设计核酸及其使用方法

设计核酸及其使用方法
【专利摘要】本发明提供了递送生物物质(例如修饰的核酸)到细胞以调节蛋白质表达的组合物和方法。所述组合物和方法包括使用修饰的信使RNA，且可用于生产蛋白质。
【专利说明】设计核酸及其使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2010年10月I日提交的美国临时申请61/404，413的优先权，其公开的内容视为本申请公开内容的一部分(并在此通过引用而全文引入)。
【背景技术】
[0003]天然存在的RNA是由四种基本的核糖核苷酸ATP、CTP、UTP和GTP合成的，但也可以含有转录后修饰的核苷酸。而且，在RNA中已经鉴定出大约100种不同的核苷修饰(Rozenski,J,Crain,P,和 McCloskey, J(1999)。RNA 修饰数据库:1999 年更新,Nucl AcidsRes 27:196-197)。但是，在免疫刺激潜能和RNA翻译效率方面，核苷修饰所起的作用尚不明了。
[0004]影响蛋白质表达的现有方法学中存在许多问题。例如，引入细胞的异源DNA (不论异源DNA是否整合入染色体)可能由子代或后代细胞遗传。引入的DNA可以以某种频率整合入宿主细胞的基因组DNA，从而改变和/或破坏宿主细胞的基因组DNA。此外，在产生蛋白质之前必须经过多个步骤。一旦进入细胞，DNA必须转运到细胞核中，在细胞核内转录成RNA。之后从DNA转录的RNA必须进入细胞质，在细胞质内翻译成蛋白质。对多个处理步骤的需求导致了在感兴趣的蛋白质产生之前的时间延滞。此外，在细胞内实现DNA的表达存在困难；经常地，DNA进入细胞但没有表达，或者没有以合理的速度或浓度表达。将DNA引入诸如原代细胞或修饰的细胞系的细胞时，这可能尤其是个问题。
[0005]本领域需要解决核调节酸细胞内翻译的生物学模式。
[0006]除非另有解释，否则在本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属【技术领域】普通技术人员通常的理解具 有相同的含义。尽管，类似于或等同于本文所述的方法和材料也可用于本发明的实施和检测，但在此描述了适合的方法与材料。材料、方法和实施例仅为示例性的，而非旨在限制。本发明其他特征可以自以下发明详述和权利要求明显看出。
[0007]发明简述
[0008]本文描述了生产蛋白质、多肽和肽的方法。例如，所述方法包括在所述感兴趣的蛋白质、多肽或肽在细胞内产生(例如，翻译)的条件下，将编码感兴趣的蛋白质、多肽或肽的核酸(例如，本文所述的修饰核酸)引入细胞(例如，人细胞)。在一些【具体实施方式】中，所述核酸包含一个或多个核苷修饰(例如，一个或多个本文所述的核苷修饰)。在一些【具体实施方式】中，所述核酸能逃脱该核酸所引入的细胞的天然免疫反应。在一些【具体实施方式】中，所述蛋白质、多肽或肽是本文所述的治疗性蛋白质。在一些【具体实施方式】中，所述蛋白质、多肽或肽包含一个或多个翻译后修饰(例如，人细胞中存在的翻译后修饰)。本文还描述了用以生产蛋白质的组合物和试剂盒。本文进一步描述了具有(例如，通过本文所述的方法产生的)改变的蛋白质水平的细胞和培养物。
[0009]一方面，本发明涉及在细胞内生产感兴趣的蛋白质(例如，异源蛋白质)的方法，所述方法包括步骤:(i )提供能进行蛋白质翻译的靶细胞；以及(? )在所述感兴趣的蛋白质在靶细胞内生产的条件下，向靶细胞内引入包含第一分离的核酸的组合物，所述第一分离的核酸包含编码感兴趣的蛋白质的可翻译区和核苷修饰。在一些实施方式中，所述方法进一步包括从细胞中充分纯化感兴趣的蛋白质的步骤。在一些实施方式中，所述感兴趣的蛋白质是分泌蛋白。
[0010]另一方面，本发明涉及在细胞内生产感兴趣的蛋白质(例如，异源蛋白质)的方法，所述方法包括步骤:(i )提供能进行蛋白质翻译的靶细胞，以及(ii )在所述感兴趣的蛋白质在细胞内产生的条件下，向靶细胞内引入组合物，所述组合物包含:(a)包含编码感兴趣的蛋白质的可翻译区和核苷修饰的第一分离的核酸；和(b)包含抑制性核酸的第二核酸。在一些实施方式中，所述方法进一步包括从细胞中充分纯化感兴趣的蛋白质的步骤。在一些【具体实施方式】中，所述感兴趣的蛋白质是分泌蛋白。
[0011]一方面，本发明涉及提高细胞内感兴趣的重组表达蛋白质的产量的方法，包括步骤:(i )提供包含编码感兴趣的蛋白质的重组核酸的靶细胞；和(ii )在效应蛋白(effector protein)在祀细胞内生产的条件下，向祀细胞引入含有第一分离的核酸的组合物，从而提高细胞内重组表达蛋白的产量，所述第一分离的核酸包含编码翻译效应蛋白的可翻译区和核苷修饰。
[0012]在一些具体实施方 式中，所述靶细胞是哺乳动物细胞。在一些【具体实施方式】中，所述靶细胞是酵母细胞。在一些【具体实施方式】中，所述靶细胞是细菌细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一些【具体实施方式】中，所述感兴趣的蛋白质是分泌蛋白质。在一些【具体实施方式】中，所述感兴趣的蛋白质是跨膜蛋白。在一些【具体实施方式】中，所述感兴趣的蛋白质是抗体或其抗原结合片段。在一些【具体实施方式】中，所述感兴趣的蛋白质是生长因子或细胞因子。在一些【具体实施方式】中，所述感兴趣的蛋白质是肽或肽类似物。在一些【具体实施方式】中，所述翻译效应蛋白是神经酰胺转移蛋白(CERT)。在一些【具体实施方式】中，在靶细胞中以有效提高重组表达蛋白质翻译效率的量翻译所述翻译效应蛋白。在一些【具体实施方式】中，在靶细胞中以有效减少细胞内除了重组表达蛋白质以外的蛋白质的翻译效率的量翻译所述翻译效应蛋白。在一些【具体实施方式】中，在靶细胞中以有效减少含有重组表达蛋白质的包涵体的形成的量翻译所述翻译效应蛋白。在一些【具体实施方式】中，在靶细胞中以有效减少细胞内重组表达蛋白质的降解的量翻译所述翻译效应蛋白。在一些【具体实施方式】中，在靶细胞中以有效增加重组表达蛋白质的分泌的量翻译所述翻译效应蛋白。
[0013]另一方面，本发明涉及用以改变靶细胞中感兴趣的蛋白质的水平的方法，所述方法包括步骤:(i )调节靶细胞内的至少一种翻译效应分子的活性；以及(? )培养所述细胞。在一些【具体实施方式】中，所述靶细胞不包含重组核酸。在一些【具体实施方式】中，所述方法进一步包括分离感兴趣的蛋白质的步骤。
[0014]另一方面，本发明涉及用以调整靶细胞内感兴趣的蛋白质水平的方法，包括步骤:i )调节靶细胞内至少一种翻译效应分子的活性，其中所述调节包括向靶细胞中引入含有
编码翻译效应蛋白的可翻译区和核苷修饰的第一分离的核酸；以及ii )培养所述细胞。
[0015]一方面，本发明涉及一种具有改变了的蛋白质水平的动物细胞(例如，哺乳动物细胞)，其通过下述步骤产生:(i )向细胞内引入有效量的含有编码翻译效应蛋白的可翻译区和核苷修饰的第一分离的核酸；以及(? )培养所述细胞。在某些实施方式中，引入细胞的第一分离的核酸的有效量通过滴定由可翻译区翻译的蛋白质的预期量确定。
[0016]一方面，本发明涉及含有大量本发明所述细胞的高密度培养物。在一些【具体实施方式】中，所述培养包括分批补料过程。在一些【具体实施方式】中，所述培养包括连续给料过程。
[0017]一方面，本发明涉及用于蛋白质生产的组合物，所述组合物包含含有可翻译区和核苷修饰的第一分离的核酸，以及适合第一核酸的可翻译区翻译的哺乳动物细胞，其中所述核酸显示出减少的由细胞核酸酶引起的降解。在一些【具体实施方式】中，所述哺乳动物细胞含有重组核酸。
[0018]另一方面，本发明涉及用于蛋白质生产的组合物，所述组合物包含:(i )含有可翻译区和核苷修饰的第一分离的核酸，其中所述核酸显示出减少的由细胞核酸酶引起的降解；(? )含有抑制性核酸的第二核酸；以及(iii)适合第一核酸的可翻译区翻译的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞含有能与抑制性核酸反应的目标核酸。在一些【具体实施方式】中，所述哺乳动物细胞含有重组核酸。
[0019]一方面，本发明涉及用于蛋白质生产的试剂盒，所述试剂盒包括包含可翻译区和核酸修饰的第一分离的核酸，及其包装和说明书，其中所述核酸能逃脱所述第一分离的核酸所引入的细胞的天然免疫反应。
[0020]另一方面，本发明涉及用于蛋白质生产的试剂盒，所述试剂盒包括:(i )以引入靶细胞时有效产生预期量的由可翻译区编码的蛋白质的量提供的，含有可翻译区的第一分离的核酸；(? )以有效地基本抑制细胞天然免疫反应的量提供的含有抑制性核酸的第二核酸；以及(iii)其包装和说明书。
[0021]另一方面，本发明涉及用于蛋白质生产的试剂盒，所述试剂盒包括含有可翻译区和核苷修饰的第一分离的核酸，及其包装和说明书，其中所述核酸显示出减少的由细胞核酸酶引起的降解。
[0022]一方面，本发明涉及用于蛋白质生产的试剂盒，所述试剂盒包括含有可翻译区和至少二个不同核苷修饰的第一分离的核酸，及其包装和说明书，其中所述核酸显示出减少的由细胞核酸酶引起的降解。
[0023]另一方面，本发明涉及用于蛋白质生产的试剂盒，所述试剂盒包括:(i )含有可翻译区的第一分离的核酸；(? )含有抑制性核酸的第二核酸；以及(iii)其包装和说明书。
[0024]另一方面，本发明涉及用于蛋白质生产的试剂盒，所述试剂盒包括:(i )含有可翻译区和至少一个核苷修饰的第一分离的核酸，其中所述核酸显示出减少的由细胞核酸酶引起的降解；(? )含有抑制性核酸的第二核酸；以及(iii)其包装和说明书。
[0025]一方面，本发明涉及用于蛋白质生产的试剂盒，包括编码可翻译区的第一分离的核酸，以及其包装和说明书，其中可翻译区编码蛋白质，其中所述第一核酸含有核酸修饰，其中所述第一核酸与不含核酸修饰的核酸相比，在所述第一分离的核酸所引入的细胞中的降解显示出减少。
[0026]另一方面，本发明涉及用于蛋白质生产的试剂盒，包括编码可翻译区的第一分离的核酸，以及其包装和说明书，其中可翻译区编码蛋白质，其中所述第一核酸含有核酸修饰，其中所述第一核酸与不含核酸修饰的核酸相比，在所述第一分离的核酸所引入的细胞中显不出更稳定。
[0027]—方面，本发明涉及用于免疫球蛋白生产的试剂盒，包括第一分离的核酸，以及包装和说明书，其中所述第一分离的核酸包含:i )编码免疫球蛋白的可翻译区和ii )核酸修饰，其中所述第一核酸能逃脱所述第一分离的核酸所引入的细胞的天然免疫反应，其中所述可翻译区基本不含胞苷和尿嘧啶核苷酸。
[0028]另一方面，本发明涉及通过使用上述试剂盒产生的哺乳动物细胞。
[0029]另一方面，本发明涉及自含有第一分离的核酸的生产细胞产生的分离的免疫球蛋白，所述第一分离的核酸含有i )编码免疫球蛋白的可翻译区和?)核酸修饰，其中所述第一分离的核酸能逃脱所述细胞的天然免疫反应，其中所述可翻译区基本不含胞苷或尿嘧啶核苷酸或胞苷和尿嘧啶核苷酸的组合。
[0030]一方面，本发明涉及含有有效量的本文所述蛋白质的药物制剂。
[0031]另一方面，本发明涉及含有有效量的第一核酸的药物制剂，所述第一核酸含有i )编码免疫球蛋白的可翻译区和ii )核酸修饰，其中所述第一核酸显示出减少的由细胞核酸酶引起的降解且能逃脱所述第一核酸所引入的细胞的天然免疫反应，其中所述可翻译区基本不含胞苷和尿嘧啶核苷酸。
[0032]前述方法、细胞、培养物、组合物、制剂和试剂盒的【具体实施方式】可以包含一个或多个以下特征:
[0033]在一些【具体实施方式】中，所述第一分离的核酸包括信使RNA (mRNA)。在一些【具体实施方式】中，所述mRNA包括选自以下组成组的至少一个核苷:B密唳-4-酮核苷、5-氮-尿苷、2-硫-5-氮-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫-假尿苷、2-硫-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-炔丙基-尿苷、1-炔丙基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、1-甲基_1_去氮_假尿苷、2-硫-1-甲基-1-去氮_假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2_硫-二氢尿苷、2-硫-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫-假尿苷 。在一些【具体实施方式】中，所述mRNA包括选自以下组成组的至少一个核苷:5_氮-胞苷、伪异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-伪异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并伪异胞苷、2-硫_胞苷、2-硫-5-甲基-胞苷、4-硫_伪异胞苷、4-硫-1-甲基-伪异胞苷、4-硫-1-甲基-1-去氮-伪异胞苷、1-甲基-1-去氮-伪异胞苷、zebularine、5_氮-zebularine、5_甲基-zebularine、5_ 氮-2-硫-zebularine、2_ 硫-zebularine、2_ 甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-伪异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-伪异胞苷。在一些【具体实施方式】中，所述mRNA包括选自以下组成组的至少一个核苷:2_氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-2，6-二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、N6，N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、和2-甲氧基-腺嘌呤。在一些【具体实施方式】中，mRNA包括选自以下组成组的至少一个核苷:肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷、怀丁昔(wybutosine)、7_去氣_鸟昔、7_去氣-8-氣-鸟昔、6_硫-鸟昔、6_硫-7-去氣_鸟苷、6-硫-7-去氮-8-氮-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2，N2-二甲基鸟苷、8-氧-鸟苷、7-甲基-8-氧-鸟昔、1_甲基_6-硫_鸟昔、N2-甲基_6-硫_鸟昔和N2, N2- 甲基_6-硫_鸟昔。
【专利附图】

【附图说明】
[0034]图1描述了用编码人G-CSF的modRNA体外转染中国仓鼠卵巢后12和24小时测量的人G-CSF酶联免疫实验(ELISA)的条形图。
[0035]图2描述了用编码曲妥珠单抗(Trastuzumab)的modRNA的重链和轻链体外转染中国仓鼠卵巢细胞后12、24和36小时的人IgG的酶联免疫实验(ELISA)的条形图。
[0036]图3描述了用编码曲妥珠单抗的modRNA的重链和轻链体外转染人胚肾细胞(HEK293)后36小时测量的人IgG的酶联免疫实验(ELISA)的条形图。RU R2、R3是在24孔板中进行的三次转染实验且通过未处理样品校正。
[0037]图4描述了用编码曲妥珠单抗的modRNA的重链和轻链体外转染中国仓鼠卵巢细胞后24小时测定的western blot图像。HC和LC分别表示曲妥珠单抗的重链和轻链。
[0038]图5描述了用编码曲妥珠单抗和利妥昔单抗(Rituximab)两者的modRNA的重链和轻链体外转染中国仓鼠卵巢细胞后13小时的细胞免疫染色的图像。
[0039]图6描述了编码曲妥珠单抗和利妥昔单抗的modRNA的结合免疫印迹实验的图像。黑框表示感兴趣的蛋白。
[0040]发明详述
[0041]本文描述了生产蛋白质、多肽和肽的方法。本发明至少部分地提供了在细胞内生产感兴趣的蛋白质、多肽或肽(例如，异源蛋白质)的方法，提高细胞内感兴趣的蛋白质、多肽或肽(例如，重组表达蛋白质)的产量的`方法，以及改变细胞内感兴趣的蛋白质、多肽或肽的水平的方法。例如，所述方法可以包括在所述感兴趣的蛋白质、多肽或肽在细胞内生产(例如，翻译)的条件下，将编码感兴趣的蛋白质、多肽或肽的核酸(例如，本文所述的修饰核酸)引入细胞(例如，人细胞)的步骤。在一些【具体实施方式】中，所述核酸含有一个或多个核苷修饰(例如，本文所述的一个或多个核苷修饰)。在一些【具体实施方式】中，所述核酸包括一个或多个核苷修饰(例如，一个或多个本文所述的核苷修饰)。在一些【具体实施方式】中，所述核酸能逃脱所述核酸所引入的细胞的天然免疫反应，从而提高细胞内蛋白生产效率。在一些【具体实施方式】中，所述蛋白质是本文所述的治疗性蛋白质。在一些【具体实施方式】中，所述蛋白质含有一个或多个翻译后修饰(例如，存在于人类细胞中的翻译后修饰)。本文还描述了用于蛋白质生产的组合物和试剂盒。本文进一步描述了具有(例如，通过本文所述方法产生的)改变的蛋白质水平的细胞和培养物。
[0042]通常，引入细胞内的外源核酸(特别是病毒核酸)引起天然免疫反应，从而导致产生干扰素(IFN)和细胞死亡。尽管如此，对于重组蛋白质的生产，人们仍感兴趣于将核酸(例如核糖核酸(RNA))递送入细胞(例如，在细胞培养物中、在体外、在体内或离体)从而在细胞内翻译该核酸和生产编码的蛋白质。本文部分地提供了编码能调节细胞功能和/或活性的有用的多肽的核酸，以及制备和使用这些核酸和多肽的方法。如本文所述，这些核酸能减少其所引入的细胞群的天然免疫活性，因而提高蛋白质在该细胞群中的生产效率。进一步地，本文描述了本发明所述核酸和蛋白质的一个或多个额外的有利活性和/或性质。
[0043]蛋白质生产方法
[0044]本文提供的方法可用于提高细胞培养过程中蛋白质产物的产量。相对于相应的未修饰核酸，在含有大量宿主细胞的细胞培养物中，本文所述的修饰的mRNA的引入导致蛋白质生产效率提高。例如通过表现出细胞转染的增加、自所述核酸翻译的蛋白质的增加、核酸降解的减少和/或所述宿主细胞天然免疫反应的减少，可以证明蛋白质生产效率的这种提高。可以通过ELISA测定蛋白质的生产，可以通过本领域已知的多种功能试验测定蛋白质活性。可以在连续补料或分批补料的过程中产生所述蛋白质产物。
[0045]细胞培养和生长
[0046]在本发明的方法中，培养细胞。细胞可以悬浮培养或贴壁培养。细胞可以在多种容器(包括，例如生物反应器、细胞袋、摇袋(wave bag)、培养皿、烧瓶、超级烧瓶(hyperflasks)和其他本领域普通技术人员已知的容器)中培养。细胞可以在IMDMdnvitrogen,目录编号12440-53)或包括化学上确定的培养基配方在内的任意其他合适的培养基中培养。对本领域普通技术人员而言，适合细胞培养的周围环境条件(例如温度和大气组成)是熟知的。本发明的方法可用于任何适于在蛋白质生产中使用的细胞。一个【具体实施方式】中，所述细胞选自由动物细胞(例如，哺乳动物细胞)、细菌细胞、植物、微生物、藻类和真菌细 胞组成的组。在一些【具体实施方式】中，所述细胞是哺乳动物细胞，例如人类、小鼠、大鼠、山羊、马、兔、仓鼠或牛细胞。例如，所述细胞可以来自任何已建立的细胞系，包括但不限于 HeLa、NSO、SP2/0、HEK 293T、Vero、Caco、Caco-2、MDCK、C0S-1、C0S-7、K562、Jurkat, CHO-KU DG44、CHOKISV, CHO-S, Huvec, CV-U HuH_7、NIH3T3、HEK293、293、A549, HepG2, MR-90、MCF-7、U-20S、Per.C6、SF9、SF21 或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。某些【具体实施方式】中，所述细胞是真菌细胞，例如选自由黄孢菌(Chrysosporium)细胞、曲霉(Aspergillus)细胞、木霉(Trichoderma)细胞、网柱黏菌(Dictyostelium)细胞、假丝酵母(Candida)细胞、酵母(Saccharomyces)细胞、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces)细胞和青霉(Penicillium)细胞组成的组的细胞。在某些其他【具体实施方式】中，所述细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或BL21细胞。用于本方法转染的初级和次级细胞可以自多种组织获得，且包括所有能在培养中维持的细胞种类。例如，通过本方法转染的初级和次级细胞可以包括成纤维细胞、角化细胞、上皮细胞(例如，乳腺上皮细胞、肠上皮细胞)、内皮细胞、神经胶质细胞、神经细胞、血液组成成分(例如，淋巴细胞、骨髓细胞)、肌肉细胞和上述体细胞种类的前体细胞。初级细胞可以自同一物种或另一物种供体(例如，小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、牛、鸟、绵羊、山羊、马)获得。
[0047]本发明的细胞可用于能纯化和通过常规给药方式递送的治疗性产品的体外生产。无论是否扩大，这些细胞均能用于收获细胞内或细胞外蛋白质产物的大规模培养。
[0048]细胞核酸递送的方法
[0049]本发明的方法增强了核酸在体内、离体或在培养物中向细胞群中的递送。例如，将包含大量宿主细胞(例如真核细胞，例如酵母或哺乳动物细胞)的细胞培养物与含有增强的核酸的组合物相接触，所述增强的核酸具有至少一个核苷修饰和任选的可翻译区。所述组合物还通常含有转染试剂或其他提高增强的核酸向宿主细胞中的摄取效率的化合物。相对于相应的未修饰核酸，所述增强的核酸在细胞群中显示出增强的保留能力。所述增强的核酸的保留能力比未修饰核酸的保留能力高。在一些【具体实施方式】中，比未修饰的核酸的保留能力至少高50%、75%、90%、95%、100%、150%、200%或超过200%。这种保留能力的优势可以通过用增强的核酸进行一轮转染获得或者通过后续多轮重复转染获得。[0050]向细胞中引入修饰的或瞬时的RNA用于蛋白质生产
[0051]瞬时转染的细胞可通过本领域普通技术人员熟知的转染、电穿孔、阳离子介质、聚合物或基于脂质的递送分子的方法产生。如果合适，可以在传统分批式步骤或连续流加(continuous flow through)步骤中，将所述修饰的瞬时RNA引入培养的细胞中。本发明的方法和组合物可用于制备具有提高的一个或多个感兴趣蛋白质产量的细胞。可以用一个或多个RNA转染细胞或者将其引入细胞。可以用二个或更多个RNA构建体同时或相继转染细胞。在某些【具体实施方式】中，可以多次使用本文所述方法以获得具有提高的一个或多个感兴趣的RNA或蛋白质的表达的细胞。例如，可以使用一个或多个编码感兴趣的RNA或蛋白质的RNA构建体转染细胞，并按照本文所述方法进行分离。所述分离的细胞可以随后进一步地用于一个或多个编码感兴趣的RNA或蛋白质的其他RNA转染并再次分离。例如，所述方法可用于产生细胞，所述细胞在相同或相关生物学途径中的蛋白质复合物、RNA或蛋白质，彼此作为上下游的RNA或蛋白质，彼此具有调节、激活或抑制功能的RNA或蛋白质，依赖彼此功能或活性的RNA或蛋白质，同源(例如，序列、结构或功能同源)的RNA或蛋白质的表达提高。例如，该方法可用于产生免疫球蛋白(例如，IgA、IgD、IgE、IgF和IgM)的轻链和重链或其抗原结合片段的表达提高的细胞系。所述免疫球蛋白可以是全人的、人源化的或嵌合的免疫球蛋白。转染入本发明的细胞的RNA可以包括编码感兴趣的蛋白质的RNA序列。可按照本文所述方法生产任意蛋白质。可按照本发明所述方法生产的蛋白质的实例包括但不限于，肽激素(例如，胰岛素)、糖蛋白激素(例如，促红细胞生成素)、抗生素、细胞因子、酶、疫苗(例如，HIV疫苗，HPV疫苗、HBV疫苗)、抗癌治疗剂(例如，Mucl)和治疗性抗体。在个别【具体实施方式】中，所述RNA编码免疫球蛋白或其抗原结合片段，例如免疫球蛋白的重链、免疫球蛋白的轻链、单链Fv、抗体片段(例如Fab、Fab’或(Fab’ )2)或免疫球蛋白抗原结合片段。在特定【具体实施方式】中，所述RNA编码促红细胞生成素。在另一特定【具体实施方式】中，所述RNA编码一个或多个结合细胞表面受体(表皮生长因子受体(EGFR)、HER2或c-ErbB-Ι)且任选地拮抗或激活细胞表面受体的免疫球蛋白或其片段，例如 Erbitux?(cetuximab)。
[0052]蛋白质的分离或纯化
[0053]本文所述方法可以进一步包括分离或纯化通过本文所述方法制备的蛋白质、多肽或肽的步骤。本领域普通技术人员可以容易地确定从培养的细胞中纯化或分离感兴趣的蛋白质的合适方式。通常，通过采用亲和结合的捕获方法或非亲和纯化而进行。如果感兴趣的蛋白质不被培养的细胞分泌，则在前述纯化或分离之前裂解培养的细胞。可以使用包含感兴趣的蛋白质、细胞培养基成分和细胞培养添加成分(例如本发明中的消泡化合物和其他营养和补充物、细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白质、DNA、病毒等等)不明的细胞培养液体。此外，如果希望的话，该过程本身可以在生物反应器内进行。可以将所述液体预处理至期望的促进因素，例如pH、温度或其他促进因素，或者可以在加入聚合物后对液体进行处理，或者可以将聚合物加入到载液(carrier liquid)中，所述载液被正确处理至促进条件所需的参数，而所述促进条件是待溶解至液体中的聚合物所需的。多聚物使得与所述液体完全流转，而后施加促进因素(改变pH、温度、盐浓度等等)，目标蛋白质和多聚物从溶液中沉淀出来。将多聚物和目标蛋白质从液体剩余部分分离并任选地洗涤一次或多次以去除任何粘合的或松散结合的杂质。随后通过例如洗提等自多聚物回收所述目标蛋白质。一般，在一系列的条件下完成所述洗提，从而使聚合物保持其固体(沉淀)形式，并且在期望蛋白质的选择性洗提过程中保留其任意杂质。或者，可以将聚合物和蛋白质以及任意杂质溶解在新的液体(例如水或缓冲液)中，并且通过与多聚物或杂质相比，对蛋白质更具偏爱性和选择性的方式，例如亲和、离子交换、疏水或其他种类的层析方法回收所述蛋白质。随后回收所洗提的蛋白质，并且如果需要对其进行额外的加工步骤，或者传统的分批式步骤或者连续流加步骤(如果合适)。
[0054]此外，优化特定多肽在可能感兴趣的细胞系或细胞系集中的表达是有用的，尤其是工程化蛋白，例如具有已知活性的对照蛋白的蛋白变体。在一种【具体实施方式】中，提供了通过提供多种靶细胞种类，并且使所述多种靶细胞种类的每一种均独立地与编码工程化多肽的修饰mRNA接触，而优化工程化蛋白质在靶细胞中的表达的方法。此外，可以改变培养条件以提高蛋白质生产效率。随后，检测和/或量化多种靶细胞类型中工程化多肽的存在和/或水平，使得可以通过选择有效的靶细胞和与之相关的细胞培养条件而对工程化多肽的表达进行优化。特别地，当工程化多肽包含一个或多个翻译后修饰或具有实质的三级结构或常使蛋白质高效生产复杂化的条件时，此类方法尤其有用。
[0055]“感兴趣的蛋白”或“目标蛋白”包括在本文提供的蛋白及其片段、突变体、变体及改变。特别地，目标蛋白/多肽或感兴趣的蛋白的实例为，但不限于，胰岛素，胰岛素样生长因子，人生长激素(hGH)，组织纤溶酶原激活剂(tPA)，细胞因子，例如白介素(IL)，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18，干扰素(IFN) a , IFN β、IFN Y、IFNQ 或 IFNt，肿瘤坏死因子(TNF)，例如TNF α和TNF β > TNF y , TNF相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL);粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)。还包括促红细胞生成素或其他激素生长因子的生产。按照本发明的方法还可以有利地用于生产抗体或其片段。所述片段包括，例如，Fab片段(抗原结合片段)。Fab片段是由通过相邻恒定区连在一起的双链可变区组成的，其可以通过蛋白酶(例如木瓜蛋白酶)消化常规抗体而形成，但是相似的Fab片段也同时会通过遗传工程产生。其他的抗体片段包括F(ab’)2片段，可通过胃蛋白酶酶解制备。
[0056]一般而言，感兴趣的蛋白是作为分泌多肽自培养基中回收的，或者，如果没有分泌性信号表达，则可从宿主细胞裂解物中回收。需要采用可以获得基本上均一的感兴趣蛋白质制备物的方式自其他重组蛋白质和宿主细胞蛋白质中纯化感兴趣的蛋白质。作为第一步，自培养基或裂解物中移除细胞和/或粒状细胞碎片。随后，通过例如免疫亲合或离子交换柱分级、醇沉淀、反相HPLC、Sephadex色谱、硅石色谱或诸如DEAE的阳离子交换树脂色谱，自可溶性蛋白、多肽和核酸杂质中纯化感兴趣的产物。通常，教导本领域技术人员如何纯化宿主细胞表达的异源蛋白质的方法是本领域已知的。所述方法例如描述在(Harrisand ngal， Protein Purification Methods:A Practical Approach， Oxford UniversityPress，1995)或(Robert Scopes， Protein Purification:Principles and Practice，Springer, 1988)中。
[0057]本发明的方法促进了核酸向体内、离体或培养物中细胞群的递送。例如，将包含大量宿主细胞(例如，真核细胞，如酵母或哺乳动物细胞)的细胞培养物与含有增强的核酸的组合物接触，所述增强的核酸具有至少一个核苷修饰以及任选的可翻译区。所述组合物通常还包含转染试剂或其他提高增强的核酸向宿主细胞的摄入效率的化合物。与相应未修饰核酸相比，所述增强的核酸在细胞群中显示出增强的保留能力。所述增强的核酸的保留能力比未修饰的核酸的保留能力高。在一些【具体实施方式】中，比未修饰核酸的保留能力至少高约50%、75%、90%、95%、100%、150%,200%或超过200%。这样的保留能力优势可以通过使用增强的核酸进行一轮转染获得，或者可以通过后续多轮重复转染获得。
[0058]在一些【具体实施方式】中，增强的核酸与一个或多个其他核酸被递送到靶细胞群。这种递送可以同时进行，或者在递送一个或多个其他核酸之前递送增强的核酸。所述其他一个或多个核酸可以是修饰的核酸或未修饰的核酸。应该理解，起始存在的增强的核酸基本上不诱导细胞群的天然免疫反应，并且随后存在的未修饰的核酸也不会激活天然免疫反应。因此，如果期望在靶细胞群中存在的蛋白质由未修饰的核酸翻译，则增强的核酸自身可以不含可翻译区。
[0059]拮抗蛋白的表达
[0060]本文所述方法和组合物可用于制备能削弱或阻止哺乳动物受试者的内源性激动生物反应和/或拮抗受体或信号转导分子的蛋白质。例如，IL-12和IL-23受体信号转导在慢性自体免疫病(例如多发性硬化)和炎性疾病(例如类风湿性关节炎、银屑病、红斑狼疮、强直性脊柱炎和克罗恩氏病)中增强(Kikly K, Liu L, Na S Sedgwick JD(2006)Curr.0pin.1mmunol.第18卷第6期,第670 - 5页)。另一【具体实施方式】中，核酸编码针对趋化因子受体的拮抗剂。趋化因子受体CXCR-4和CCR-5是HIV进入宿主细胞所需的(Arenzana-Seisdedos F 等，(1996) Nature, 3 月 10 日；第 383 卷第 6599 期，第 400 页)。
[0061]靶物质(moiety)。本发明的【具体实施方式】中，提供修饰的核酸以表达蛋白质结合伴侣或位于细胞表面的的受体，所述受体的功能是在体内或体外将细胞祀向特定组织空间或者使其与特定物质反应。合适的蛋白质结合伴侣包括抗体及其功能片段、支架蛋白质或肽。此外，修饰的核酸可用于指导脂类、糖类或其他生物物质的合成和细胞外定位。
[0062]永久件基因表 汰沉默。在哺乳动物受试者中通过表观遗传学沉默基因表汰的方法，该方法包括核酸，所述核酸的可翻译区编码一种或多种多肽，所述多肽能够指导序列特异性组蛋白H3甲基化，从而起始异染色质的形成并且减少特定基因周围的基因转录，实现沉默基因的目的。例如，酪氨酸激酶2基因的功能获得性突变是骨髓增生疾病家族的原因。
[0063]机理详情。裂殖酵母需要2个RNAi复合体用于siRNA介导的异染色质装配:RNA诱导的转录沉默(RITS)复合体和RNA引导的RNA聚合酶复合体(RDRC) (Motamedi等，Cell，2004年，119，第789-802页)。裂殖酵母中，RITX复合体包括siRNA结合Argonaute家族蛋白Agol，染色质结构域蛋白质Chpl和Tas3。裂殖酵母RDRC复合体由RNA依赖性RNA聚合酶Rdpl、推定的RNA螺旋酶Hrrl和polyA聚合酶家族蛋白Cidl2组成。这两种复合物需要Dicer核糖核酸酶和Clr4组蛋白H3甲基转移酶才能有活性。同时，Agol与siRNA分子(Dicer介导的对Rdpl共转录产生的dsRNA转录本进行切割而产生)结合并且允许Chpl、Tas3、Hrrl和Clr4与DNA区域序列特异性直接结合，所述DNA区域必定用于甲基化和组蛋白修饰并随后包装成转录水平沉默的异染色质。虽然该机制与DNA着丝粒区域顺式发挥作用，但通过针对DNA特定区域的双链siRNA的共转染和杂RNAi引导的siRNA核糖核酸酶Eril沉默使序列特异性反式沉默成为可能(Buhler等.Cell2006,125,873-886)。[0064]制备多肽变体
[0065]本文所述方法和组合物可用于制备多肽变体。本文提供了编码与对照多肽序列具有一定同一性的变体多肽的核酸。术语“同一性”如本领域所知，是指通过比较序列而测定的两条或更多多肽序列之间的相互关系。在本领域，“同一性”还表示通过两条或更多氨基酸残基链之间的匹配数量而测定的肽之间的序列相关性。“同一性”测定两条或更多序列的较小者之间相同匹配的百分数，其以特定的数学模型或计算机程序(例如，“运算法则”)解决缺口序列(若有的话)。通过已知方法可以容易地计算相关肽的同一性。这样的方法包括，但不限于，Computational Molecular Biology, Lesk, A.Μ., ed., Oxford University Press, New York, 1988;Biocomputing:1nformatics andGenome Projects, Smith, D.ff., ed., Academic Press, New York, 1993;Computer Analysisof Sequence Data, Parti, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, NewJersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje, G.，AcademicPress, 1987;Seq uence Analysis Primer, Gribskov, M.and Devereux, J., eds., M.StocktonPress, New York, 1991;and Carillo et al., SIAM J.Applied Math.48, 1073(1988)。
[0066]在一些【具体实施方式】中，多肽变体与对照多肽具有相同或相似活性。或者，变体具有相对于对照多肽的改变的活性(例如，增加或降低)。通常，当通过本文所述的和本领域技术人员已知的序列比对程序以及参数测定时，本发明的特定多核苷酸或多肽的变体与特定对照多核苷酸或多肽相比，具有至少大约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性。
[0067]如本领域技术人员所知，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白质也被认为是落入本发明的范围。例如，本文提供了对照蛋白质的任意蛋白质片段(表示比对照多肽序列短至少一个氨基酸残基的多肽序列，但其他部分相同)，其具有大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或多于100个氨基酸长度。另一个实施例中，可以依照本发明使用具有约20、约30、约40、约50或约100个氨基酸的任何蛋白质，其与任一本文所述序列相比，具有约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%或约100%的同一性。在某些【具体实施方式】中，如本文提供或涉及的任一序列中所示，按照本发明而使用的蛋白质序列包括
2、3、4、5、6、7、8、9、10 或更多突变。
[0068]制备多肽文库
[0069]本文所述方法和组合物可用于多肽文库的构建。本文提供包含核苷修饰的多核苷酸文库，其中所述多核苷酸各自包含编码多肽(例如抗体、蛋白质结合伴侣、支架蛋白和本领域已知的其他多肽)的第一核酸序列。一般而言，多核苷酸是适于直接引入目标宿主细胞形式的mRNA，所述目标宿主细胞合成所编码的多肽。
[0070]在某些【具体实施方式】中，制备蛋白质的多种变体(每一个均具有不同的氨基酸修饰)并测试以确定在药物代谢动力学、稳定性、生物适应性和/或生物活性或生物物理学特性(例如表达水平)方面的最佳变体。这样的文库可以包含约10、102、103、104、105、106、107、IO8UO9或超过IO9种可能的变体(包括替换、删除一个或多个残基，和插入一个或多个
残基)。
[0071 ] 制备多肽-核酸复合物
[0072]本文所述方法和组合物可用于制备多肽-核酸复合物。合适的蛋白质翻译包括与mRNA相关的多个多肽和核酸的物理聚集。本发明提供蛋白质-核酸复合物，包含具有一个或多个核苷修饰(例如，至少2个不同的核苷修饰)的可翻译mRNA以及与mRNA结合的一个或多个多肽。通常地，按有效阻止或减少所述复合物所引入的细胞的天然免疫反应的量提供蛋白质。
[0073]制备不可翻译的修饰核酸
[0074]本文所述方法和组合物可用于制备不可翻译的修饰核酸。如本文所述，提供具有基本上不可翻译的序列的mRNA。当施用于哺乳动物受试者时,所述mRNA是有效的疫苗。
[0075]本文还提供了包含一个或多个非编码区的修饰核酸。这种修饰核酸通常不翻译，但是能结合和螯合一个或多个翻译器组分，例如核糖体蛋白或转移RNA(tRNA)，从而有效减少细胞内的蛋白质表达。该修饰核酸可以包含小核仁RNA(sno-RNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰 RNA(siRNA)、小发卡 RNA(shRNA)或 Piw1-相互作用 RNA(piRNA)。
[0076]修饰核酸
[0077]本发明提供利了用含有一个或多个修饰核苷的包括RNA (例如信使RNA (mRNA))在内的核酸(称为“修饰的核酸(或修饰核酸)”)生产蛋白质的方法，所述修饰核酸具有有用的特性，包括基本上缺失诱导该mRNA所引入的细胞的天然免疫反应。由于这些修饰核酸增强了蛋白质的生产效率、核酸的细胞内保留能力和所接触的细胞的生存能力，并且具有降低的免疫原性，具有这些性质的核酸在本文中称为“增强的核酸(或增强核酸)”。
[0078]术语“核酸”，以其最广泛的含义包括引入或者能够引入至寡核苷酸链的任意化合物和/或物质。可用于本发明的示例性核酸包括，但不限于本文详细描述的一个或多个DNA、包括信使mRNA (mRNA)在内的RNA或DNA与RNA的杂合体、RNA干扰(RNAi)诱导剂、RNAi 药剂、小干扰RNA(siRNAs)、小发卡RNA(shRNAs)、微小 RNA(miRNAs)、反义RNA、核酶、催化性DNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体、载体等。
[0079]本文提供了含有可翻译 区和一个、二个或多于二个不同的核苷修饰的修饰核酸。在一些【具体实施方式】中，与相应的未修饰核酸相比，修饰核酸在该核酸所引入的细胞中显示出减少的降解。例如，与相应的未修饰核酸的降解率相比，修饰核酸的降解率降低了大约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或多于90%。示例性的核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)或其杂合体。在典型的【具体实施方式】中，修饰核酸包括信使RNA (mRNA)。如本文所述，本发明的核酸基本不诱导该mRNA所引入的细胞的天然免疫反应。
[0080]在一些【具体实施方式】中，修饰核苷包括喃唳-4-酮核苷、5-氮-尿苷、2-硫-5-氮-尿苷、2-硫尿苷、4-硫-假尿苷、2-硫-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-炔丙基-尿苷、1-炔丙基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、1-甲基_1_去氮_假尿苷、2-硫-1-甲基-1-去氮_假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2_硫-二氢尿苷、2-硫-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫-假尿苷。
[0081]在一些【具体实施方式】中，修饰核苷包括5-氮-胞苷、伪异胞苷、3-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-伪异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并伪异胞苷、2-硫-胞苷、2-硫-5-甲基-胞苷、4-硫-伪异胞苷、4-硫-1-甲基-伪异胞苷、4-硫-1-甲基-1-去氮-伪异胞苷、1-甲基-1-去氮-伪异胞苷、zebularine、5_ 氮-zebularine、5_ 甲基-zebularine、5_ 氮 -2- 硫-zebularine、2-硫-Zebularine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-伪异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-伪异胞苷。
[0082]在其他【具体实施方式】中，修饰核苷包括2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-2，6-二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、N6, N6- 二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。
[0083]在特定【具体实施方式】中，修饰核苷是5’ -0-(1-硫代磷酸)_腺苷、5’ -0-(1-硫代磷酸)_胞苷、5’-0-(1-硫代磷酸)-鸟苷、5’-0-(1-硫代磷酸)-尿苷或5’-0-(1-硫代磷
酸)_假尿苷。
[0084]
【权利要求】
1.生产免疫球蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含第一分离的核酸及其包装和说明书，所述第一分离的核酸含有i )编码免疫球蛋白的可翻译区和ii )核酸修饰，其中所述第一核酸能逃脱所述该第一分离的核酸所引入的细胞的天然免疫反应，其中所述可翻译区基本不含胞苷和尿嘧啶核苷。
2.权利要求1所述的试剂盒，其中所述免疫球蛋白包含多肽，所述多肽选自由全长抗体、重链多肽、轻链多肽、Fab结构域或单链可变区片段(ScFv)多肽组成的组，所述第一分离的核酸包含信使核糖核酸，所述信使核糖核酸含有5-甲基-胞苷和假尿苷。
3.权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一分离的核酸包括选自下列组成组的核苷酸序列: a)SEQ ID N0:4和/或SEQ ID NO:6的核苷酸序列[利妥昔单抗]; b)与a)的核苷酸序列具有至少95%同一'丨生的核苷酸序列； c)编码SEQID N0:5和/或SEQ ID NO:7[利妥昔单抗]的多肽的核苷酸序列； d)与c)的核苷酸序列具有至少95%同一'丨生的核苷酸序列； e)编码与SEQID NO:5和/或SEQ ID NO:7[利妥昔单抗]具有至少95%同一性的多肽的核苷酸序列； f)与e)的核苷酸序列具有至少95%同一'丨生的核苷酸序列； g)包含a)_f)任 一者的片段的核苷酸序列；以及 h)a)-g)任一者的核苷酸序列的密码子优化变体。
4.权利要求3所述的试剂盒，其中所述免疫球蛋白免疫特异性结合到CD20多肽。
5.权利要求3所述的试剂盒，其中当与之接触时，所述免疫球蛋白特异性地诱导CD20+细胞的抗体依赖性细胞毒性。
6.权利要求3所述的试剂盒，其中生产所述免疫球蛋白用于白血病、淋巴瘤和组织移植排异或自身免疫疾病或病症的治疗。
7.哺乳动物细胞，其通过使用权利要求1所述试剂盒产生。
8.权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一分离的核酸包括选自以下组成组的核苷酸序列: a)SEQ ID N0:8和/或SEQ ID NO: 10的核苷酸序列； b)与a)的核苷酸序列具有至少95%同一'丨生的核苷酸序列； c)编码SEQID NO:9和/或SEQ ID NO: 11的多肽的核苷酸序列； d)与c)的核苷酸序列具有至少95%同一'丨生的核苷酸序列； e)编码与SEQID NO:9和/或SEQ ID NO: 11具有至少95%同一性的多肽的核苷酸序列； f)与e)的核苷酸序列具有至少95%同一'丨生的核苷酸序列；以及 g)包括a)_f)任一者的长度为至少30个核苷酸的片段的核苷酸序列。
9.权利要求8所述的试剂盒，其中所述免疫球蛋白免疫特异性结合到HER-2/neu受体多肽。
10.权利要求8所述的试剂盒，其中当与之接触时，所述免疫球蛋白特异性地诱导HER2/neu+细胞的抗体依赖性细胞毒性、细胞凋亡、细胞周期停滞或它们的组合。
11.权利要求8所述的试剂盒，其中生产所述免疫球蛋白用于HER2/neu+乳腺癌的治疗。
12.分离的免疫球蛋白，其由自包含第一分离的核酸的生产细胞产生，所述第一分离的核酸含有i )编码免疫球蛋白的可翻译区和? )核酸修饰，其中所述第一核酸能逃脱所述细胞的天然免疫反应，其中所述可翻译区基本不含胞苷或尿嘧啶核苷或者胞苷和尿嘧啶核苷的组合。
13.权利要求12所述的蛋白，其中所述生产细胞是分离自人受试者的细胞。
14.药物制剂，其包含有效量的权利要求13所述的蛋白。
15.药物制剂，其包含有效量的第一核酸，其中所述第一核酸含有i)编码免疫球蛋白的可翻译区和ii )核酸修饰，其中所述第一核酸显示出由细胞核酸酶引起的降解的减少并且能够逃脱所述第一核酸所引入的细胞的天然免疫反应，其中所述可翻译区基本不含胞苷和尿嘧啶核苷。
16.权利要求15所述的药物制剂，其中所述第一核酸显示出由细胞核酸酶引起的降解的减少。
17.在细胞内生产感兴趣的异源蛋白质的方法，包括步骤: i)提供能翻译蛋白质的靶细胞；以及 ii)在感兴趣的异源蛋白质在细胞内生产的条件下，将包含第一分离核酸的组合物引入靶细胞，其中所述第一分离的核酸含有编码所述感兴趣的异源蛋白质的可翻译区和核苷修饰。
18.权利要求17所述·的方法，进一步包括自所述细胞充分纯化感兴趣的蛋白质的步骤。
19.权利要求17所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是分泌蛋白。
20.权利要求17所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是免疫球蛋白。
21.权利要求17所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是细胞内蛋白。
22.增加细胞内感兴趣的重组表达蛋白质的产量的方法，包括步骤: i)提供包含编码感兴趣的蛋白质的异源核酸的靶细胞；以及 ii)在所述效应蛋白在细胞内生产的条件下，将包含第一分离核酸的组合物引入靶细胞，从而提高细胞内重组表达蛋白质的产量，其中所述第一分离的核酸含有编码翻译效应蛋白的可翻译区和核苷修饰。
23.权利要求22所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是免疫球蛋白。 权利要求22所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是分泌蛋白。
24.权利要求22所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是细胞内蛋白。
25.权利要求22所述的方法，其中所述靶细胞是哺乳动物细胞。
26.权利要求22所述的方法，其中所述靶细胞是酵母细胞。
27.权利要求22所述的方法，其中所述靶细胞是细菌细胞、昆虫细胞或植物细胞。
28.权利要求22所述的方法，其中所述翻译效应蛋白是神经酰胺转移蛋白(CERT)。
29.调节靶细胞内感兴趣蛋白质的水平的方法，包括步骤: i)调节靶细胞内至少一种翻译效应分子的活性，其中所述调节包括将含有编码翻译效应蛋白的可翻译区和核苷修饰的第一分离的核酸引入靶细胞；以及 ii)培养所述细胞。
30.用于蛋白质生产的试剂盒，包括编码可翻译区的第一分离的核酸及其包装和说明书，其中所述可翻译区编码蛋白质，其中所述第一核酸含有核酸修饰，其中与不含核酸修饰的核酸相比，所述第一核酸在所述第一分离核酸所引入的细胞内显示出降解的减少。
31.用于蛋白质生产的试剂盒，包括编码可翻译区的第一分离的核酸及其包装和说明书，其中所述可翻译区编码蛋白质，其中所述第一核酸含有核酸修饰，其中与不含核酸修饰的核酸相比，所述第一 核酸显示出在所述第一分离的核酸所引入的细胞中更稳定。
【文档编号】C07H21/04GK103429606SQ201180057555
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2011年10月3日 优先权日:2010年10月1日
【发明者】贾森·施伦, 格雷戈里·J·西兹克维克兹, 凯内齐·伊杰贝, 萨伊达·尔巴施尔 申请人:现代治疗公司