuosa)、漏斗网蜘蛛(Agelenopsis aperta)或 Segestria florentina。
设想的肽毒素包括那些肽毒素，所述肽毒素具有利用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQ ID NO:9、15、24、30、55、56和57组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的序列。
毒性肽的选择通过待破坏的病原体的特性确定。例如，可以基于待穿透的肠壁的类型来选择毒剂的尺寸并且 毒剂的有效性将基于待破坏的昆虫的类型。
根据一个实施方式，本发明的此方面的毒性肽连接于植物凝集素。
按照一个特定的实施方式，毒性肽和/或壳多糖酶是在凝集素的上游。
可以连接于毒性肽和/或壳多糖酶的适宜植物凝集素包括能够渗入昆虫肠中的任何植物凝集素。待选择的凝集素类型的选择取决于它在昆虫肠中的稳定性、待穿透的肠壁的类型和它的毒性水平；非毒性凝集素是优选的。
植物凝集素的实例包括但不限于雪花莲凝集素(GNA)、豌豆凝集素Pisum sativum(豌豆凝集素)(P-lec)、花生凝集素Arachis hypogaea (花生凝集素)、菜豆凝集素(PHA，phytohaemo glutinin)、葱莲(Zephyranthes Candida)凝集素、Amaryllis minuta凝集素、朱顶红(Hippeastrum vittatum)凝集素、君子兰(Clivia miniata)凝集素、石蒜(Lycorisradiate)凝集素、水仙(Narcissus tazetta)凝集素和喇ΠΛ水仙(Narcissus hybrid)凝集素以及它们的类似物。
在本发明的一个优选的实施方式中，植物蛋白选自以下蛋白质组:GNA (雪花莲凝集素；SEQ ID NO:46) ；P-lec豌豆凝集素；以及花生凝集素。
优选地，通过基因或生物化学方式，将毒性肽和凝集素连接在一起，因此，在第一实例中，通过至少一种连接肽，或在第二实例中，通过共价或非共价键或连接部分。在肽用来将成员连接在一起的情况下，当融合蛋白处于生物活性构象时，肽的数目取决于每个成员的相关末端之间的距离。上述部分可以被可释放地连接，其中通过适应于在昆虫肠中原位解离并释放毒剂的方式，例如在通过昆虫的代谢时，或可以保持不变，其取决于毒剂的活性形式。
因此，本发明的示例性多核苷酸是在SEQ ID N0:47中陈述的一种多核苷酸，其编码来自sp I Q56YT0 I LAC3_At漆酶+蜘蛛毒素P83591+GNA的融合植物分泌前导肽，如在SEQID N0:48中陈述的。本发明的另一个示例性多核苷酸是在SEQ ID N0:49中陈述的一种多核苷酸，其编码来自sp I Q56YT0 I LAC3_At漆酶+蜘蛛毒素P83558+GNA的融合植物分泌前导肽，如在SEQ ID N0:50中陈述的。本发明的另一个示例性多核苷酸是在SEQ ID N0:51中陈述的一种多核苷酸，其编码来自tr I Q6TDS6 | Q6TDS6_G0SAR分泌型漆酶树棉(Gossypiumarboreum) +蜘蛛毒素P11060+GNA的融合植物分泌前导肽，如在SEQ ID NO:52中陈述的。本发明的另一个示例性多核苷酸是在SEQ ID NO:53中陈述的一种多核苷酸，其编码来自sp I Q56YT0 I LAC3_At漆酶+蜘蛛毒素P61095+GNA的融合植物分泌前导肽，如在SEQ IDNO:54中陈述的。
如前面提到的，通过在植物中共同表达壳多糖酶和毒性肽来实现本发明的方法。如在本文中所使用的，术语“壳多糖酶”是指一种酶，其消化壳多糖[聚(β -1, 4-Ν-乙酰基D-葡糖胺)]以产生寡糖和N-乙酰基葡糖胺。为了测试多肽是否包含壳多糖酶活性，可以使多肽与壳多糖酶的底物接触，然后分析壳多糖酶底物的消化和/或其程度[例如，Johannes 等人，Infect.1mmun., 69, 4041-4047 (2001)]。例如,将待测试的多肽加入包含壳多糖酶的适当底物(例如，乙二醇壳多糖或壳多糖)的琼脂糖凝胶的孔中，并温育预定时间(例如，在37° C下12小时)。用适当的染料[例如，荧光增白剂28 (Sigma)]染色凝胶并在紫外线下加以观测。其中壳多糖被壳多糖酶消化的部分并不与染料反应，因而变成黑色。在这种情况下，可以判断，待测试的多肽呈现壳多糖酶活性。相反地，当壳多糖酶反应并不发生时，与染料的反应会增白凝胶。在这种情况下，可以判断，待测试的多肽并不呈现壳多糖酶活性。在植物中可以共同表达的适宜的壳多糖酶包括昆虫壳多糖酶如例如在烟草天蛾(M.sexta)、家香(Bombyx mori )、网比亚按蚊的蚊子(mosquito Anopheles gambiae)、美国白蛾(fall webworm Hyphantria cunea)、辣根猿叶甲(beetle Phaedon cochleariae)、或番爺蛾(Lacanobia oleracea)中发现的那些昆虫壳多糖酶。根据一个实施方式，壳多糖酶源自生物体，其消化作为它的饮食的一部分的昆虫壳多糖。因此，设想，例如，来自植物印度猪笼草(Nepenthes khasiana)和真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的壳多糖酶用于本发明。壳多糖酶已分离自许多植物种类并且按照它们的多域结构它们被分为5类(1-V)(Collinge et al., 1993;Hamel et al.，1997)并且本发明设想使用任何这些类。第I类壳多糖酶主要包括碱性蛋白质(basic protein)(具有碱性pi值),大多革巴向液泡并存在于单子叶植物和双子叶植物两者中。这些酶呈现高特异性活性并且是造成在根、茎干和花中大部分的植物壳多糖分解活性的原因(Legrand et al.，1987)。第I类壳多糖酶包括5个结构域 :(i) N端信号肽(20-27个氨基酸残基)，其规定蛋白质进入内质网的途径；(ii)富含半胱氨酸的域(约40个氨基酸的CRD)，其涉及壳多糖结合并且包含在高度保守位置中的8个半胱氨酸残基；(iii)富含脯氨酸(大部分羟脯氨酸)的铰链区(HR)，其大小有所不同；(iv)催化域(CD>220个氨基酸)，包含蛋白质的中心结构域，其显示与第II类和第IV类壳多糖酶的催化域的高度同源性以及与细菌壳多糖酶的CD的低同源性；以及(V)羧基末端延伸(CTE)，其将蛋白质引入液泡并且存在于大多数第I类壳多糖酶中(Graham and Sticklen, 1994;Hamel et al.，1987)。在细胞溶胞(其来自对病原体入侵的过敏反应)期间发生大量的液泡区室化壳多糖酶的快速释放。还已表征了若干第I类碱性壳多糖酶，其缺乏CTE。这些壳多糖酶被分泌到细胞外间隙(Legrand et al., 1987; Swegleet al., 1992; Vad et al.，1991)。第II类壳多糖酶是酸性的(具有酸性pl)，仅包含信号肽和催化域。后者显示与第I类和第IV类壳多糖酶的催化域的高度氨基酸序列同源性。酸性壳多糖酶的特异性活性低于第I类壳多糖酶的特异性活性。假定，第II类壳多糖酶的主要功能是通过真菌病原体细胞壁的部分降解来产生防御反应的诱导物(Graham and Sticklen, 1994)。第III类壳多糖酶包括具有壳多糖酶/溶菌酶活性的碱性或酸性胞外蛋白。它们的催化域不同于第I类和第II类壳多糖酶的催化域，但和来自酵母和丝状真菌的壳多糖酶共享显著同一'I"生。
第IV类壳多糖酶与第I类壳多糖酶共享结构域相似性但并不共享高氨基酸序列同一性。所有第IV类酶缺乏CTE，因而被靶向非原质体。另外，与第I类蛋白质的氨基酸序列对比显示4个不同缺失:一个在壳多糖结合域中以及三个在催化域内。此组包括来自豆的PR4壳多糖酶、来自油菜的ChB4以及许多其它壳多糖酶(Hamel et al.，1997)。
第V类壳多糖酶共享与细菌起源的外切壳多糖酶的某些同源性，例如，粘质沙雷氏菌(Serracia marcescens)、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)和裙皱链霉菌(Streptomyces plicatus)。
示例性壳多糖酶序列包括但不限于这样的壳多糖酶序列，其具有利用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQ ID NO: 36、42和58-60组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的序列。
本发明设想，将毒性肽、壳多糖酶或两者连接于信号肽。根据一个实施方式，信号肽是分泌信号肽，以致它们被分泌到细胞外基质中。
如在本文中所使用的，短语“信号肽”是指框内连接于多肽的氨基末端的肽并将编码的多肽引入细胞的分泌途径中。
因此，本发明设想多核苷酸序列SEQ ID NO: 11，其编码SEQ ID N0:12(融合植物分泌前导肽形式sp.Q56YT0/LAC3_At漆酶和蜘蛛毒素P83591);多核苷酸序列SEQ ID NO: 17，其编码SEQ ID NO: 18 (融合植物分泌前导肽形式sp.Q56YT0/LAC3_At漆酶和蜘蛛毒素P83558);多核苷酸序列SEQ ID N0:25，其编码SEQ ID NO:26 (融合植物分泌前导肽，其来自 tr I Q6TDS6 | Q6TDS6_G0SAR 分泌型漆酶树棉(Gossypium arboreum)和蜘蛛毒素 P11060);多核苷酸序列SEQ ID NO:31，其编码SEQ ID NO:32(融合植物分泌前导肽形式sp.Q56YT0/LAC3_At漆酶和蜘蛛毒素P61095);多核苷酸序列SEQ ID NO: 37，其编码SEQ ID N0:38(融合植物分泌前导肽形式sp.Q56YT0/LAC3_At漆酶和真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)壳多糖酶gb/ACF32998.1);多核苷酸序列SEQ IDNO:43，其编码SEQ ID N0:44(融合植物分泌前导妝，其来自tr I Q6TDS6 | Q6TDS6_G0SAR分泌型漆酶树棉(Gossypium arboreum)和真菌球抱白僵菌(Beauveria bassiana)内切壳多糖酶gb/AAN41261.1)。
如提到的，为了在植物中表达毒性肽和壳多糖酶，将编码毒性肽和壳多糖酶的多核苷酸引入植物(植物转化)以便在植物中进行表达。
按照本发明的此方面的核酸序列可以是互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，上述序列的组合)。
如在本文中所使用的，短语“互补多核苷酸序列”是指一种序列，其来自信使RNA的反转录，其中利用反转录酶或任何其它RNA依赖性DNA聚合酶。随后可以利用DNA依赖性DNA聚合酶来体内或体外扩增上述序列。
如在本文中所使用的，短语“基因组多核苷酸序列”是指源自(分离自)染色体的序列，因此它代表染色体的邻近部分。
如在本文中所使用的，短语“复合多核苷酸序列”是指一种序列，其是至少部分互补序列和至少部分基因组 序列。复合序列可以包括为编码本发明的多肽所需要的一些外显子序列以及插入其间的一些内含子序列。内含子序列可以具有任何来源(包括其它基因)，并且通常将包括保守的剪接信号序列。上述内含子序列可以进一步包括顺式作用表达调节元件。编码按照本发明的此方面的毒性肽和壳多糖酶的核酸序列可以加以改变，以进一步改善在植物表达系统中的表达水平。例如，可以按照用于植物表达的优选的密码子选择来修饰毒性肽和/或壳多糖酶的核酸序列。可以通过利用修饰或衍生的核苷酸序列来增加毒性肽和/或壳多糖酶在植物中的表达。上述序列修饰的实例包括但不限于改变的G/C含量以更加接近通常存在于植物中的G/C含量，和除去非典型地存在于植物中的密码子，通常称为密码子优化。短语“密码子优化”是指选择适当的DNA核苷酸用于结构基因或其片段内，上述结构基因或其片段接近在植物中的密码子选择。因此，优化基因或核酸序列是指基因，其中天然或自然发生的基因的核苷酸序列已被修饰以采用植物中统计上优选的或统计上有利的密码子。通常在DNA水平检查核苷酸序列并优化编码区在植物中的表达，其利用任何适宜的程序确定，例如如在 Sardana et al.(1996, Plant Cell Reportsl5:677-681)中所描述的。在此方法中，可以通过首先发现，相对于高度表达植物基因的选择的平方正比偏差，天然乙酰肝素酶基因的每种密码子的选择的平方正比偏差，接着计算平均方差，来计算密码子选择的标准偏差，密码子选择偏好的一种度量。所使用的公式是:lSDCU=n=lN[(Xn-Yn)/Yn] 2/N,式中Xn是指在高度表达植物基因中密码子η的选择的频率，其中Yn是指在感兴趣的基因中密码子η的选择的频率，以及N是指在感兴趣的基因中密码子的总数。利用Murrayet al.(1989, Nuc Acids Res.17:477-498)的数据编制了来自双子叶植物的高度表达基因的密码子选择的表。编码毒性肽和/或壳多糖酶的核酸序列可以加以改变，以进一步改善表达水平，例如，通过优化核酸序列，其中按照用于特定植物细胞类型的优选密码子选择，上述特定植物细胞类型被选择 用于毒性肽和/或壳多糖酶多肽的表达。烟草植物用于毒性肽和/或壳多糖酶的表达(如在下文的实例部分中所描述的)可以限制对优化核酸序列(按照优选密码子选择)的需要，这是因为烟草植物密码子选择/偏爱通常非常类似于人类。优化核酸序列的一种方法(按照用于特定植物细胞类型的优选的密码子选择)是基于直接使用密码子优化表而没有进行任何另外的统计计算，如在线提供于密码子选择数据库并通过日本的NIAS (国家农业生物科学研究所)DNA库(www.kazusa.0r.jp/codon/)的那些密码子优化表。密码子选择数据库包含用于若干不同物种的密码子选择表，其中每个密码子选择表是基于在基因库中存在的数据加以统计确定。通过利用上述表来确定最优选的或最有利的用于在特定物种(例如，稻)中的每种氨基酸的密码子，编码感兴趣的蛋白质的天然存在的核苷酸序列可以是优化用于上述特定植物种类的密码子。其实施是通过用就氨基酸而言统计上更加有利的相应密码子替代在特定物种基因组中可以具有较低统计发生率的密码子。然而，可以选择一种或多种较不利的密码子以删去现有的限制位点，从而在潜在有用的接头处产生新的限制位点(5’和3’末端以添加信号肽或终止盒(试剂盒)，内位点，其可以用来一起切割和剪接区段以产生正确的全长序列)，或消除可以负面影响mRNA稳定性或表达的核苷酸序列。编码核苷酸序列的天然存在的或天然的毒性肽和/或壳多糖酶可以在任何修饰之前已经包含许多密码子，其对应于在特定植物种类中的统计上有利的密码子。因此，天然毒性肽和/或壳多糖酶核苷酸序列的密码子优化可以包括确定在天然毒性肽和/或壳多糖酶核苷酸序列内相对于特定植物而言并不是统计上有利的密码子，然后按照特定植物的密码子选择表来修饰这些密码子，以产生密码子优化的衍生物。编码毒性肽和/或壳多糖酶的修饰或衍生核苷酸序列可以100%包括植物优选密码子序列，同时用与由天然毒性肽和/或壳多糖酶编码序列产生的相同的氨基酸序列来编码多肽。可替换地，编码毒性肽和/或壳多糖酶的修饰核苷酸序列可以仅部分地包含植物优选密码子序列，其中剩余密码子保留源自天然毒性肽和/或壳多糖酶编码序列的核苷酸序列。修饰核苷酸序列可以被全部或部分优化用于植物密码子选择，条件是，在高于由相应天然存在的或天然的基因编码的蛋白质的水平下，产生由修饰核苷酸序列编码的蛋白质。例如，修饰毒性肽和/或壳多糖酶可以包含约60%至约100%的优化用于植物表达的密码子。作为另一个实例，修饰毒性肽和/或壳多糖酶可以包含90%至100%的优化用于植物表达的密码子。通过改变密码子选择所形成的合成基因的结构描述于例如PCT专利申请93/07278 中。可以利用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术来建构可用于按照本发明的方法的建构物(或载体)。可以将基因建构物插入载体中，所述载体可以是商购获得的，适用于转化进入植物中并适用于在转化细胞中表达感兴趣的基因。基因建构物可以是表达载体，其中异源核酸序列可操作地连接于顺式作用调节元件，从而允许在植物细胞中的表达。如在本文中所使 用的，短语“顺式作用调节元件”是指多核苷酸序列，优选启动子，其结合反式作用调节子并调节位于其下游的编码序列的转录。如在本文中所使用的，短语“可操作地连接”是指顺式调节元件(例如，启动子)的功能定位，以便允许调节所选核酸序列的表达。例如，就转录和翻译的方向而言，启动子序列可以位于所选核酸序列的上游。优选地，在本发明的核酸构建物中的启动子是植物启动子，所述植物启动子用于指导异源核酸分子在植物细胞内的表达。如在本文中所使用的，短语“植物启动子”是指启动子序列(包括向其中添加或包含在其中的任何另外的调节元件)，至少能够诱导、授予、激活或增强在植物细胞、组织或器官(优选单子叶或双子叶植物细胞、组织、或器官)中的表达。根据一个实施方式，启动子不是花启动子(因而保护蜜蜂和其它食蜜性昆虫免受毒素的影响)。根据又一个实施方式，启动子是叶启动子。可用于本发明的方法的优选的启动子的实例包括:SgFiMV-Bhattacharyya(USA), Virus Research, 2002，90:47 - 62。SVBV - Wang(ISL)，Virus Genes, 2000，20: 11-7 ；Pattanaik (USA)，PlantScience,2004, 167:427 - 38。PCISV - Maiti (USA), BIOCH.BIOPHYS.RES.COM.1998,244:440 - 4。SgMiMV - Dey(USA), Transgenic, 2003, 4:35-53。MiMV-Dey (USA) ,Plant Molecular Biology, 1999，40:771 - 82。FiMV - Maiti (USA), Transgen.Res.1997,6:143-56。CsVMV - Verdaguer(USA)，AJRTC, 1997，2:204-8。35S 启动子，其来自 pBI121 (AF485783.1 )，如在 SEQ ID N0:6 中陈述的。AtUBQl启动子，如在SEQ ID N0:14中陈述的。
At肌动蛋白7(AtActin7)启动子，如在SEQ ID NO:20中陈述的。
At δ tip (At Delta tip)启动子，如在 SEQ ID NO:28 中陈述的。
AtyTIP2 (At GammTIP2)启动子，如在 SEQ ID N0:34 中陈述的。
Sg FiMV启动子，如在SEQ ID NO:40中陈述的。
其它示例性启动子列于表1、II和III中。
表I
用于实施本发明的示例性组成型启动子
权利要求
1.一种分离的多核苷酸,包含: (i)编码至少一种毒性肽的核酸序列，所述毒性肽是蜘蛛毒素；以及 (ii)编码连接于分泌信号序列的壳多糖酶的核酸序列。
2.—种分离的多核苷酸,包含: (i)编码至少一种毒性肽的核酸序列，所述毒性肽不是壳多糖酶；以及 ( )编码壳多糖酶的核酸序列。
3.根据权利要求2所述的分离的多核苷酸，其中，所述毒性肽源自昆虫，所述昆虫选自由蜜蜂、黄蜂、蟑螂、丽蝇、蚊子、结网毛虫、甲虫、对映体、千足虫、螃蟹、龙虾、小虾、对虾、蜘蛛、蝎子、螨和蜱组成的组。
4.根据权利要求2所述的分离的多核苷酸，其中，所述毒性肽源自蜘蛛。
5.根据权利要求1或4所述的分离的多核苷酸，其中，所述毒性肽包含利用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQ ID NO:9、15、24、30、55,56和57组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的多核苷酸,其中,所述毒性肽连接于植物凝集素。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述壳多糖酶并不连接于植物凝集素。
8.根据权利要求6所述的分离的多核苷酸，其中，所述植物凝集素包括雪花莲凝集素(GNA)0
9.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述毒性肽连接于分泌信号序列。
10.根据权利要求2-9中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述壳多糖酶连接于分泌信号序列。
11.根据权利要求1、9或10中任一项所述的分离的多核苷酸，其中，所述分泌信号序列由在SEQ ID NO:7、21和61-68中陈述的核酸编码。
12.根据权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中，所述壳多糖酶包含利用国家生物技术信息中心(NCBI)的B lastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQ ID NO:36、42和58-60组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的氨基酸序列。
13.根据权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中，所述至少一种毒性肽包括第一毒性肽和第二毒性肽，其中所述第一毒性肽靶向钠(Nav)通道中的第一位点以及所述第二毒性肽靶向在所述Nav通道中的第二位点。
14.根据权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中，所述至少一种毒性肽包括第一毒性肽、第二毒性肽和第三毒性肽，其中所述第一毒性肽靶向在钠(Nav)通道中的第一位点，所述第二毒性肽靶向在所述Nav通道中的第二位点以及所述第三毒性肽靶向在所述Nav通道中的第三位点。
15.根据权利要求14所述的分离的多核苷酸，其中，所述第一毒性肽是P83591，所述第二毒性肽是P83558以及所述第三毒性肽是Pl 1060。
16.根据权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中，所述至少一种毒性肽包括至少4种毒性肽，其中所述至少4种毒性肽中的第一种是P83591，所述至少4种毒性肽中的第二种是P83558，所述至少4种毒性肽中的第三种是Pl 1060，所述至少4种毒性肽的第一种是P61095。
17.—种核酸构建物,包含根据权利要求1-16中任一项所述的分离的多核苷酸以及顺式调节元件。
18.—种核酸构建物系统,包括: (i)第一核酸构建物，所述第一核酸构建物包含含有编码毒性肽的核酸序列的分离的多核苷酸以及顺式调节元件；以及 (ii)第二核酸构建物，所述第二核酸构建物包含含有编码壳多糖酶的核酸序列的分离的多核苷酸以及顺式调节元件。
19.根据权利要求18所述的核酸构建物系统，其中，所述毒性肽连接于植物凝集素。
20.根据权利要求18-19所述的核酸构建物系统，其中，所述毒性肽连接于分泌信号序列。
21.根据权利要求18-19所述的核酸构建物系统，其中，所述壳多糖酶连接于分泌信号序列。
22.—种分离的多肽，包含毒性肽，所述毒性肽包含利用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件利用默认参数确定的与选自由SEQID NO:9、15、24、30、55和56-60组成的组中的序列至少90%同源、和/或至少80%同一的序列，所述毒性肽连接于植物凝集素。
23.根据权利要求22所述的分离的多肽，进一步包括分泌信号肽。
24.一种分离的多核苷酸，包含编码根据权利要求22-23所述的分离的多肽的核酸序列。
25.根据权利要求24所述的分离的多核苷酸，进一步包括编码壳多糖酶的核酸序列。
26.一种核酸构建物，包含根据权利要求24所述的分离的多核苷酸和顺式调节元件。
27.—种核酸构建物系统,包含: (i)根据权利要求26所述的核酸构建物；以及 (ii)包含分离的多核苷酸的核酸构建物，所述分离的多核苷酸包含编码壳多糖酶的核酸序列。
28.根据权利要求17或26所述的核酸构建物，其中，所述顺式调节元件是启动子。
29.根据权利要求28所述的核酸构建物，其中，所述启动子是SVBV或sgFiMV。
30.根据权利要求28所述的核酸构建物，其中，所述启动子是植物启动子。
31.根据权利要求30所述的核酸构建物，其中，所述植物启动子是叶特异性启动子。
32.—种植物,包含根据权利要求17或26所述的核酸构建物。
33.一种植物，包含根据权利要求18或27所述的核酸构建物系统。
34.根据权利要求32或33所述的植物，是树。
35.根据权利要求34所述的植物，是桉树。
36.一种杀虫组合物，包含: (i)毒性肽；以及 (ii)壳多糖酶。
37.一种杀虫组合物，包含根据权利要求22所述的分离的多肽。
38.一种控制或消灭昆虫的方法，所述方法包括在所述昆虫的寄生植物中表达根据权利要求1_12、24和25中任一项所述的分离的多核苷酸，从而控制或消灭所述昆虫。
39.—种控制或消灭昆虫的方法，所述方法包括在所述昆虫的寄生植物中表达分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码毒性肽的核酸序列，所述毒性肽选自由SEQ IDN0:9、15、24、30 和 55-57 组成的组。
40.一种控制或消灭昆虫的方法，所述方法包括使所述昆虫与根据权利要求36或37所述的杀虫组合物接触，从而控制或消灭所述昆虫。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中，所述昆虫包括无柄瘿筑巢昆虫。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述无柄瘿筑巢昆虫包括瘿蜂。
43.根据权利要求38或39所述的方法，其中，利用包含叶特异性启动子的核酸构建物来进行所述表达。
44.根据权利要求38或39所述的方法，其中，所述寄生植物包括树。
45.根据权利要求44所述的方法，其`中，所述树是桉树。
全文摘要
本发明公开了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含(i)编码至少一种毒性肽的核酸序列，所述毒性肽是蜘蛛毒素；以及(ii)编码连接于分泌信号序列的壳多糖酶的核酸序列。还公开了其应用和表达其的植物。
文档编号C07K14/435GK103154022SQ201180038638
公开日2013年6月12日 申请日期2011年6月16日 优先权日2010年6月16日
发明者德罗尔·阿维萨尔, 哈南·施泰因, 齐夫·沙尼 申请人:富途锐基尼以色列有限公司