用于从重组大肠杆菌纯化人粒细胞集落刺激因子的方法

专利名称：用于从重组大肠杆菌纯化人粒细胞集落刺激因子的方法
技术领域：
本发明涉及用于从重组大肠杆菌纯化人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法。更具体地，本发明涉及用于以高纯度和产率从重组大肠杆菌纯化人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法，其包括以下步骤:(a)培养表达hG-CSF的重组大肠杆菌以通过离心得到细胞沉淀；(b)将含hG-CSF的上清液与步骤(a)中得到的细胞沉淀分离；(c)用酸处理步骤
(b)中得到的上清液以通过过滤分离所得沉淀；(d)将步骤(C)中得到的滤出液用于阳离子交换色谱；(e)将步骤(d)中得到的洗脱液用于疏水相互作用色谱；以及(f)将步骤(e)中得到的洗脱液用于阴离子交换色谱。
背景技术：
集落刺激因子(CSF)由T细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生，并且这些细胞广泛分布于机体中。已知的CSF包括GM-CSF、M-CSF和G-CSF。其中，GM-CSF是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，并且作用于粒细胞或巨噬细胞的干细胞以诱导它们的增殖和分化，从而刺激粒细胞或巨噬细胞的集落形成。M-CSF (巨噬细胞-CSF)是巨噬细胞集落刺激因子，并用主要行使刺激巨噬细胞集落形成的功能。G-CSF (粒细胞-CSF)是粒细胞集落刺激因子，并且刺激粒细胞的集落形成和诱导最终分化。通常而言，为了分离和纯化G-CSF，培养细胞并从培养上清液中分离G-CSF蛋白。但是，该方法存在G-CSF产率低的问题，并且因此不适于大量生产。另外，ChugaiPharmaceuticals C0.,Ltd.(日本)开发了一种通过使用包含编码hG_CSF之多核苷酸的基因组DNA或cDNA在哺乳动物细胞中产生糖基化hG-CSF的方法(韩国专利N0.47178,53723和57582)。但是，已知糖基化hG-CSF的糖链对于hG-CSF的活性而言不是必需的，并且使用哺乳动物细胞产生糖基化hG-CSF需要`昂贵的材料和设备，因此，这样的方法在经济上不可行。进行了许多尝试来通过使用原核细胞产生非糖基化hG-CSF。在这些研究中，产生了因ATG起始密码子而在其N末端连接有甲硫氨酸残基的hG-CSF，但该形式与其天然形式不同。此外，在微生物中产生的hG-CSF可以被来自宿主细胞或培养材料的杂质污染，并且就应用于高纯度药物而言，需要复杂的纯化过程。此外，当使用大肠杆菌作为宿主细胞时，大多数hG-CSF作为不溶性包涵体沉积在细胞中，而且必须使它们通过重折叠过程转化为活性形式，产率显著损失。在该过程中，诱导了部分还原、分子内二硫键形成或错误二硫键形成，因此需要繁琐的过程来将它们除去并且引起了效力的损失。一个半胱氨酸残基不参与形成二硫键，并且因此以游离形式存在，导致额外的效力损失和蛋白质溶液稳定性的下降。因此，需要开发一种用于大量产生在其N-末端没有甲硫氨酸残基并因此即使使用微生物也与天然形式相同的hG-CSF的方法。为了解决这些问题，本发明人在之前已报道，通过修饰大肠杆菌耐热肠毒素II的已知信号肽制备了具有高表达率的新的分泌信号肽(韩国专利N0.316347)，并且用于产生天然hG-CSF。此外，本发明人已制备了包含重组基因的表达载体，通过连接hG-CSF基因(而非肠毒素基因)靠近大肠杆菌耐热肠毒素II的经修饰信号肽制备，并且他们已使用该表达载体转化了肠杆菌，从而通过使用微生物分泌系统在周质中表达生物活性hG-CSF(韩国专利 N0.356140)。通过使用将蛋白质分泌入周质的微生物系统，可以得到可溶形式的在N-末端没有甲硫氨酸残基的天然hG-CSF。此外，周质蛋白质通常小于总细胞蛋白质的10%，因此，与位于细胞质中的蛋白质相比，需要不那么大量的重组蛋白纯化。此外，无需细胞破碎步骤，并且可以使存在于细胞质中的糖类和核酸污染最小化。但是，因为周质产生中的低表达水平，其难以工业化。因此，迫切需要开发用于以高产率和纯度纯化表达蛋白的高效方法。

发明内容
技术问题因此，本发明人努力解决了现有技术的这些问题。结果他们发现可以通过以下来以高纯度大量产生天然人粒细胞集落刺激因子:培养重组大肠杆菌以得到分泌蛋白质，然后以下列顺序将蛋白质用于酸沉淀一阳离子交换色谱一疏水相互作用色谱一阴离子交换色谱，从而完成本发明。问题的解决方案本发明的一个目的是提供用于以高纯度和产率从重组大肠杆菌纯化人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法，其包括以下步骤:(a)培养表达hG-CSF的重组大肠杆菌以通过离心得到细胞沉淀；(b)将含hG-CSF的上清液与步骤(a)中得到的细胞沉淀分离；(c)用酸处理步骤(b)中得到的上清液以通过过滤分离所得沉淀；(d)将步骤(C)中得到的滤出液用于阳离子交换色谱；(e)将步骤(d)中得到的洗脱液用于疏水相互作用色谱；以及(f)将步骤(e)中得到的洗脱液用于阴离子交换色谱。本发明的另一目的是提供通过上述方法从重组大肠杆菌分离和纯化的具有高纯度的生理活性无变体hG-CSF。本发明的有利作用根据本发明的方法，可以容易地以高产率和纯度纯化与在人体中表达的天然形式相同的人粒细胞集落刺激因子而无需其他活化过程。具体地，根据本发明的方法，高效地除去在大肠杆菌中表达的hG-CSF变体以得到具有高纯度的生理活性hG-CSF。附图简述

图1示出了得自根据本发明的纯化方法从重组大肠杆菌的周质纯化的hG-CSF的渗透提取(osmotic extraction)、酸沉淀、阳离子交换色谱和疏水相互作用色谱步骤之各溶液的SDS-PAGE结果，其中泳道1:标准品泳道2: 步骤(b)首次离心的上清液泳道3:步骤(b) 二次离心的上清液泳道4:通过步骤(C)的酸沉淀得到的上清液
泳道5:通过步骤(C)的过滤得到的滤出液泳道6:步骤⑷的SP-琼脂糖柱的柱流泳道7:步骤(d)的SP-琼脂糖柱的柱洗脱液I流泳道8:步骤⑷的SP-琼脂糖柱的柱洗脱液2流泳道9:步骤(e)的丁基-琼脂糖柱的柱流2流泳道10:步骤(e)的丁基-琼脂糖柱的柱洗脱液2流；图2示出通过本发明纯化方法的阴离子交换色谱得到的柱洗脱液的SDS-PAGE结
果O图3示出通过本发明纯化方法的阴离子交换色谱得到的柱洗脱液的反相高压色
並奸里5口术。图4示出通过本发明纯化方法的阴离子交换色谱得到的柱洗脱液的大小排阻高压色谱结果。用于实施本发明的最佳方式本发明提供了用于以高纯度简单地从重组大肠杆菌纯化大量人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)而无需其他活化过程的方法。具体地，根据本发明的纯化方法可包括以下步骤:(a)培养表达hG-CSF的重组大肠杆菌以通过离心得到细胞沉淀；(b)将含hG-CSF的上清液与步骤(a)中得到的细胞沉淀分离；(c)用酸处理步骤(b)中得到的上清液以通过过滤分离所得沉淀；(d)将步骤(C)中得到的滤出液用于阳离子交换色谱；(e)将步骤(d)中得到的洗脱液用于疏水相互作用色谱；以及(f)将步骤(e)中得到的洗脱液用于阴离子交换色谱。根据本发明的纯化方法，其特征在于在酸沉淀之后，将得自重组大肠杆菌的hG-CSF用于一系列色谱步骤(阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱和阴离子交换色谱)，从而分离适于药用的高纯度hG-CSF。在下文中，将对根据本发明的纯化方法的各步骤进行详细描述。步骤(a)是培养表达hG-CSF的重组大肠杆菌以通过离心获得细胞沉淀的步骤。用于该步骤的重组大肠杆菌是表达hG-CSF的任一重组大肠杆菌，优选在周质中表达hG-CSF的任一重组大肠杆菌，而没有限制。更优选地，本发明的hG-CSF是在大肠杆菌中表达的可溶性hG-CSF。在本发明中，在周质中表达hG-CSF的重组大肠杆菌是用包含编码分泌信号序列与hG-CSF之融合蛋白的融合基因的表达载体转化的重组大肠杆菌。重组大肠杆菌的有代表性的实例包括在本发明人的韩国专利N0.356140中公开的HM10310、HM10311 (KCCM-10154)、HM10409、HM10410 (KCCM-10151)、HM10411 (KCCM-10152)、HM10413、HM10414、HM10415、HM10510(KCCM-10153)、HM10511 和 HM10512，在该专利中，重组大肠杆菌通过大肠杆菌耐热肠毒素II的经修饰信号肽与hG-CSF的融合制备的表达载体来转化，但不限于此。为了在重组大肠杆菌的周质中表达hG-CSF，可以通过分批培养将重组大肠杆菌培养在含有补充有以下成分之LB培养基的发酵器中:1至300g/L作为碳源的葡萄糖、2至15g/L ΚΗ2Ρ04、0.5 至 3g/L (NH4)2HPO4,2 至 10g/L NaCl 和 0.5 至 10g/L 作为矿物质的 MgCl2、多种微量元素、酵母提取物和胰蛋白胨。该培养基组成适合用于重组大肠杆菌的高密度培养以及hG-CSF在大肠杆菌周质中的高表达。在本发明的一个优选实施方案中，使用重组大肠杆菌HM10411 (KCCM-10152)进行实验，结果发现培养基组成大大增加了重组大肠杆菌的细胞密度、hG-CSF在大肠杆菌中的表达水平和hG-CSF分泌入周质中的速率。离心所得的大肠杆菌培养肉汤以得到细胞沉淀。步骤(b)是将含hG-CSF的上清液与步骤(a)中得到的细胞沉淀分离的步骤。在本发明的一个优选实施方案中，当使用在周质中表达hC-CSF的重组大肠杆菌时，可以通过渗透提取将周质蛋白质(包括hG-CSF)与细胞分离。鉴于此，步骤(b)可包括向细胞沉淀中添加含蔗糖的缓冲溶液以通过离心得到细胞沉淀的步骤；和向细胞沉淀中添加蒸馏水以通过离心得到含周质蛋白质的上清液的步骤。在该步骤中，通过渗透压来提取周质蛋白质(包括hG-CSF)。首先，当用含蔗糖的缓冲溶液(例如，含10%至30%蔗糖的缓冲溶液)处理细胞沉淀时，细胞收缩。然后，当再用蒸馏水处理细胞沉淀时，收缩的细胞膨胀并且细胞壁松弛。因此，细胞壁未被破坏，但存在于细胞膜与细胞壁之间的周质蛋白质(包括hG-CSF)通过松弛的细胞壁提取。在步骤(b)的渗透提取中，可以使用蔗糖、葡萄糖、MgCl2、氯化钠等。优选地，使用蔗糖缓冲溶液。离心提取物以得到含周质蛋白质的上清液。步骤(c)是用酸处理步骤(b)中得到的含hG-CSF的上清液以通过过滤分离所得沉淀的酸沉淀步骤。在本发明的一个优选实施方案中，当使用在周质中表达hG-CSF的重组大肠杆菌时，可以通过酸沉淀来将含可溶性hG-CSF的上清液与包括周质蛋白质的上清液分离。具体地，当用酸处理步骤(b)中得到的上清液以将上清液的pH调节为5.0至5.8(优选为5.3至5.5)时，沉淀了上清液中包括周质蛋白质的不溶性材料，并通过过滤除去该沉淀以得到包含可溶性hG-CSF的上清液。适于步骤(c)的酸沉淀的酸的实例包括乙酸、磷酸、柠檬酸等，优选为乙酸。过滤可以使用适当的滤器进行，并且优选为0.45 μ m至3 μ m滤器。因为在本发明中使用了将hG-CSF分泌入周质的重组大肠杆菌，所以不需要破坏大肠杆菌，并且可以容易地从培养肉汤中获得周质级分以提取hG-CSF。步骤(d)是将步骤(C)中得到的包含可溶性hG-CSF的滤出液用于阳离子交换色谱的步骤。通过该步骤，可以除去来自宿主细胞或培养物质的大量杂质以提高纯化效率。本发明中所使用的阳离子交换色谱的柱官能团可包括弱阳离子(例如羧甲基-(CM-)和羧基(C-))和强阳离子(例如磺基(S-)、磺甲基(SM-)、磺乙基(SE-)、磺丙基(SP-)和磷酸基(P-))。可以使用多种柱树脂，包括sepharose (琼脂糖凝胶)、sephadex (葡聚糖凝胶)、agarose(琼脂糖)、sephacel (球状纤维素)、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、纤维素和toyopearL.在本发明的一个优选实施方案中，可以使用SP-sepharose (SP-琼脂糖凝胶)柱通过阳离子交换色谱进行纯化方法。在本发明中，使用含乙酸的缓冲溶液作为洗脱剂(pH范围为4.0至6.0，优选为pH5.0至6.0，盐浓度为500mM或更少、优选为200mM至500mM)来进行阳离子交换色谱。在加载洗脱液之前，可以用缓冲溶液来平衡待使用的阳离子交换柱。可以使用pH为5.0至
6.0(其可以根据条件适当地选择)的水性缓冲溶液进行阳离子交换柱的平衡。在本发明的一个优选实施方案中，提前用含IOmM醋酸钠的缓冲溶液(pH5.4)平衡阳离子交换柱。加载含hG-CSF的滤出液并吸附到经平衡的阳离子交换柱上之后，用平衡缓冲溶液冲洗柱以除去未吸附到柱上的蛋白质和杂质。 然后，将通过向平衡缓冲溶液中添加氯化钠制备的洗脱缓冲溶液用于阳离子交换柱，以洗脱吸附到柱上的hG-CSF。对此，优选地使用3至7个柱体积的洗脱缓冲溶液。在本发明的一个优选实施方案中，将4至6个柱体积的含5至20mM醋酸钠和300至400mM NaCl的缓冲溶液(pH5.2至5.6)用于柱以洗脱吸附到柱上的hG-CSF。在上述步骤中，来自宿主细胞的肽或培养基中的成分通过柱或者在洗涤步骤中除去，以有效地除去大量杂质。步骤(e)是将在步骤(d)中从阳离子交换色谱得到的洗脱液用于疏水相互作用色谱的步骤(e)，并且是通过进一步除去包含于从前一步骤的阳离子交换色谱得到的洗脱液中的杂质来提高纯度的步骤。本发明中所使用的疏水相互作用色谱可以使用具有疏水的、合适地为脂肪族的或芳族的、与多种市售基质连接的不带电荷配体的胶上进行。可以通过常规偶联技术使配体与基质相偶联从而提供不带电荷配体。此类技术的实例包括使用环氧甘油醚(glycidyl-ether)偶联的方法；用水中的环氧丙氧基三甲氧基娃烧活化琼脂糖基质，然后在醇中固定配体的方法；用双环氧化物(例如，1，4_ 丁二醇二环氧甘油醚)活化琼脂糖基质，然后与配体(例如氨基烷基或烷基硫醇)偶联的方法；1，1-羰二咪唑活化方法；和二乙烯砜活化方法。得自上述技术的凝胶在整个pH范围内不带电荷。脂肪族配体的实例可包括直链烷基(例如丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基)，支链烷基(例如异烷基或新烷基)，以及寡聚乙二醇。芳族配体优选为苯基。基质可以适当地选自多种强亲水性基质，例如，琼脂糖基质(例如琼脂糖凝胶)、有机聚合物基质(例如TSK-GEL)，以及闻度多孔有机聚合物基质。优选的基质是琼脂糖基质。合适的琼脂糖基质是琼脂糖凝月父(Amersham Biosciences)、Bio-Gel A (Bio-Rad Laboratories)、Minileak(Kem-En-TecDiagnostics A/S)等。在本发明的一个优选的实施方案中,本发明的疏水相互作用色谱在butyl-sepharose ( 丁基琼脂糖凝胶)上实施。

在本发明中，使用pH范围为pH7.0至8.5 (优选为pH7.5至8.0)、盐浓度为IOOmM或更少(优选为O至50mM)的缓冲剂作为洗脱液来进行疏水相互作用色谱。在加载洗脱液之前，可以用缓冲溶液平衡待使用的疏水相互作用柱。可以使用pH为6.8至8.5 (其可以根据条件适当地选择)的水性缓冲溶液进行疏水相互作用柱的平衡。在本发明的一个优选实施方案中，提前用含300mM硫酸铵和IOmM Tris的缓冲溶液(pH7.5)平衡疏水相互作用柱。将前一步骤中得到的洗脱液加载到经平衡的疏水相互作用柱上以吸附hG-CSF之后，用平衡缓冲溶液洗涤柱以除去未吸附到柱上的蛋白质和杂质。然后，将通过从平衡缓冲溶液中除去硫酸铵而制备的洗脱缓冲溶液用于疏水相互作用柱，以洗脱吸附到柱上的hG-CSF。对此，优选地施用I至4个柱体积的洗脱缓冲溶液。在本发明的一个优选实施方案中，将
1.2至2.5个柱体积的含5至20mM Tris的缓冲溶液(pH7.0至8.0)用于柱以洗脱吸附到柱上的hG-CSF。一般而言，在进行疏水相互作用色谱之前，可以向级分中添加盐以提高级分的传导性。其后，使用低离子强度缓冲剂从基质进行洗脱。优选地，在本发明的疏水相互作用色谱中，将硫酸铵添加到步骤(d)中得到的洗脱液中，以提高其传导性，与平衡缓冲溶液类似。然后，将洗脱液加载到经平衡的疏水相互作用柱上。在本发明的疏水相互作用色谱中，还可以加载从前述步骤的阳离子交换色谱得到的洗脱液而无需预处理，并且hG-CSF被吸附到柱上。杂质通过柱或者在冲洗步骤过程中除去，以进一步提高纯化效率。
步骤(f)是将在步骤(e)中从疏水相互作用色谱得到的洗脱液用于阴离子交换色谱的步骤，并且是完全除去从前一步骤的疏水相互作用色谱得到的洗脱液中所包含的杂质的步骤。本发明的阴离子交换色谱通常使用包含衍生有三胺基团或四胺基团(例如，二乙基氨基乙基(diethylamnoethyl)、三乙基氨基乙基、苄基-二乙基氨基乙基)的不溶性颗粒支持物的基质进行的。合适的支持物包括纤维素、琼脂糖、葡聚糖和聚苯乙烯珠。优选地，支持物衍生有三乙基氨基乙基基团。合适的阴离子交换基质的实例包括Q-s印harose (Q-琼月旨糖凝胶)(Amersham Biosciences)、Macro-Prep Q (Bio-Rad Laboratories)、Q-HyperD (BioSepra, Inc.) > Fractogel EMD-TMAE650 (Merck)等。在本发明的一个优选实施方案中，使用Q-琼脂糖凝胶来实施本发明的阴离子交换色谱。在本发明中，使用pH范围为ρΗ6.8至8.5 (优选为ρΗ7.0至8.0)、盐浓度为300mM或更少(优选为100至250mM)的缓冲溶液作为洗脱液来进行阴离子交换色谱。在加载洗脱液之前，可以使用缓冲溶液来平衡待使用的阴离子交换色谱。可以使用pH6.8至8.5(其可以根据条件适当地选择)的水性缓冲溶液进行阴离子交换柱的平衡。在本发明的一个优选实施方案中，提前用含IOmM Tris和IOOmM脲的缓冲溶液(pH7.5)平衡阴离子交换柱。将前一步骤中得到的洗脱液加载到经平衡的阴离子交换柱上以吸附hG-CSF之后，用平衡缓冲溶液冲洗柱以除去未吸附到柱上的蛋白质和杂质。然后，将通过向平衡缓冲溶液中添加氯化钠而制备的洗脱缓冲溶液用于阴离子交换柱，以洗脱吸附到柱上的hG-CSF。对此，优选地施用1.5至5个柱体积的洗脱缓冲溶液。在本发明的一个优选实施方案中，将2至4个柱体积的含5至20mM Tris,50至200mM脲和150至250mM NaCl的缓冲溶液(pH7.0至
8.0)用于柱以洗脱吸 附到柱上的hG-CSF。如上所述，通过根据本发明的酸沉淀和一系列色谱纯化hG-CSF，并且经纯化的hG-CSF经过反相高效色谱和大小排阻色谱。结果以高产率得到了纯度为99%或更高的hG-CSF。具体地，N-末端序列分析的结果示出根据本发明的方法纯化的hG-CSF的具有与天然hG-CSF的序列相同的序列，并且经纯化的hG-CSF包含100ng/ml或更少的来自宿主细胞的蛋白质、100pg/mg或更少的来自宿主细胞的DNA和10EU/IU hG-CSF或更少的肠毒素，并且示出极佳的生理活性。这些结果表明，当根据本发明的纯化方法纯化分泌到重组大肠杆菌中的周质中的hG-CSF时，可以得到高产率的具有高生理学活性和纯度的hG-CSF，并且还可以克服效力的损失和柱的有限选择。因此，根据本发明的纯化方法纯化的hG-CSF和包含所述的hG-CSF作为活性成分的药物组合物也包括在本发明的范围内。药物组合物的制备及其作用对于本领域技术人员而言是公知的，因此，将省略其详细描述。此外，根据本发明的纯化方法的特征在于，可以以高产率和纯度从重组大肠杆菌的大量培养肉汤中纯化hG-CSF。如本文所使用的，术语“大量培养肉汤”是指通过在50L或更多(优选为80L或更多并且更优选IOOL或更多)的培养基中以发酵水平培养重组大肠杆菌得到的培养肉汤。在本发明的一个优选实施方案中，将重组大肠杆菌接种在IL灭菌培养基中以得到原代种子培养肉汤，并将该种子培养肉汤接种在14L的灭菌培养基中以得到二代种子培养肉汤。最后，将二代种子培养肉汤接种在120L的灭菌培养基中，然后发酵。使用其他培养基来进行补料分批培养，从而得到180L的重组大肠杆菌的培养肉汤。当根据韩国专利N0.356140中所述的方法从重组大肠杆菌的大量培养肉汤中分离和纯化hG-CSF时，每升只产生了 70mg的hG-CSF。即，常规方法的限制在于其难以以高纯度和产率产生期望蛋白质。但是，根据本发明的纯化方法，即使培养肉汤的体积按比例增加到100L或更高，也可以通过酸沉淀和一系列色谱以110mg/L或更高的产率得到纯度为99%或更高的hG-CSF。因此，根据本发明的纯化方法可以有效地用于从重组大肠杆菌的大量培养肉汤中分离和纯化hG-CSF。因此，可以通过其工业应用获得较高的产率。本发明的实施方式在下文中，将参照以下实施例对本发明进行更详细的描述。但是，这些实施例仅出于说明的目的，并且本发明不旨在受这些实施例限制。参考实施例1:在周质中表达hG-CSF的重组大肠杆菌的培养将用表达载体T017SG (具有大肠杆菌耐热肠毒素II的经修饰信号肽与hG_CSF的融合物)转化的大肠杆菌HM10411(KCCM-10152，韩国专利N0.356140)接种在含有ILLB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L)的玻璃培养容器中以进行原代种子培养。在剧烈搅拌和通风的条件下，将培养基在37°C下培养11至13小时，然后接种在含有14L的灭菌LB培养基的培养容器中以进行二代种子培养2至3小时。将所得的培养肉汤用作用于发酵的种子，并接·种在120L的灭菌培养基(补充有1.4g/L作为碳源的葡萄糖、IOg/L KH2PO4,2.5g/L(NH4)2HP04、5g/L NaCl 和 1.2g/L 作为矿物质的 MgCl2、多种微量元素、酵母提取物和胰蛋白胨)中。在发酵过程中，添加另外的葡萄糖和酵母提取物以进行补料分批培养25小时或更长，并且完成培养以得到180L的培养肉汤。完成发酵之后，以7，OOOrpm离心经发酵肉汤，将所得细胞沉淀在_70°C储存。实施例1:从重组大肠杆菌的培养肉汤纯化hG-CSF<!-!>周质蛋白质的滲透提取将在参考实施例中得到的大肠杆菌沉淀悬浮在170L的蔗糖缓冲溶液(20%蔗糖、ImM EDTA、30mM Tris, pH7.5)中，搅拌90分钟，然后以7，OOOrpm进行首次离心，从而分离沉淀。在4°C向所分离的沉淀中添加170L的蒸馏水，以7，OOOrpm进行二次离心以除去沉淀并分离包含周质蛋白质的上清液。在该过程中，提取存在于大肠杆菌周质中的蛋白质。通过SDS-PAGE分析首次离心和二次离心过程中得到的上清液(图1的泳道2和3)。<1~2> 酸沉淀将1%的乙酸添加到在实施例〈1-1>中得到的含周质蛋白质的上清液中以将pH调节为5.6至5.7。此时，通过酸处理沉淀包含于上清液中的不溶性材料，进行过滤以将它们除去，以得到含hG-CSF的上清液。通过SDS-PAGE分析通过酸处理得到的上清液和通过过滤得到的滤出液(图1的泳道4和5)。<1~3>阳离子夺换色谱按照如下所述使用SP-琼脂糖凝胶进行实施例〈1-2>中得到的滤出液的阳离子交换色谱。以40cm/小时的流量加载滤出液并吸附到用缓冲溶液I (IOmM醋酸钠，pH5.4)平衡的SP-琼脂糖柱上，然后通过用相同的缓冲溶液冲洗来除去未吸附到柱上的蛋白质。然后，将5个柱体积的含300mM氯化钠的缓冲溶液I (IOmM醋酸钠，pH5.4)用于柱以从柱洗脱hG-CSF。通过SDS-PAGE分析通过阳离子交换色谱得到的流和洗脱液(图1的泳道6至8)。
〈1-4>疏水相互作用色谱通过添加硫酸铵来将实施例〈1-3>中得到的洗脱液稀释为终浓度为300mM，并且按照如下所述使用丁基琼脂糖凝胶柱进行疏水相互作用色谱。以80cm/小时的流量加载洗脱液并吸附到用缓冲溶液2 (300mM硫酸铵，IOmM Tris、pH7.5)平衡的丁基琼脂糖凝胶柱上，然后通过用相同的缓冲溶液冲洗来除去未吸附到柱上的蛋白质。然后，将1.5个柱体积的缓冲溶液2(10mM Tris，pH7.5)(硫酸铵除外)用于柱以从柱洗脱hG-CSF。通过SDS-PAGE分析通过疏水相互作用色谱得到的流和洗脱液(图1的泳道9和10)。<1~5>阴离子夺换色谱通过添加脲来将实施例〈1-4>中得到的洗脱液稀释为终浓度为50mM，并且按照如下所述使用Q-琼脂糖凝胶柱进行阴离子交换色谱。以60cm/小时的流量加载洗脱液并吸附到用缓冲溶液3 (IOmM Tris, pH7.5，IOOmM脲)平衡的Q-琼脂糖凝胶柱上，然后通过用相同的缓冲溶液洗涤来除去未吸附到柱上的蛋白质。然后，将3个柱体积的含250mM氯化钠的缓冲溶液3 (IOmM Tris, pH7.5，IOOmM脲)用于柱以从柱洗脱hG-CSF。通过SDS-PAGE分析通过阴离子交换色谱得到的洗脱液(图2的泳道2)。为了检查通过实施例〈1-1>至〈1-5>的方法从重组大肠杆菌纯化的hG-CSF的纯度，进行SDS-PAGE、N-末端序列分析、反相高压色谱和大小排阻高压色谱。

实验性实施例1 =SDS-PAGE分析首先，根据常规方法通过SDS-PAGE分析实施例〈1_1>至〈1_5>的各方法中得到的上清液、柱流和柱洗脱液和标准G-CSF (NIBSC，Code N0.88/502)。SDS-PAGE的结果示于图1和2中。在图1中，泳道I是标准G-CSF，泳道2是通过实施例〈1-1>的渗透提取得到的首次离心的上清液，泳道3是通过实施例〈1-1>的渗透提取得到的二次离心的上清液，泳道4是在实施例〈1-2>的酸沉淀步骤中通过酸处理得到的上清液，泳道5是在实施例〈1-2>的酸沉淀步骤中通过过滤得到的滤出液，泳道6是从实施例〈1-3>的SP-琼脂糖凝胶柱色谱得到的柱流，泳道7和8是从实施例〈1-3>的SP-琼脂糖凝胶柱色谱得到的柱洗脱液I和2，泳道9是从实施例〈1-4>的丁基琼脂糖凝胶柱色谱得到的柱流，以及泳道10是从实施例<1-4>的丁基琼脂糖柱色谱得到的柱洗脱液。在图2中，泳道I是标准Met-hG-CSF，泳道2是实施例〈1-5>的Q-琼脂糖凝胶柱色谱得到的柱洗脱液。SDS-PAGE分析的结果显示，根据本发明的纯化方法从重组大肠杆菌中分离和纯化的hG-CSF之分子量与天然形式的分子量相等。实验性实施例2:N-末端序列分析将通过实施例〈1_>至〈1-5>的方法纯化的hG-CSF在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，并转染到PVDF膜上。使用Ponceau S溶液对经转染的膜进行染色，然后在韩国基础科学研究院(汉城分院)分析N-末端序列(15个氨基酸)。结果发现根据本发明的纯化方法从重组大肠杆菌分离和纯化之hG-CSF的N-末端序列与天然形式的N-末端序列相同，并且其包含100ng/mg或更少的来自宿主的蛋白质、100pg/mg或更少的来自宿主的DNA和10EUAU hG-CSF或更少的肠毒素。实验性实施例3:反相高压色谱将实施例〈1-5>中得到的洗脱液用于丁基甲硅烷基二氧化硅柱，然后向柱中添加0.1% TFA/水和0.1% TFA/乙腈作为流动相以进行反相高压色谱。所得色谱图示于图3中。如图3所示，发现根据本发明的纯化方法从重组大肠杆菌分离和纯化的hG-CSF通过有效除去具有类似特征的微变体(microvariants)而具有非常高的纯度。实验性实施例4:大小排阻高压色谱将实施例〈1-5>中得到的洗脱液用于亲水二氧化硅凝胶柱(分子量为20，000至200，000)，然后向柱中添加20mM磷酸钾(pH6.0)/200mM氯化钠作为流动相以进行大小排阻
高压色谱。所得色谱示于图4中。如图4所示，发现根据本发明的纯化方法从重组大肠杆菌分离和纯化的hG-CSF通过有效除去具有类似特征的肽而具有非常高的纯度。在实验性实施例1至4中，证实可以根据本发明的纯化方法以110mg/L重组大肠杆菌的培养肉汤的产率得到纯度为99%或更高的天然hG-CSF。作为比较组，根据韩国专利N0.356140中所公开的纯化方法(离子交换树脂、吸附和凝胶过滤柱或抗体柱色谱)从重组大肠杆菌纯化了 hG-CSF，并且以70mg/L培养肉汤的产率得到了纯度为99%或更高的hG-CSF。该结果表明与韩国专利N0.356140中所公开的方法相比，可以通过本发明的纯化方法以50%或更高的提高的产率得到纯度为99%或更高的hG-CSF。实验性实施例5:离体效力测试为了检查根据本发明的纯化方法得到的hG-CSF的生理学活性，使在实施例〈1-5>和国际标准(NIBSC)中纯化的hG-CSF在来自小鼠骨髓细胞中进行离体效力测试。具体地，切开4至6周龄小鼠的股骨，获得骨髓细胞，然后以适当的密度培养。将经纯化的hG-CSF和国际标准样本与经培养的骨髓细 胞以多种浓度(100.00,33.33、11.11,3.70、1.23,0.41、
0.14,0.05,0.02,0.01ng/ml)混合，并培养2至3天。向培养基中添加[甲基-H2]胸腺嘧啶，再将细胞培养10至20小时。然后，分离细胞，并使用β-计数器测量CPM。结果发现根据本发明的纯化方法分离和纯化的hG-CSF满足0.6至1.4X 108IU/mg的国际标准。工业实用性本发明的方法可以容易地以高产率和纯度纯化人粒细胞集落刺激因子(与在人体中表达的天然形式相同)，而无需其他活化过程。特别地，根据本发明的方法，高效地除去在大肠杆菌中表达的hG-CSF变体以得到具有高纯度的生理活性hG-CSF。
权利要求
1.用于以高产率从重组大肠杆菌(E.coli)纯化人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法，其包括以下步骤: (a)培养表达hG-CSF的重组大肠杆菌以通过离心得到细胞沉淀； (b)将含hG-CSF的上清液与步骤(a)中得到的细胞沉淀分离； (c)用酸处理步骤(b)中得到的上清液以通过过滤分离所得沉淀； (d)将步骤(C)中得到的滤出液用于阳离子交换色谱； (e)将步骤(d)中得到的洗脱液用于疏水相互作用色谱；以及 (f)将步骤(e)中得到的洗脱液用于阴离子交换色谱。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，所述hG-CSF表达于重组大肠杆菌的周质中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述重组大肠杆菌是选自以下的一种或更多种:大肠杆菌BL21 (DE3) /pT14SSlSG(HM10310)、大肠杆菌BL21 (DE3)/pT14SSlS17SEG(HM10311 ；登记号 KCCM-1O154)、大肠杆菌 BL21 (DE3)/pTOlSG (HM10409)、大肠杆菌 BL21 (DE3) /PT01S17SG (HM1041 0 ;登记号 KCCM-10151)、大肠杆菌 BL21 (DE3) /pT017SG (HM10411 ；登记号 KCCM-10152)、大肠杆菌 BL21 (DE3)/pT017TG (HM10413)、大肠杆菌 BL21 (DE3) /PT017AG (HM10414),大肠杆菌 BL21 (DE3)/pT017GG (HM10415)、大肠杆菌 BL21(DE3)/PBAD2M3VG (HM10510 ;登记号 KCCM-10153)、大肠杆菌 BL21 (DE3)/pBAD17SG(HM10511)以及大肠杆菌 BL21(DE3)/pBAD2M3V17SG(HM10512)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中，通过渗透提取将所述含hG-CSF的上清液与所述细胞沉淀分离。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述渗透提取通过以下来进行:用含10%至30%蔗糖的缓冲溶液处理所述细胞沉淀以通过离心得到细胞沉淀，向所述细胞沉淀中添加蒸馏水，然后进行离心。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中，通过酸处理将所述上清液的pH调节为5.0至5.8。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的所述酸选自乙酸、磷酸和柠檬酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中通过使用选自琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、琼脂糖、球状纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、纤维素和toyoperl的柱来进行步骤(d)的所述阳离子交换色谱。
9.根据权利要求8所述的方法，其中使用SP-琼脂糖凝胶柱来进行步骤(d)的所述阳离子交换色谱。
10.根据权利要求1所述的方法，其中使用pH范围为4.0至6.0、盐浓度为200mM至500mM的含乙酸的缓冲溶液来进行步骤(d)的所述阳离子交换色谱。
11.根据权利要求10所述的方法，其中使用pH为5.0至6.0的含200mM至500mM氯化钠和5mM至20mM乙酸钠的缓冲溶液来进行步骤(d)的所述阳离子交换色谱。
12.根据权利要求1所述的方法，其中使用具有选自丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基、异烷基、新烷基和寡聚乙二醇的官能团的琼脂糖凝胶、Bio-Gel A或Minileak柱来进行步骤(e)的所述疏水相互作用色谱。
13.根据权利要求12所述的方法，其中使用丁基琼脂糖凝胶柱来进行步骤(e)的所述疏水相互作用色谱。
14.根据权利要求1所述的方法，其中使用pH范围为7.0至8.5、盐浓度为OmM至IOOmM的缓冲溶液来进行步骤(e)的所述疏水相互作用色谱。
15.根据权利要求14所述的方法，其中使用pH为7.0至8.0的含5mM至20mM Tris的缓冲溶液来进行步骤(e)的所述疏水相互作用色谱。
16.根据权利要求1所述的方法，其中使用选自Q-琼脂糖凝胶、Macro-PrepQ、Q-HyperD和Fractogel EMD-TMAE650的柱来进行步骤(f)的所述阴离子交换色谱。
17.根据权利要求16所述的方法，其中使用Q-琼脂糖凝胶柱来进行步骤(f)的所述阴离子交换色谱。
18.根据权利要求1所述的方法，其中使用pH范围为6.5至8.5、盐浓度为IOOmM至300mM的缓冲溶液来进行步骤(f)的所述阴离子交换色谱。
19.根据权利要求18所述的方法，其中使用pH为7.0至8.0的包含IOOmM至300mM氯化钠、5mM至20mM Tris和50mM至200mM脲的缓冲溶液来进行步骤(f)的所述阴离子交换色谱。
20.具有高纯度的人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)，其根据权利要求1所述的方法从重组大肠杆菌分离 和纯化。
全文摘要
本发明提供了一种用于以高产率和纯度从重组大肠杆菌纯化大量人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法。根据本发明的方法，可以容易地以高产率和纯度纯化与在人体中表达的天然形式相同的人粒细胞集落刺激因子而无需其他活化过程。特别地，根据本发明的纯化方法，高效地除去在大肠杆菌中表达的hG-CSF变体以得到具有高纯度的生理活性hG-CSF。
文档编号C07K1/16GK103228672SQ201180056986
公开日2013年7月31日 申请日期2011年10月26日 优先权日2010年10月29日
发明者崔圣喆, 金镇基, 吴映学, 李钟守 申请人:韩美科学株式会社