专利名称：具有减少的细胞摄取的因子viii变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及修饰的凝血因子。本发明更具体地涉及具有减少的细胞摄取的修饰凝血因子，其导致清除率降低/细胞摄取减少和/或免疫原性降低。本发明另外涉及这样的分子的用途以及用于产生这样的分子的方法。
背景技术：
A型血友病是由凝血因子VIII (FVIII)活性缺乏或功能异常引起的遗传性出血性疾病。因为通常发生初始血凝块的形成，所以临床表现不是基于初级止血。而是由于缺乏次级凝血酶形成和初级凝块的血纤蛋白稳定化，凝块不稳定。通过静脉内注射分离自血液或重组产生的FVIII治疗该病。FVIII给予后在大约20-40%的重度A型血友病患者中发生针对FVIII的中和抗体(抑制剂)的形成，致使用FVIII的进一步治疗无效。对抑制剂的诱导因此在血友病保健中提供主要难题。当前的治疗推荐正从传统应要求治疗转向预防。与von Willebrand因子(vWF)结合的内源性FVIII的循环半寿期是12-14小时，因此将进行一周数次的预防治疗以便让患者获得实际上无症状的生活。对于许多人，尤其是儿童和少年，静脉内给药与显著不便和/或疼痛联系在一起。在开发具有显著延长的循环半寿期的FVIII变体中已使用多种方法。多种这些方法涉及FVIII与亲水聚合物例如PEG (聚乙二醇)的缀合。W003031464公开了其中PEG基团可与多肽上存在的聚糖连接的酶促方法。亦有人建议，调节低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)介导的FVIII清除以便获得具有减少的细胞摄取/清除率的FVIII变体，并因此增加体内循环半寿期，但该方法受FVIII表面上存在的潜 在LRP结合位点的显著大量冗余和这些位点作用的不确定性所限制。此外，这些位点中一些紧密靠近对FVIII = C活性关键的区域，降低的LRP结合可伴随活性的实质性损失，其使得FVIII变体作为治疗剂是较不吸引人的。认为LRP和相关受体与其配体的相互作用涉及配体表面上的赖氨酸残基在受体的酸性“项链(necklace) ”中对接(Mol Cell 2006; 22: 277-283)。此外有人表明，疏水残基与赖氨酸残基一起可涉及与LRP家族成员的相互作用(FEBS J 2006; 273: 5143-5159，J Mol Biol 2006; 362: 700-716)，并可因此推测，是否除了关键赖氨酸残基或其他带正电荷残基外的这些疏水残基的修饰可导致与LRP家族成员的相互作用减少和潜在延长和/或减少的清除。为了具有治疗吸引力，FVIII变体应该保留FVIII促凝血功能。由此可见，本领域需要具有维持的FVIII活性以及显著延长的体内循环半寿期和/或降低的免疫原性的特定FVIII变体。发明概述
本发明因此涉及具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中所述变体包含命名为“Cl足”和/或“C2足”的FVIII Cl和/或C2结构域的2、3、4、5、6、7、8、9或10个表面可接近的带正电荷残基的取代，其中所述表面可接近的带正电荷氨基酸残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基)被但不限于丙氨酸或谷氨酰胺取代，和其中取代导致细胞摄取减少。本发明另外涉及重组FVIII变体，其中所述FVIII变体包含K2092A取代和F2093A取代，其中所述变体与半寿期延长部分例如PEG缀合。本发明亦涉及具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中所述变体包含引起额外的糖基化位点的突变，其中所述糖基化位点的聚糖赋予降低的与KM33抗体结合的能力。本发明的FVIII变体具有与增加的循环半寿期相关的减少的细胞摄取。本发明的FVIII变体可另外有具有减少的LRP结合的优势。本发明的FVIII变体与无该突变类型的FVIII分子相比可另外有具有降低的免疫原性的优势。关于降低的免疫原性的解释可为，带正电荷的残基在FVIII的Cl和/或C2足被取代，导致负责呈递FVIII至免疫系统的细胞摄取减少。附图简述
图1:以正面和背面方向示出的FVIII (pdb登录码3cdz)的X射线晶体结构的表面模型。标示了 A1、A2、A3、C1和C2结构域的位置。赖氨酸和精氨酸残基为黑色。图2:突出FVIII的Cl和C2结构域的FVIII (pdb登录码3cdz)的x射线晶体结构的表面模型。Cl和C2结构域的较低部分为白色，描绘其假定的膜结合区，分别指定为Cl足和C2足。赖氨酸和精氨酸残基为黑色。图3:图1.由质谱监测的氢交换(HX)鉴定涉及4F30和KM33结合的FVIII区，(A)对应于肽片段2078-2 095的质/荷谱，([M+H]+ = 672.3818，z = 3)，鉴定为与FVIII结合的4F30和KM33两者的表位部分。(B)对应于肽片段2148-2161的质/荷谱，(m/z =565.6554，z= 3)，鉴定为与FVIII结合的4F30和KM33两者的表位部分。对于所有的谱，较上的图(panel)显示非氘化的对照，第二的图显示在不存在配体时用D2O交换10秒后的肽，第三和第四的图分别显示在存在4F30和KM33时用D2O交换10秒后的肽。图4:在4F30和KM33存在时FVIII的代表性肽的氢交换时间图。在不存在(实方块)或存在4F30 (空三角)或KM33 (空方块)时针对对数尺度上的时间绘制FVIII肽的氘掺入(Da)。涵盖残基氨基酸2062-2073和2163-2168的肽代表不受与4F30和KM33两者形成复合物影响的FVIII区。涵盖残基氨基酸2078-2095和2148-2161的肽代表为4F30和KM33两者的结合表位部分的FVIII区。图5:在KM33和4F30存在时FVIII的HX分析肽的序列涵盖。原始序列(使用成熟的编号:水平图A:氨基酸2062-2100，水平图B:氨基酸2139-2168)呈现在HX分析肽(以水平条示出)上面。在存在和不存在4F30和KM33时显示类似交换模式的肽以未填充(空条)呈现，而在4F30和KM33结合时显示降低的氘掺入的肽以黑色填充(闭条)。发明详述 定义
因子VIII分子:FVIII/因子VIII是主要由肝细胞产生的大的复合糖蛋白。人FVIII由2351个氨基酸(包含信号肽)组成，并包含若干个不同的结构域，如通过同源性所限定。有3个A-结构域、I个唯一的B-结构域和2个C-结构域。结构域顺序可列为NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。FVIII在血浆中以在B-A3边缘处分开的两条链循环。通过二价金属离子结合将链连接。A1-A2-B链命名为重链(HC)，而A3-C1-C2命名为轻链(LC)。“Cl足”和“C2足”:在本发明的上下文中，“Cl足”定义为Cl结构域的区，其具有将FVIII分子/FVIII变体非共价锚定于阴离子膜的能力，阴离子膜包含例如血小板上发现的磷脂酰-L-丝氨酸。在图1中，以正面和背面方向示出FVIII (pdb登录码3cdz)的X射线晶体结构的表面模型。标示了 A1、A2、A3、C1和C2结构域的位置。赖氨酸和精氨酸残基为黑色，显示其广泛的分布。Cl足在图2所示的FVIII模型中以白色显示。更具体地，下述Cl氨基酸可能锚定于磷脂膜，与例如血小板结合有关，并因此为Cl足的一部分:2029-2035+2043-2069+2090-2100+2130-2136+2156-2163。本发明的发明人已出乎意料地显示，2065,2090和2092残基中每个的突变将导致具有减少的LRP结合的生物活性FVIII变体-尤其当这些残基被但不限于谷氨酰胺或丙氨酸残基取代时，取决于该残基的表面可接近区域。在本发明的上下文中，“C2足”定义为C2结构域的区，其可能具有将FVIII分子/FVIII变体锚定于阴离子膜的能力，阴离子膜包含例如血小板上发现的磷脂酰-L-丝氨酸。C2足在图2所示的FVIII模型中以白色显示。更具体地，下述C2氨基酸锚定于磷脂层，与例如血小板结合有关，并因此为C2足的一部分:2195-2227+2248-2258+2287-2291+2313-2320。本发明的发明人已显示，C2足中表面暴露的赖氨酸或精氨酸残基中一个的突变(R2215或K2249)将导致具有减少的LRP结合的生物活性FVIII变体-尤其当这些残基被但不限于谷氨酰胺残基或丙氨酸残基取代时，取决于该残基的表面可接近性。发明人此外显示，包含Cl足的取代和C2足的取代两者的FVIII变体呈现减少的LRP结合以及维持的FVIII = C活性。FVIII Cl和/或C2足的表面可接近的带电荷残基/带IH电荷残基/赖氨酸或精氨酸残基:可接近的表面积(ASA)是易接近溶剂的生物分子的表面积或者生物分子表面的一部分(例如单一氨基酸侧链)。ASA通常以平方埃(分子生物学中测量的标准单位)引用。ASA由Lee和Richards在1971年首次描述并有时被称为Lee-Richards分子表面[B.Lee 和 F.M.Richards, 〃The Interpretation of Protein Structures: Estimation ofStatic Accessibility (蛋白质结构的阐明:静态可接近性的估计)〃 J.Mol.Biol.55，379-400 (1971)]。使用来源于例如x射线结构的原子坐标,可用来自Accelrys Inc.的计算机程序Quanta 2005计算表面可接近性。氨基酸侧链的相对表面可接近性是对单个氨基酸测定的实际表面可接近面积除以最大可接近的表面积。从具有Pdb登录码3cdz的FVIII的X射线晶体结构计算ASA。如果相对表面可接近性小于20%，那么将该残基突变为谷氨酰胺以便防止蛋白表面的局部坍塌。可因此选择Cl和/或C2足的带电荷表面可接近的氨基酸残基(优选带正电荷的氨基酸残基、优选赖氨酸和/或精氨酸残基)用于氨基酸取代，以便得到具有减少的细胞摄取和任选亦减少的LRP结合/LRP介导的清除的FVIII变体。本文使用的“因子VIII”或“FVIII”指，为内在凝血途径的成员并对血液凝固必需的人血浆糖蛋白。“天然FVIII”是如在SEQ ID NO:1 (氨基酸1-2332)中所示的全长人FVIII分子。在SEQ ID NO:1中B-结构域跨越氨基酸741-1648。SEQ ID NO:1 (wt 人 FVII I): ATRRYYLGAVELSWOYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFT
DHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDD
权利要求
1.一种具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中所述变体包含FVIII Cl足和/或C2足的2-10个表面可接近的带正电荷氨基酸残基的取代，其中所述表面可接近的带电荷氨基酸残基被丙氨酸或谷氨酰胺取代，和其中所述取代导致所述FVIII变体的细胞摄取减少。
2.权利要求1的FVIII变体，其中所述变体包含Cl足的至少2个表面可接近的带正电荷氣基酸残基的取代。
3.权利要求1或2中任一项的FVIII变体，其中所述变体包含C2足的至少2个表面可接近的带正电荷氨基酸残基的取代。
4.权利要求1-3中任一项的FVIII变体，其中所述变体包含Cl足的至少I个表面可接近的带正电荷氨基酸残基的取代和C2足的至少I个表面可接近的带电荷氨基酸残基的取代。
5.权利要求1-4中任一项的FVIII变体，其中所述变体包含表面可接近的带正电荷氨基酸残基的取代对，其中所述取代对之间的距离是至少15 L
6.权利要求1-5中任一项的FVIII变体，其中所述变体包含K2092取代。
7.权利要求6的FVIII变体，其中所述K2092取代与R2215取代组合。
8.权利要求6的FVIII变体，其中所述K2092取代与K2249取代组合。
9.权利要求1-8中任一项的FVIII变体，其中所述变体包含R2090取代。
10.权利要求1-9中任一项的FVIII变体，其中所述变体包含K2065取代。
11.权利要求10 的FVIII变体，其中所述K2065取代与R2215的取代组合。
12.权利要求10的FVIII变体，其中所述K2065取代与K2249取代组合。
13.权利要求1-12中任一项的重组FVIII变体，其中所述变体具有减少的LRP结合。
14.权利要求1-13中任一项的重组FVIII变体，其中所述变体具有减少的免疫原性。
15.权利要求1-14中任一项的重组FVIII变体，其中FVIII变体与半寿期延长部分缀入口 o
16.权利要求1-15中任一项的重组FVIII变体，其中所述变体另外包含F2093A突变。
17.一种重组FVIII变体，其中所述变体包含K2092A取代和F2093A取代，其中所述变体与半寿期延长部分(PEG)缀合。
18.一种药物组合物，其包含权利要求1-17中任一项的FVIII变体。
19.权利要求1-17中任一项的FVIII变体或权利要求18的药物组合物用于治疗血友病的用途。
全文摘要
本发明涉及修饰的凝血因子。尤其，本发明涉及具有减少的细胞摄取的修饰因子VIII分子。
文档编号C07K14/755GK103209992SQ201180054958
公开日2013年7月17日 申请日期2011年9月14日 优先权日2010年9月15日
发明者H.梅姆斯, A.B.梅耶斯, K.默滕斯, O.H.奥尔森, K.兰贝尔特, P.L.内尔比, L.B.约翰森, M.克雅尔克, H.R.施滕尼克, J.J.福尔贝格, M.范登比格拉尔 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司