通过删除由nkt细胞识别的表位来调整抗原免疫原性的制作方法

通过删除由nkt细胞识别的表位来调整抗原免疫原性的制作方法
【专利摘要】本发明描述了一种方法和化合物，其用于阻止针对外源因子、针对用于基因疗法和基因接种的病毒载体、针对受治疗者天然暴露的蛋白质、针对基因修饰的有机体和针对与用于变应性或传染性疾病的疫苗施用有关的不希望的效应的免疫应答。
【专利说明】通过删除由NKT细胞识别的表位来调整抗原免疫原性
【技术领域】
[0001]本发明涉及降低天然免疫原性或诱发耐受性的肽或多肽，和其在阻止针对外源因子(allofactors)、用于基因疗法或基因接种的病毒载体、用于食品或饲料的环境抗原而诱发的免疫应答或受治疗者通过吸入或接触暴露的免疫应答，或诱发以降低与由变应原或传染剂接种相关的副作用的免疫应答中用途。
【背景技术】
[0002]在许多情况下，用于治疗目的的蛋白质施用导致针对治疗性药的免疫应答，其阻碍所述治疗性药的任何进一步施用。这样的实例由受血友病A影响的受治疗者中凝血途径的VIII因子的施用提供:约三分之一的接受治疗者产生抑制VIII因子作用的抗VIII因子抗体。在罹患糖原代谢缺陷的受治疗者中对酶类如α半乳糖苷酶的施用同样地带来阻止任何进一步施用的针对治疗性药的免疫应答。第三实例由用作治疗性药和针对淋巴细胞表面分子、细胞因子或细胞因子受体使用的抗体提供。总的说来，高度需要发现阻止抗治疗性药的免疫的新治疗方法。
[0003]病毒载体用于基因疗法或基因接种的用途受以下事实的严格限制:这种病毒载体诱出的免疫应答，其导致由载体转导的细胞迅速消除和转基因表达的迅速损耗。取决于病毒载体的性质，病毒载体诱出具有可变程度的强度的先天性和适应性免疫应答的激活。因此，腺病毒载体强烈地刺激先天性免疫应答，其后是适应性免疫应答。腺相关病毒载体触发较弱先天性应答，但诱出抗体产生。基因疗法和基因接种的可能性是巨大的。先天性和/或适应性应答通过其来针对病毒载体的治疗方法将在本领域表现高度显著的进展。
[0004]许多受治疗者受到诱出以抵抗他们天然暴露的蛋白质的应答困扰。变应原(空气传播的或来自食品)诱出诸如变应性鼻炎和哮喘、荨麻疹、湿疹和过敏性反应之类的反应。至于为什么所述受治疗者呈 现这种反应的原因仅被部分地解释。降低以下的天然免疫原性将是十分有益的:蛋白质，诸如各种各样的食物变应原；导致乳糜泻的小麦；或受治疗者出于职业原因而暴露的诸如酶类的产物。
[0005]在用于变应性疾病或抗传染剂的接种策略中，治疗功效经常受副作用限制，所述副作用由变应原或传染剂的促炎性质诱出。这种炎性效应妨碍更高剂量的疫苗的使用，并因此妨碍疫苗功效，并且使免疫应答适应无用的细胞应答，诸如迟发型反应，以及适应对所考虑状况不是最理想的同种型的抗体的产生。对接种中炎症的更佳控制将提供对免疫应答的更加有效调整，同时降低与发炎有关的副作用。
[0006]自然杀伤T(NKT)细胞构成识别由非经典MHC络合分子⑶Id呈现的抗原的非常规T淋巴细胞的不同谱系。现在描述NKT细胞的两个亚型。I型NKT细胞，也称为不变NKT细胞(iNKT)，是最丰富的。它们的特征在于，存在由不变α链(小鼠中的Va 14和人中的V a 24)构成的α-β T细胞受体(TCR)。该α链与变量相关，但限制β链的数量。2型NKT细胞具有a-PTCR，但携带多态α链。然而，显而易见的是存在NKT细胞其它亚型，其表型仍未完全定义，但其特征为由在CDld分子的背景下呈现的糖脂激活。[0007]NKT细胞一般表达自然杀伤(NK)细胞受体(包括NKG2D和NKl.1)的组合。NKT细胞是先天免疫系统的一部分，其可以区别于适应性免疫系统，实际上它们在得到完全效应子能力之前不需要扩张。NKT细胞的激活导致各种效应。这种细胞释放预形成介体，包括帮助B细胞产生抗体的一大列细胞因子(包括中间白细胞素(IL)-4，干扰素(IFN)-Y，IL-21和IFN-α )，并且有人提出细胞因子的释放也可影响⑶4+T细胞(Burrows等人，NatureImmunology2009,10:669-671)。在本发明中，认为对B细胞激活和主要组织相容性(MHC)II类限制性CD4+T细胞激活的预防在降低或消除蛋白免疫原性中起作用。
[0008]用于NKT细胞的识别单元(⑶Id分子)具有与MHC I类分子极其类似的结构，包括β-2微球蛋白的存在。其特征为毗连两个α链的很深裂隙并且含有接收脂质链的高度疏水的残基。该裂隙在两个末端开放，允许容纳较长链。用于CDld的规范配位体是合成的α半乳糖酰基鞘氨醇(a GalCer)。然而，已经描述了许多自然替代性配位体，包括糖脂和磷脂，该自然脂质硫脂发现于髓鞘质、微生物磷酸肌醇甘露糖苷和α半乳糖醛酸神经酰胺中。目前的共识(参见综述，诸如Matsuda等人，Current Opinion in Immunology 2008，20:358-368 和 Godfrey 等人，Nature reviews Immunology 2010,11:197-206)在于，CDld仅结合含脂质链的配位体，或通常由被嵌入CDld中的脂质尾部和从CDld中伸出的糖类残基首基构成的常见结构。
[0009]不认为肽能够通过⑶Id的呈现激活NKT细胞。然而，有人提出，含庞大氨基酸残基的长疏水肽可以结合至CDlcKCastano等人，Science 1995,269:223-226)。使用表达具有未定义的生理相关性的随机序列肽的噬菌体呈现文库进行的观察，允许确立理论共有基序(Castano 等人，Science 1995，269:223-226 并且参见下文)。
[0010]实际上，Castano等人表明，激活的细胞是⑶8+T细胞，也就是MHC I类限制性细胞，而不是NKT细胞。这些发 现教导本领域技术人员不存在疏水肽由⑶Id分子呈现的证据。因在常规免疫方案下不能诱出NKT细胞，Castano等人宣称的生理相关性被进一步怀疑(Matsuda 等人，Current Opinion in Immunology2008,20:358-368 and BrutkiewiczJournal of Immunology2006，177:769-775)。诸如用被转染以过表达CDld并在体外加载卵清蛋白衍生肽的细胞进行免疫的人工系统能够诱出NKT细胞。同样地，用质粒DNA以及鼠CDld和共刺激分子进行的真皮内免疫诱发溶细胞CDld限制性T细胞(Lee等人，Journalof Experimental Medicine 1998,187:433-438)。Castano 等人宣称，含由 Pl 位和 P7 位的芳族残基和P4位的脂族链构成的结构基序的疏水妝含有用于CDld结合表位的核心基序。如上所述，Castano等人达成的该结论不受数据支持。
[0011]我们出乎意料地发现，包围疏水氨基酸序列的肽实际上能够诱出NKT细胞的激活。
[0012]如果来自用于治疗性目的而施用，或受治疗者通常暴露的，或在进行基因疗法或基因接种时而施用，或在用于变应性或传染性疾病的接种的背景下而施用的蛋白的表位结合至CDld并因此激活NKT细胞，则突变所致所述蛋白的变化和/或消除所述表位的删除将是阻止免疫原性非常需要的。
[0013]鉴别这种表位，随后突变、添加或删除氨基酸以阻止NKT细胞激活形成本发明的基础。
[0014]发明概述[0015]本发明涉及肽或多肽用于通过阻止针对外源因子的免疫应答治疗受治疗者中针对所述外源因子诱出的这种免疫应答的用途。
[0016]本发明还涉及肽或多肽用于通过阻止针对用于基因疗法或基因接种的病毒载体的免疫应答治疗受治疗者中针对所述病毒载体诱出的免疫应答的用途。
[0017]本发明还涉及由基因修饰的有机体制备的肽或多肽用于在受治疗者中阻止通过暴露于天然蛋白质而诱出的免疫应答的用途。
[0018]本发明还涉及肽或多肽在先天性免疫性的激活是有害时用于接种目的的用途。
[0019]本发明还涉及鉴别携带⑶Id结合表位的蛋白质和通过氨基酸取代或删除消除这种表位的方法。
[0020]我们意外发现，显著比例的肽或多肽携带允许它们结合用于激活天然杀伤T(NKT)细胞的CDld决定子和由其呈现的氨基酸序列。这种细胞的激活导致细胞因子的释放，并且在一些情况下，导致获得或增加溶细胞性。
[0021]在一个方面，本发明涉及至少一种分离肽或多肽用作外源因子的用途，所述肽或多肽已经被修饰以消除涉及由NKT细胞识别的表位的形成的至少一种疏水的氨基酸残基，用作在受治疗者中阻止对所述外源因子的免疫应答的药物的用途。
[0022]在一个方面，本发明还涉及至少一种分离肽或多肽用作用于基因疗法或基因接种的病毒载体的用途，所述肽或多肽已经被修饰以消除涉及由NKT细胞识别的表位的形成的至少一种疏水的氨基酸残基，用作在受治疗者中阻止对所述病毒载体的免疫应答的药物的用途。
[0023]在一个方面，本发明还涉及由基因修饰的有机体产生的至少一种分离肽或多肽的用途，所述肽或多肽被修饰以消除涉及由NKT细胞识别的表位的形成的至少一种疏水的氨基酸残基，用作在受治疗者中阻止针对天然暴露于所述肽或多肽的免疫应答的药物的用途。
[0024]在一个方面，本发明还涉及至少一种分离肽或多肽用作疫苗的用途，所述肽或多肽已经被修饰以消除涉及由NKT细胞识别的表位的形成的至少一种疏水的氨基酸残基，用作在受治疗者中阻止对所述疫苗的无用或不适当的免疫应答的药物的用途。
[0025]在另一方面，本发明还涵盖至少一种分离肽或多肽用作外源因子、病毒载体、基因修饰的有机体或疫苗的用途，所述肽或多肽已经被修饰以消除涉及由NKT细胞识别的表位的形成的至少一种疏水的氨基酸残基，用作在受治疗者中阻止激活、细胞因子产生、对由所述受治疗者中CD4+NKT细胞携带的适应性免疫应答的溶细胞活性和抑制活性的药物的用途。
[0026]本发明涉及包含至少一个CDld限制性T细胞表位的疏水的肽或多肽，其中定位为CDld的锚定残基的氨基酸被替代性氨基酸替换，或被删除，这导致对CDld的结合丧失或显著减小并且因此导致NKT细胞激活 丧失或显著减小。
[0027]CDld分子的结构表明，需要疏水的氨基酸残基占据位于CDld裂隙的末端处的两个疏水袋，并且脂族残基应该占据所述裂隙中间的位置。因此，作为CDld结合序列的一般示例，可以使用基序[FW]-XX-[ILM]-XX-[FWTH]，其中[FW]表明F或W可以占据第一锚定残基(P1)，P4位可以由1、L或M占据并且P7可以由F、W、T或H占据。在此一般模型基序中X代表任何氨基酸。对于本领域技术人员而言，应该清楚的是，这些氨基酸残基的各种组合是可能的。在具体实施方案中，该一般模型基序可以作为反向序列如[FWTH]-XX-[ILM]-XX-[FW]呈现。在另一具体实施方案中，将至少一个氨基酸加入CDld结合基序内，所述氨基酸干扰该基序，阻碍其结合到CDld的能力并因此阻碍其激活NKT细胞的能力。
[0028]本发明更具体来说还涉及肽或多肽，其中Pl位和P7位中的F、W、T、H或Y被非天然氨基酸(例如D氨基酸)或有机化合物替换。
[0029]在任何上述用途中，所述外源因子可以是用于以下的任何肽或多肽:(1)凝血缺陷或纤维蛋白溶解缺陷的替换疗法，包括VDI因子、IX因子和葡萄球菌激酶；(2)激素，例如生长激素或胰岛素；(3)细胞因子和增长因子，例如干扰素-α，干扰素-Y，GM-CSF和G-CSF ； (4)用于调整免疫应答的抗体，包括在变应性疾病中的抗IgE抗体，在移植物排斥和各种各样的自身免疫疾病中的抗CD3和抗CD4抗体，在非霍奇金氏淋巴瘤中的抗CD20抗体；(5)肾机能不全中的促红细胞生成素和；(6)基因修饰过的抗原。
[0030]在任何上述用途中，所述病毒载体可以是RNA病毒(Y-逆转录病毒和慢病毒)或DNA病毒(腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和痘病毒类)的任何肽或多肽。
[0031 ] 在任何上述用途中，所述基因修饰的有机体可以是植物或动物来源的任何有机体，其用作食用或饲料，用于生产农作物或制造材料，或用于生产食物或饲料、或畜牧业用转基因动物。
[0032]在任何以上所述中，用于接种的所述肽或多肽可以来自变应原或来自传染剂，包括病毒、细菌和寄生虫。变应原可以是空气传播的变应原，例如衍生自房尘螨、来自花粉或来自家畜那些，食物变应原例如花生、卵清蛋白、谷物、水果和豆类，以及接触性抗原例如胶乳。特征为变应原敏化的疾病包括变应性哮喘、变应性鼻窦炎、过敏性休克、荨麻疹、特应性皮炎和接触性皮炎。
[0033]本发明还涉及用于鉴别激活NKT细胞的肽或多肽和通过取代、添加或删除氨基酸来改变CDld结合表位以消除这种激活的方法。所述方法包含以下步骤:用携带CDld的细胞培育所述肽或多肽，随后添加多克隆`NKT细胞群并且确定所述NKT细胞的激活。
[0034]本发明还涵盖分离的病毒载体，其特征在于它们包含通过取代或删除至少一个疏水的氨基酸来修饰的外源因子的至少一个肽或多肽，或通过取代或删除至少一个疏水的氨基酸残基来修饰的变应原或传染剂的至少一个肽或多肽。应当理解的是，病毒载体其自身也可通过取代或删除疏水的氨基酸残基被修饰。
[0035]定义
[0036]术语"肽"在本文中使用时是指包含由肽键连接的2至200个氨基酸的氨基酸序列，但其在具体实施方案中可以包含非氨基酸结构(如连接性有机化合物)。本发明的肽可以含有任何常规的20个氨基酸或它们的修饰物，或可以含有通过化学肽合成或化学或酶修饰掺入的非天然氨基酸。术语“多肽”当在本文中使用时是指通常较长的肽或蛋白质。
[0037]术语"表位"当在本文中使用时是指蛋白质的一个或若干个部分(其可以限定构象表位)，其由抗体或其一部分(Fab'、Fab2'等)或B或T细胞淋巴细胞的细胞表面上呈现的受体特异性识别和结合，并且其能够通过所述结合而诱发免疫应答。
[0038]术语"抗原"当在本文中使用时是指包含一个或多个半抗原和/或包含一个或多个T细胞表位的大分子结构。一般而言，所述大分子是蛋白质或肽(具有或没有多糖)或由蛋白成分构成并且包含一个或多个表位；所述大分子在本文可替换地称为"抗原性蛋白质"或“抗原性肽”。
[0039]术语”变应原”是指抗原的特定亚型，特征为其在易感染个体中诱出IgE同种型的抗体的能力。
[0040]在本发明的背景下术语"T细胞表位"或“T-细胞表位”是指优势、次优势或次要T细胞表位，即，被T淋巴细胞的细胞表面上的受体特异性识别并且结合的抗原性蛋白质的一部分。表位是否为优势、亚优势或次要，取决于针对表位诱出的免疫反应。优势取决于蛋白质的所有可能T细胞表位中，这种表位被T细胞识别并且能够激活所述T细胞的频率。特别地，T细胞表位是由MHC I类或MHC II类分子结合的表位。
[0041]术语“NKT细胞表位”是指被T淋巴细胞的细胞表面上的受体特异性识别并且结合的抗原性蛋白质的一部分。特别地，NKT细胞表位是由CDld分子结合的表位。
[0042]术语“⑶4+效应子细胞”是指属于T-细胞的⑶4-阳性亚型的细胞，其功能为向其它细胞例如B-细胞提供协助。这些效应子细胞通常作为Th细胞(T协助细胞)报告，具有不同的亚型，例如ThO、Thl、Th2和Thl7细胞。
[0043]术语“NKT细胞”是指先天性免疫系统的细胞，其特征为实际上它们携带诸如NKl.1和NKG2D的受体，并且识别由⑶Id分子呈现的表位。在本发明的背景下，NKT细胞可以属于I型(不变)或2型亚型。
[0044]“⑶Id分子”是指由3 α链和β链的一个逆平行组构成的非MHC衍生分子，所述β链被布置到在两侧开放的深疏水凹槽中，所述非MHC衍生分子能够向NKT细胞呈现脂质、糖脂或疏水肽。
[0045]术语"免疫紊乱"或"免疫疾病"是指这样的疾病，其中免疫系统的反应对有机体中功能失常或非生理性情况负责或者维持所述功能失常或非生理性情况。在本发明的背景下，免疫紊乱是指由传染剂和肿瘤监视诱发的病理学。
`[0046]术语“外源因子”是指当在相同物种的两个个体之间进行比较时呈现多态性的蛋白质、肽或因子(即任何分子)，且更一般说来，是在接受外源因子的受治疗者中诱发(同种异体反应性)免疫应答的任何蛋白质、肽或因子。通过延伸，外源因子还包括用于饲养的基因修饰的蛋白质。
[0047]术语“异体抗原”或“异体移植抗原”当在本文中使用时是指衍生自(脱落自和/或呈现于)细胞或组织中的抗原，当从供体转移到接受者时，其可以被受体的B或T-细胞受体的抗体识别和结合。异体抗原一般是多态基因的产物。异体抗原是蛋白质或肽，当在供体和受体(属于相同物种)之间比较时，其呈现轻微结构差异。在接受者的身体内这种供体抗原的存在可以诱出接受者中的免疫应答。这种同种异体反应性免疫应答是对异体抗原特异性的。
[0048]发明详述
[0049]本发明提供在受治疗者中阻止针对外源因子、针对用于基因疗法或基因接种的病毒载体、针对用于食物或饲料的蛋白质、针对所述受治疗者通过吸入或螫伤暴露的蛋白质的免疫应答的方法，或在疫苗使用中在受治疗者中阻止对变应原或传染剂的先天免疫性的不希望激活的方法。
[0050]特别地，本发明提供阻止CD4+NKT细胞的扩张和官能活性的方法。这种细胞通常分类为两种不同的亚型，也就是针对携带不变TCRa链(小鼠中Vcil4，人中Vci24)的I型，或用不同的α链所有组成成分呈现的2型NKT细胞。然而，近来有证据提出不适合I型或2型种类的NKT细胞的替代性亚型。本发明的目的为包括这些非常规NKT细胞，前提是它们携带CD4共同受体。在结合到CDld的抗原呈现之后，NKT细胞被迅速激活并且分泌被认为是影响来自先天性和适应性免疫系统的其它细胞的决定簇的许多细胞因子。在有些情况下，所述激活的NKT细胞获得或增加细胞毒性。在其它情况下，所述激活NKT细胞通过与II类限制性CD4+T细胞的相互作用抑制或减少适应性免疫应答的诱出。
[0051]在本发明的背景下，我们意外观察到肽可以通过⑶Id分子呈现。⑶Id分子的特征在于，其由形成裂缝的两个逆平行α链构成，所述α链位于由两个逆平行β链构成的平台的顶上。该裂隙狭窄且很深，并且仅接受疏水的残基，通常认为仅接受脂质。该裂隙可以容纳7个氨基酸的序列，所述序列的特征为在(P) I和7位置中的疏水残基，和在Ρ4中的脂族残基。Pl是专性疏水的残基，诸如F、W、H或Y。然而，P7是允许的，并且可以含有替代性残基，前提是它们是非极性的。P4中残基优选是脂族，但为任选的。CDld结合基序的一般序列因此是[FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]。然而，本领域技术人员应该清楚的是，该基序是对称的并且P7可以被看作P1，而Pl可以被看作P7。此处作为一般指示提供⑶Id结合基序的一般序列，而无任何限制意图。考虑用于本发明的应用的肽和多肽是根据其通过呈现到⑶Id分子中而激活NKT细胞的能力来定义。
[0052]能够激活NKT细胞并因而携带CDld结合基序的疏水肽或多肽发现于以下中:外源因子，病毒载体，用于食物或饲料的蛋白质，所述受治疗者通过吸入或螫伤暴露的蛋白质，基因修饰的蛋白质和变应原；因此赋予所述外源因子、病毒载体、基因修饰的蛋白质或变应原激活CD4+NKT细胞的能力。
[0053]本发明涉及含有CDld结合基序的肽或多肽的产生，所述CDld结合基序给予所述肽或多肽激活NKT细胞的能力并且通过取代Pl和/或P7中的疏水的残基，并且任选地，取代或删除P4中的脂族残基，或这些的任何组合来修饰所述CDld结合基序，这导致肽或多肽结合至CDld的能力丧失或显著减小，并因此导致所述肽或多肽激活NKT细胞的能力丧失或显著减小。
[0054]在更具体的实施方案中，Pl位和/或P7位中的F、W、T、H或Y由非疏水的氨基酸残基替换，或任选地，P4位中的1、L、M或V由非脂族残基代替，或这些替换的任何组合。
[0055]在另一具体实施方案中，位于Pl位和/或P7位中的疏水的残基，或任选地，位于P4中的脂族残基，或这些残基的任何组合，被不同于非天然F、W、T、H、Y的至少一个非天然氨基酸或被非芳族有机化合物替换。
[0056]在另一具体实施方案中，将至少一个氨基酸加入⑶Id结合基序中Pl至P7序列内任何位置，所述氨基酸干扰该基序，阻止其结合到CDld的能力并因此阻止其激活NKT细胞的能力。
[0057]在优选实施方案中，非天然氨基酸是D-氨基酸。
[0058]本发明还涉及含有CDld结合基序的肽或多肽的产生，所述CDld结合基序给予所述肽或多肽激活NKT细胞的能力并且通过取代Pl和/或P7中的疏水的残基，并且任选地，删除P4中的脂族残基，或这些的任何组合来修饰所述CDld结合基序，这导致肽或多肽结合至CDld的能力丧失或显著减小，并因此导致所述肽或多肽激活NKT细胞的能力丧失或显著减小。[0059]在对受治疗者施用之后，这种肽或多肽不加载于CDld并且因此被阻止激活NKT细胞。
[0060]在另一方面，本发明还涵盖包含Pl位或P7位中F、W、T、H或Y的至少一个取代或删除的至少一种分离肽或多肽的用途，用于在受治疗者中阻止针对外源因子施用，病毒载体施用，所述受治疗者通过食物、饲料、全身或吸入路径暴露的蛋白质，或用于接种目的的变应原或传染剂的免疫应答。
[0061]在另一方面，本发明还涵盖包含Pl位或P7位中F、W、T、H或Y的至少一个取代或删除的至少一种分离肽或多肽的用途，用于在受治疗者中阻止针对外源因子施用，病毒载体施用，所述受治疗者通过食物、饲料、全身或吸入路径暴露的蛋白质，或用于接种目的的某些变应原或传染剂的NKT细胞激活。
[0062]在另一方面，本发明还涵盖包含Pl位或P7位中F、W、T、H或Y的至少一个取代或删除的至少一种分离肽或多肽作为药物的用途，所述药物用于在受治疗者中阻止针对外源因子施用，病毒载体施用，所述受治疗者通过食物、饲料、全身或吸入路径暴露的蛋白质，或用于接种目的的基因修饰的肽或多肽或某些变应原或传染剂的免疫应答。
[0063]当在肽或多肽中呈现时，CDld结合基序的数量十分有限。这种肽或多肽的实例在下文提供。一般地，多肽呈现这些基序中的一至五个。
[0064]本发明的其它优点在于，CDld分子呈现十分有限程度的多态性。因此对本领域技术人员显而易见的是，本发明的相同氨基酸取代、添加或删除提供可用于所有或大多数受治疗者的肽或多肽。这与结合至MHC II类分子的肽或多肽基序呈鲜明对比，其中大量的肽可以描绘成含有合适序列。这是由于施加于MHCII类结合肽和II类分子大多态性的极小约束。
[0065]作为本发明的目的的肽和多肽被确定为:
[0066](I)任选地，针对含有Pl和P7中疏水的残基和P4中脂族残基的至少一个⑶Id基序的存在，评价肽或多肽氨基酸序列。一般序列如[FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]可以用于使用本领域熟知的算法，例如
[0067]http://expasy.0rg/tools/scanprosite/
[0068]该一般序列应该视为协助鉴别所述肽或多肽中哪个序列含有可允许所述肽或多肽激活NKT细胞的基序的工具。
[0069](2)使用表达⑶Id分子的细胞系，体外测试肽或多肽结合至⑶Id和激活NKT细胞的能力。这种细胞系的实例是本领域已知的(例如JAWS2细胞)。在优选实施方案中，该细胞系不呈现MHC II类分子，并且用含有CDld的DNA序列的病毒载体或本领域已知的在细胞中引入基因的任何其它方法将其转导用于CDld的超表达。用于细胞转导的方法是本领域已知的。将该细胞系加载于具有肽或多肽、或具有包含对应序列的合成肽的培养物中。这种合成肽容易通过合成(例如用本领域熟知的fmoc固相合成法)来产生。随后通过测量NKT细胞的激活，评价CDld分子对肽、多肽或对应合成肽的有效呈现。可以从周围血液中(通过例如磁力分选)获得这种细胞并且在细胞因子例如IL-2、IL-15或IL-7存在下维持于具有刺激剂如a-gal-神经酰胺的培养物中。这些方法本领域中已有描述(参见例如Godfrey 等人,Nature Reviews.1mmunology2010,11:197-206)。使用诸如细胞因子产生的评价之类方法，评估NKT细胞的激活。[0070]或者，由⑶Id分子中APC实际呈现的肽可以通过各种色谱法洗提并分离。这种方法的完整描述将见于Scott等人，Immunity，12 =711-720,2000中。随后对所述肽测序以鉴别哪个氨基酸残基位于Pl和P7。
[0071]或者，可将所述合成肽加载于⑶Id分子的四聚物上以检测对这种肽特异性的NKT细胞。一种可能性是使用荧光标记的四聚物并且用荧光激活的细胞分选系统(facs)检测。[0072](3)鉴别为能够激活NKT细胞并且任选地通过算法鉴别的氨基酸序列随后通过取代或删除被修饰。在优选实施方案中，Pl位和/或P7位中的F、W、T、H或Y由不同于F、W、T、H、Y的至少一个氨基酸替换。天然氨基酸可以通过转录后修饰来修饰或用诸如甲基的化学基团取代。在另一优选实施方案中，Pl位和/或P7位中的F、W、T、H或Y由任何适当的替代性非天然氨基酸替换。非天然氨基酸残基的实例是D-氨基酸。在又一个实施方案中，Pl位和/或P7位中的F、W、T、H或Y由不同于F、W、T、H、Y的至少一个氨基酸替换。在另一优选实施方案中，Pl中的F、W、T、H或Y由不同于F、W、T、H、Y的至少一个氨基酸，由任何适当的替代性非天然氨基酸或由非芳族有机化合物替换。这种氨基酸取代是用本领域熟知的方法获得。在另一优选实施方案中，Pl位中的F、W、T、H或Y被删除。在又一个实施方案中，Pl位和P7位中的F、W、T、H或Y被删除。进行所述删除的方法是本领域熟知的。在另一具体实施方案中，将至少一个氨基酸加入⑶Id结合基序中Pl至P7序列内任何位置。
[0073]根据本发明，设想出用于治疗其中需要外源因子的施用的疾病的药物，所述疾病例如
[0074](I)与凝血(例如VIII因子、IX因子或X因子)或纤维蛋白溶解相关的因子的天生或后天缺陷，伴随与多糖或糖原的代谢相关的酶类缺陷(例如庞培氏(Pompe)病)，或伴随激素(例如糖尿病中的胰岛素或侏儒症中的生长激素)产生的缺陷
[0075](2)急性或慢性情况，其中有利的是施用治疗剂，例如包括葡萄球菌激酶和微纤溶酶的血栓溶解剂，
[0076](3)免疫系统的紊乱，其中需要施用细胞因子(或其受体)或增长因子(例如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-Y、G-CSF> GM-GSF> KGF或促红细胞生成素)
[0077](4)特征为慢性炎症或不适当免疫应答的疾病，其中应该施用治疗性抗体包括抗肿瘤坏死因子，自身免疫疾病和移植物排斥中的抗CD3或抗CD4抗体，对淋巴细胞表面标记的抗体(例如非霍奇金氏淋巴瘤中的抗CD20抗体)，或预防血栓症的对VIII因子的抗体。治疗性抗体的名单增长很快，并且本发明旨在涵盖用于通常治疗性目的的任何抗体的用途。
[0078]根据本发明，还设想出供基因疗法和基因接种使用的药物，其中使用病毒载体并且其中针对所述载体的免疫应答妨碍转基因表达。
[0079]根据本发明，还设想出用于通过暴露于环境蛋白而诱出的疾病的药物，所述蛋白例如:
[0080](I)所述受治疗者通过食物或饲料暴露的蛋白。这些的实例是谷物如小麦、玉米、大米、大豆和菜籽，蔬菜如马铃薯和甜菜根，水果如酒糟(rosacea)、坚果和鳄梨，酶类，抗病毒或抗细菌药物。
[0081](2)受治疗者通过吸入、全身路径或螫伤暴露的蛋白。这些的实例是对花粉的变应性反应，对胶乳或膜翅目螫刺的接触性反应。[0082]根据本发明，还设想出用于免疫(接种)的药物，所述接种例如:
[0083](I)针对变应原的接种
[0084](2)针对传染剂的接种，所述传染剂包括病毒、细菌和寄生虫
[0085]在这两个情况下，可能有利的是阻止先天性免疫系统的激活，以便阻止炎症的过量和其对所述接种的结果的有害后果。对变应原或传染剂的接种的设定中的另一优点在于，NKT细胞激活的消除阻止激活的NKT细胞对针对所述变应原或所述传染剂的适应性应答的发展的抑制作用。
[0086]应该承认的是，上述名单并非详尽无遗并且本发明旨在涵盖新推出的产品，例如抗体，细胞因子，在天生或后天缺陷中用于替换的增长因子或肽和多肽，和基因修饰的蛋白。
[0087]应当理解的是，上文所列任何肽或多肽可以用于转基因的基因形式施用，所述施用通过本领域技术人员已知的病毒载体或其它方法进行。在这种情况下，可以根据本发明通过消除CDld结合基序来修饰病毒载体本身。
[0088]尽管不是必需，本发明的药物通常是(药物)制剂，其包含作为活性成分的至少一种本发明的肽或多肽或能够表达所述肽或多肽的基因治疗性载体。除所述活性成分以外，这种制剂将包含至少一种(药学上可接受的)稀释剂。
[0089]该规则值得注意的例外是使用通过吸入或通过全身路径暴露的来自用于食物或饲料的基因修饰的有机体的蛋白。
[0090]一般说来，本发明的肽或多肽的施用阻止先天性免疫系统的激活，更特别是NKT细胞的激活，更特别地是与NKT细胞激活相关的细胞因子的产生。
[0091]用于本发明的肽 或多肽的施用途径可以根据指示和/或肽或多肽的性质变化。实例是凝血因子的静脉内注射，胰岛素的皮下注射和基因修饰的蛋白的口服施用。本发明旨在涵盖所有其它可能的施用途径，例如鼻内、舌下、经皮、肌肉内、直肠内或阴道内。
[0092]如进一步详细解释的，本发明的肽或多肽可以通过化学合成制备，所述制备还允许非天然氨基酸的掺入。本发明的肽或多肽也可用本领域已知用于产生重组蛋白质的方法，使用表达系统如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞来产生。
[0093]本发明的另一方面涉及用于产生本文所述的本发明的肽和多肽的方法。这种方法包括对NKT细胞表位的鉴别，所述NKT细胞表位来自外源因子，病毒载体，所述受治疗者通过食物、饲料、全身或吸入路径暴露的蛋白，变应原或特异性传染剂。用于体外的和计算机模拟的NKT细胞表位鉴别的方法是本领域熟知的，并且某些方面在后文详细说明。
[0094]在本发明的背景下，NKT细胞表位的鉴别对本领域的技术人员是已知的。举例而言，通过(例如)NKT细胞生物技术，测试与外源因子，病毒载体，所述受治疗者通过食物、饲料、全身或吸入路径暴露的蛋白，基因修饰的蛋白，变应原或特异性传染剂分离的肽序列，以确定肽序列是否诱出NKT细胞应答。被发现诱出NKT细胞应答的那些肽序列定义为具有NKT细胞刺激活性。还可以通过培养从对外源因子，病毒载体，所述受治疗者通过食物、饲料、全身或吸入路径暴露的蛋白，基因修饰的蛋白，变应原或特异性传染剂敏化的个体获得的NKT细胞，并且例如根据通过氚化胸苷的细胞摄取测量来确定NKT细胞的增殖是否响应于肽/表位而发生，测试哺乳动物NKT细胞刺激活性。NKT细胞对肽/表位响应的刺激指数可以按响应于肽/表位的最大CPM除以对照CPM来计算。将等于或大于背景水平两倍的NKT细胞刺激指数(S.1.)视为"阳性"。阳性结果用于计算所测试肽/表位群组的每个肽/表位的平均刺激指数。还可以任选地测试非天然NKT细胞表位对CDld分子的结合亲和力。非天然NKT细胞表位对CDld分子的结合可以不同方法进行。举例而言，获得可溶⑶Id分子，并且通过合成和/或化学偶合制备四聚物。通过亲合色谱法纯化该⑶Id分子。用根据对所述CDld分子的强烈结合亲和力产生的生物素标记的参考肽，培育可溶CDld分子。随后在不同浓度下培育待评估CDld结合的肽，并且其替代其CDld结合位点的参考肽的能力通过添加亲和素来计算。在例如Texier等人(2000) J.1mmunologyl64, 3177-3184中可见用于通过MHCII类决定簇呈现肽的方法，但该方法可以容易地应用于⑶Id限制性NKT细胞表位。本发明的免疫原性肽或多肽具有大于或等于2的平均NKT细胞刺激指数。认为NKT细胞刺激指数大于或等于2的免疫原性肽可用作候选者来进行CDld结合基序的序列中疏水的氨基酸残基的取代或删除，或氨基酸的添加，如在本发明中所述。
[0095]如果通过T细胞生物技术测定，共享天然肽或多肽序列中重叠区域的两个或多个氨基酸序列被发现具有人NKT细胞刺激活性，则针对属于所述序列中的一个或两个的残基进行疏水的氨基酸残基的突变或删除。
[0096]可以通过在例如细菌细胞(例如大肠杆菌)，酵母细胞(例如毕赤酵母(Pichia)物种，汉逊酵母(Hansenula)物种，酿酒酵母(Saccharomyces)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属物种)，昆虫细胞(例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))，植物细胞或哺乳动物细胞(例如，CHO、COS细胞)中重组表达产生本发明的肽或多肽。同时，因此所需的合适表达载体的结构(包括进一步信息，例如启动子和终止序列)涉及标准重组DNA技术。例如，经由接近肽或多肽的N-和/或C-末端插入的酶切位点的酶切，随后适当纯化，本发明的重组产生的肽或多肽可以来源于较大前体蛋白。
[0097]考虑到本发明 某些肽的有限长度，它们可以通过化学肽合成法制备，其中肽是通过不同氨基酸彼此偶合来制备。化学合成特别适于对例如D-氨基酸、具有非天然侧链的氨基酸或具有修饰侧链的天然氨基酸例如甲基化半胱氨酸的夹杂。化学肽合成法已被充分描述，并且肽可以订购自诸如Applied Biosystems公司和其它公司。可以按固相肽合成法(SPPS)或者与液相肽合成法相反，进行肽合成。熟知的SPPS方法是技术人员熟知的t-Boc和 Fmoc 固相化学法。另外，按 Kent 最初描述(Schnolzer & Kent (1992) Int.J.Pept.Protein Res.40，180-193)和例如在Tam等人(2001)Biopolymers60，194-205 中总结，可以使用连接策略(两个未保护肽片段的化学选择偶合)将肽彼此连接以形成较长肽。这提供实现超过SPPS范围的蛋白合成的可能性。尺寸为100至300个残基的许多蛋白已经成功通过该方法合成。
[0098]测验本发明的肽或多肽的物理和化学性质(例如可溶性、稳定性)以确定该肽是否适用于/是否将适用于治疗性组合物。一般地，所述性质通过调整肽的序列来优化。任选地，该肽可以在合成之后使用本领域已知技术修饰(化学修饰，例如添加/删除官能团)。
[0099]基因修饰的有机体的产生依赖于本领域技术人员众所周知的方法，包括克隆、定点诱变和生长。
[0100]本发明还涉及编码本发明的肽或多肽的核苷酸序列，和它们用于重组表达或基因疗法的方法。特别地，所述核苷酸序列能够表达本发明的肽。[0101]在基因疗法中，编码本发明的肽或多肽的重组核苷酸分子可以用作裸露DNA，或用于递送至靶标细胞的脂质体或其它脂质系统中。用于将质粒DNA直接转移到细胞中的其它方法是本领域技术人员熟知用于人基因疗法中的，并且涉及通过将该质粒DNA复合至蛋白而使DNA靶向细胞上的受体。在其最简单的形式中，可以通过显微注射的方法，简单地将微量DNA注射到细胞的核中，进行基因转移。一旦重组基因被引入细胞中，则可以通过转录和翻译的细胞正常机制将其识别，并且基因产物将被表达。也已经尝试了将DNA引入大量细胞中的其它方法。这些方法包括:转染，其中由磷酸钙沉淀DNA并且通过胞饮作用进入细胞；电穿孔，其中细胞暴露于大电压脉冲以在膜中开孔；脂质体转染/脂质体融合，其中DNA被包装到与靶标细胞融合的亲脂性囊泡中；和粒子轰击，其使用结合至小轰击粒子的DNA。将DNA弓丨入细胞中的另一方法是将DNA偶合至化学修饰的蛋白。腺病毒蛋白能够使核内体不稳定并且增强细胞中DNA的摄取。将腺病毒混合至含有DNA复合物的溶液，或使用蛋白交联剂将DNA结合至与腺病毒共价连接的聚赖氨酸，显著提高重组基因的摄取和表达。腺相关病毒载体也可用于对血管细胞的基因递送。如本文中所用，"基因转移"意思是将外来核苷酸分子引入细胞中的方法，通常进行该方法以允许由该基因编码的特定产物表达。所述产物可以包括蛋白、多肽、反义DNA或RNA、或酶活性的RNA。可以在培养细胞中或由直接施用到哺乳动物中，进行基因转移。在另一实施方案中，提供包含编码本发明的肽的核苷酸分子序列的载体。在具体实施方案中，产生该载体以使得核苷酸分子序列仅在特定组织中表达。实现组织特异性基因表达的方法是本领域熟知的，例如，将编码本发明的免疫原性肽的序列置于启动子的控制下，所述启动子指导肽在一种或多种组织或器官中的特异性表达。来源于病毒诸如逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、RNA病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可以用于将编码本发明的肽、其同系物或衍生物的核苷酸序列(例如cDNA)递送到靶向组织或细胞群中。本领域技术人员熟知的方法可用于构造含有这种编码序列的重组病毒载体。或者，含有本发明的肽或多肽的核苷酸分子代码的工程细胞可以用于基因疗法中。
[0102]本发明的药物通常是，然而并非必然(例如，由基因修饰的有机体产生的蛋白，其用于食物、饲料、或所述受治疗者经全身或吸入路径暴露的)，(药物)制剂，其包含作为活性成分的至少一种本发明的肽或多肽，能够表达所述肽或多肽的基因治疗性载体。除所述活性成分以外，这种制剂将包含至少一种(药学上可接受的)稀释剂。一般地，药学上可接受的化合物可以见于例如药典手册(例如美国、欧洲或国际药典)。本发明的药物或药物组合物通常包含(预防或治疗)有效量的活性成分，其中有效是相对于待预防或治疗的病况或病症。
[0103]作为包含多次施用所述药物或组合物的预防性或治疗性方案的一部分，本发明的药物或药物组合物可能需要施用至有需要的受治疗者。所述多次施用通常顺序地发生，并且两次施用之间的时间间隔可以变化并将针对活性成分的性质和待预防或治疗的病况的性质进行调整。给予需要单独施用的受治疗者的活性成分的量也可变化，并且将取决于诸如受治疗者的物理状态(例如重量和年龄)，待预防或治疗的病况的状态，和主治医生、医师或护士的经验之类因素。[0104]术语“稀释剂”是指例如生理盐水溶液。术语"药学上可接受的载体"意思是用于配制活性成分以便例如通过溶解、分散或扩散所述组合物来促进其对待治疗部位的应用或传播，和/或促进其存贮、运输或处理而不削弱其有效性的任何材料或物质。它们包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂(例如苯酚、山梨酸、氯丁醇)、等渗剂(例如糖类或氯化钠)等等。可以包括其它成分，以便控制组合物中活性成分的作用持续时间。药学上可接受的载体可以是固体或液体或经压缩形成液体的气体，即，本发明的组合物可以适当地用作浓缩物，乳液，溶液，颗粒，粉剂，喷雾剂，气溶胶，悬浮体，软膏，霜剂，片剂，小球或粉末。供所述药物组合物和其制剂使用的合适药用载剂是本领域技术人员熟知的，并且在本发明内对其选择不存在特别限制。它们也可包括添加剂，例如润湿剂、分散剂、粘着剂、粘合剂、乳化剂、溶剂、涂层、抗细菌和抗真菌剂(例如苯酚、山梨酸、氯丁醇)、等渗剂(例如糖类或氯化钠)等等，前提是它们符合药用实践，即，不对哺乳动物产生永久伤害的载体和添加剂。本发明药物组合物可以任何已知方式制备，例如将所述活性成分与所选载体材料和在适当情况下的其它添加剂如表面活性剂一起单步或多步地均匀混合、涂布和/或研磨。它们也可微分化制备，例如以便获得通常直径为约I至10 μ m的微球体形式，即制造用于受控或持续释放所述活性成分的微胶囊。
[0105]本发明的肽或多肽、其同系物或衍生物(和其生理上可接受的盐或药物组合物，均包括在术语"活性成分"中)可以通过适合待预防或治疗的病况并适合所述化合物(此处待施用的肽或多肽)的任何路径来施用。可能的路径包括区域，全身，口服(固态或吸入)，直肠，鼻内，局部(包括眼，颊和舌下)，阴道和肠道外(包括皮下，肌肉内，静脉内的，真皮内，动脉内，鞘内和硬膜外)。优选的施用途径可以随例如接受者的状况或待预防或治疗的病况而变化。
[0106]该制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。适于口服施用的本发明制剂可以作为离散单元呈现，例如均含有预定量的活性成分的胶囊、扁胶囊或片剂；作为粉末或颗粒呈现；作为水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮体呈现；或作为水包油液体乳液或油包水液体乳液呈现。活性成分也可作为大丸剂、药糖剂或糊剂呈现。片剂可以通过压缩或模制来制备，并且任选地具有一个或多个辅助成分。通过在合适机器中将活性成分压缩成自由流动形式如粉末或颗粒，并任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性或或分散剂混合，可以制备压缩片剂。通过在合适机器中，模塑由惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物，可以制作模制片剂。片剂可以任选地被涂布或刻痕，并且可以经配制而提供其中活性`成分的缓释或受控释放。
[0107]对基因疗法或基因接种来说，病毒载体非常适合藉由重组核苷酸技术来修饰。鉴于以上所述，技术人员将进一步容易地设想出，本发明的肽或多肽及其用途中应用的病毒载体NKT细胞表位的消除可以立即适用于病毒载体本身。因此，本发明进一步涵盖修饰的病毒载体，其定义为分离的病毒载体，其特征在于CDld结合基序已经通过氨基酸取代或删除消除。
[0108]现在将通过以下实施例说明本发明，无任何限制意图地提供所述实施例。此外，本文所述的所有参考资料明确地以引用方式包括在本文中。
实施例
[0109]实施例1:凝血闵子VIII
[0110]罹患血友病A的患者缺乏足够量的VIII因子(FVIII)，这是出血倾向不受控制的原因。这种患者通过输注FVIII来治疗，所述FVIII纯化自血浆来源或通过重组技术产生。FVIII的施用导致特定抗体的形成，其在几乎30%的病例中抑制FVIII作为凝血辅因子的功能。
[0111]使用算法，我们在FVIII分子的序列内鉴别出携带CDld结合序列的3个序列，其与[FWTHY]-X2X3-[ I LMV]-X5X6-[FWTHY]序列基序匹配。这些基序分别位于Al域和A3域中:
[0112]Al 域中的 ECHISSH(氨基酸 309-315，SEQ ID I)
[0113]A3 域中的 EWKYQHH(氨基酸 1816-1822，SEQ ID 2)
[0114]A3 域中的 EHAINGK 氨基酸 1918-1924，SEQ ID 3)
[0115]这些序列共同地具有(下划线)位置I中的芳族残基(苯丙氨酸，F)，位置4中的脂族残基(异亮氨酸，I，或缬氨酸，V)，和位置7中的芳族残基(组胺酸，H，或酪氨酸，Y)。
[0116]为确定这些序列是否可以在体内激活NKT细胞，间隔I周地4次将FVIII (2IU)静脉内地注射至血友病A小鼠。由于引入外显子16中FVIII基因内的终止密码子，血友病A小鼠不产生FVIII。
[0117]最后注射10天之后，处死小鼠，去除脾脏并且通过磁珠分选制备⑶4+T细胞。NKT细胞特征为CD4的表达和CDld分子呈现的抗原的识别。CDld的四聚物得自供应商，并且加载有15个氨基酸长的FVIII肽，其包括含有SEQ ID K SEQ ID 2和SEQ ID 3的肽。观察到加载有这些肽的⑶Id四聚物的显著结合，表明这3种肽能够结合至⑶Id并且FVIII的注射诱出NKT细胞的激活。代表性结果示于凰！中。
[0118]此外，采用含有CDld基序的肽(SEQ ID USEQ ID 2或SEQ ID 3的肽)的直接免疫足以诱出NKT细胞的激活并且产生对FVIII的抗体。用SEQ ID I的肽，观察到突出的激活。代表性结果示于里！中。
[0119]构造骨髓嵌合体，其中血友病A小鼠首先被辐射，并且与缺乏NKT细胞的小鼠(即敲除⑶Id的小鼠)的骨髓重构。在缺乏NKT细胞的情况下，小鼠不能产生显著量的对FVIII的抗体，并且实际上没有抑制FVIII的功能的抗体(图3)。
[0120]FVIII的Al域通过重组技术在其天然序列中产生，或用丝氨酸取代F309和H315(SEQ ID 4的多肽)来产生。将天然序列中的FVIII Al域或SEQ ID 4用于使小鼠的单独组免疫。该结果表明，根据如上所述的脾脏⑶4+T细胞评估，通过S取代F309和H315 (SEQID 4)足以阻止NKT细胞的激活。
[0121]FVIII的A3域通过重组技术在其天然序列中产生，或用丝氨酸取代F1816和H1822(SEQ ID 5的多肽)来产生。将天然序列中的FVIII A3域或SEQ ID 5用于使小鼠的单独组免疫。该结果表明，根据如上所述的脾脏⑶4+T细胞评估，通过S取代F1816和H1822(SEQ ID 5)足以阻止NKT细胞的激活。
[0122]在其天然序列中删除B域的FVIII分子诱出NKT细胞的激活(参见上文)。制备具有4个氨基酸取代的FVIII分子，其含有F309S、H315S、F1816S和F1918S(SEQ ID 6)。在血友病A小鼠中静脉内注射这种突变FVIII未导致对FVIII的抗体的形成，因而，无抑制FVIII功能的抗体形成。
[0123]因此推断出:
[0124](I)FVIII天然地含有若干⑶Id结合基序；
[0125](2)这些⑶Id基序是功能性的并且诱出NKT细胞的激活；[0126](3)NKT细胞的激活对产生对FVIII的抗体是必不可少的；
[0127](4)通过氨基酸取代消除⑶Id基序足以消除抗FVIII抗体的产生。
[0128]本领域技术人员应该清楚的是，本发明也适用于用于产生凝血因子如IX因子的转基因动物。
[0129]附图详沭
[0130]图1
[0131]NKT细胞识别由CDld呈现的VIII因子表位
[0132]隔一周地4次用2IUVIII因子使血友病A小鼠免疫。随后移除脾脏并且通过磁珠分选制备CD4+T细胞。CDld的荧色物标记的四聚物得自供应商，并且加载有15个氨基酸长的FVIII肽，其包括含有SEQ IDUSEQ ID2和SEQ ID3的肽。在室温下黑暗中过夜进行加载。随后，在4°C下用⑶4+T细胞群培育四聚物30分钟，并且通过Facs分析细胞悬液。
[0133]该图显示加载有SEQ IDl的肽(图中44p印t)的⑶Id四聚物被NKT细胞识别。CDld ctl (-)示出识别未加载的四聚物的NKT细胞百分比。CDld ctl (+)示出识别加载有a -gal神经酰胺的四聚物的NKT细胞的百分比，所述a -gal神经酰胺补充所有NKT细胞。至多45%的NKT细胞识别44pept，这与⑶Id水平下多态性的的缺乏和NKT T细胞受体水平下十分有限的多态性不矛盾。
[0134]图2
[0135]用⑶Id限制性肽使血友病A小鼠免疫诱出抗VIII因子抗体
[0136]用吸附在氢氧化铝上的SEQ ID I (44pept)的肽和SEQ ID 2 (256pept)的肽的等摩尔混合物50 μ g，皮下3次，使血友病A小鼠免疫。对照组接受生理血清，而非肽。在最后免疫10天之后提取血浆，并且使用直接结合检定，评估抗VIII因子抗体的存在。简单来说，VIII因子(10IU/ml)在聚苯乙烯板上不溶解，将其洗涤并且用1/10稀释的血浆培育。在进一步洗涤之后，添加HRP标记的山羊抗小鼠抗血清，随后添加酶底物。将彩色显影读数为0D。
[0137]该图显示用SEQ ID I和SEQ ID 2的肽免疫的血友病A小鼠发展出对VIII因子的抗体。
[0138]图3
[0139]用来自⑶Id KO小鼠的骨髓重构的血友病A小鼠不产生对VIII因子的抗体
[0140]血友病A小鼠经受致命辐射并且用⑶Id KO小鼠(5xl06/小鼠)(其缺乏NKT细胞)的骨髓重构。骨髓重构六周之后，小鼠接受相隔一周的4次2IU/mlIV注射。最后免疫10天之后，使小鼠放血，并且使用直接结合检定，对血浆检定抗VIII因子抗体的存在，如图2的图例中所述。用正常骨髓重构辐射血友病A小鼠的对照组。
[0141]该图表明，虽然对照小鼠在第四次VIII因子注射之后产生高浓度的抗FVIII抗体(左图)，但用贫NKT细胞的小鼠的骨髓重构的小鼠未产生高浓度抗FVIII抗体(右图)。
[0142]实施例2:腺病毒5病毒载体
[0143]病毒载体通常用于基因疗法和基因接种。这些病毒载体中最常见的一种来源于腺病毒，血清型5。腺病毒(Ad)是拥有约35kb的直链、双链DNA基因组的非包膜病毒。人Ad5具有由3个主要结构蛋白组成的衣壳:六邻体、五邻体和纤维。针对六邻体蛋白的中和抗体升高。由于病毒传染，这种抗体是人类中十分常见的。这种抗体的存在阻断病毒载体的进入，并因而阻止该载体携带的转基因蛋白的表达。抗Ad5抗体在适应性应答的过程中产生，其取决于对在MHC II类分子的背景下呈现的表位具有特异性的CD4+T细胞的激活。
[0144]已知Ad5激活先天性免疫系统，但其发生的精确机制和其进行的位置尚不清楚。然而，先天性免疫系统的激活可能是需要用于中和待形成抗体的步骤。
[0145]使用算法，我们在六邻体6中鉴别了与⑶Id结合序列(SEQ ID7，具有下划线基序)的一般基序[FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]匹配的7个氨基酸序列。
[0146]间隔10天3次地用IO9PFU Ad5载体静脉内注射小鼠。随后通过磁珠分选由脾脏制备CD4+T细胞。用CDld四聚物培育CD4+T细胞，所述CDld四聚物加载有对应于各个被鉴别的7个序列的肽。其显示，显著比例(±10%)的⑶4+NKT细胞被四聚物标记，表明Ad5载体注射激活了对SEQ ID 7的肽具有特异性的NKT细胞。另外，这种小鼠产生IgG2a同种型的特异性抗体，特征为小鼠中的中和抗体。
[0147]针对各个鉴别的7个氨基酸序列，制备含有[FW]被丝氨酸S取代的病毒载体。该突变病毒载体(SEQ ID 8，具有下划线基序)用于根据如上针对天然序列所述的相同方案使动物免疫。根据使用加载有天然序列(SEQ ID 7)的肽的四聚物评估，NKT细胞的比例< I %，并且Ad5病毒特异性抗体的浓度显著降低(多达10倍)。
[0148]因此推断出，⑶Id结合基序的各Pl位中F至S的取代足以降低NKT细胞激活并且因此降低抗Ad5抗体的产生。
[0149]实施例3:基因修饰的蛋白
[0150]受治疗者通过吸入或摄取暴露的蛋白在易感染受治疗者中频繁诱出不希望的反应。变应性哮喘影响全世界几百万人。另一方面，食物过敏在一般群体中具有±2.5%的总患病率。空气传播的、摄取的或刺入皮肤的变应原可能共享其激活NKT细胞的性质。
[0151]最常见的食物变应原之一是苹`果(Malus domesticus),并且变应原性几乎仅仅由Mal d I蛋白携带,所述Mal d I蛋白是一种159个氨基酸长的蛋白，其保护植物抵抗传染剂。序列基序用电脑算法鉴别，其对应于CDld结合序列的一般基序[FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]。
[0152]对应于Mal dl 的氨基酸 144-150 的 ￡KLIESI(SEQ ID 9)
[0153]通过基因工程产生Mal d I的重组形式，其中F144和Y150在S中突变。Mal d I的重组形式因此包含以下序列的肽:
[0154]SKLIESS (SEQ ID 10)
[0155]产生对应于SEQ ID 9和SEQ ID 10的合成肽。它们激活NKT细胞的能力是使用来源于对Mal d I敏化的个体的周围血液单核细胞的人树状细胞来体内测定。加载有所述两个肽中每一个的树状细胞在NKT细胞存在下培育，所述NKT细胞通过使用诸如CD4和NKG2D之类特定标记分选周围淋巴细胞而从相同个体获得。观察到用SEQ ID9的肽培育的NKT细胞激活显著比例的NKT细胞，而SEQ ID 10的突变肽则没有如此。另外，加载有SEQID 9的肽的人⑶Id四聚物被显著比例的NKT细胞识别，但加载有SEQ ID 10的突变肽的四聚物被小于I %的NKT细胞识别。
[0156]F144S和Y150S两个突变通过定点诱变直接引入克隆细胞。随后通过常规生长策略，产生完整有机体。由该GMO产生的苹果不诱出变应性反应。
[0157]本发明的肽或多肽的一种具体应用是乳糜泻(谷蛋白不耐受)。该疾病是人类最常见的疾病，并且涉及对在MHC II类决定簇的背景下呈现的麦醇溶蛋白表位的T细胞激活。遗传易感性已经被描述，其中携带HLA-DQ2或DQ8 II类决定簇的人类易患疾病。这些II类决定簇呈现已经通过谷氨酰胺转移酶经受脱酰胺作用的肽。然而，这些事件是肠内炎性反应的结果，可能与先天性免疫系统有关。
[0158] 麦醇溶蛋白是250至300个氨基酸残基的单体。使用电脑算法搜索CDld结合序列的一般基序[FW]-XX-[ILM]-XX-[FWTHY]鉴别α麦醇溶蛋白中的这种序列(SEQ ID 11，参见序列表)。随后产生α麦醇溶蛋白的突变形式，其中基序的F残基被S残基取代(SEQID 12，参见附录)。
[0159]至于Mal d I的相同程序接着显示，虽然在由呈现抗原的树状细胞呈现时SEQ ID11的多肽激活显著比例的NKT细胞，但多肽(SEQ ID 12)的突变形式没能如此。至于Mald 1，加载有表现SEQ ID 11的多肽中识别的基序的合成肽的人⑶Id四聚物被NKT细胞识另O，而加载有如SEQ ID 12中所示基序的突变形式的四聚物则未被识别。
[0160]所述突变通过定点诱变直接引入克隆细胞。随后通过常规生长策略，产生完整有机体。含有麦醇溶蛋白的突变形式的谷物不诱出不耐受的反应。
[0161]对于本领域技术人员而言应该显而易见的是，本发明也可应用于被加入(例如)基因修饰的有机体以增加它们对杀昆虫剂、杀虫剂的耐性或判断为有益的任何其它修饰的蛋白。这种修饰具有产生新⑶Id结合基序的风险。
[0162]具有降低的变应原性/免疫原性的基因修饰的蛋白的其它实例是:
[0163].食物变应原,例如大豆、花生和蔷薇科家族的果实
[0164].牛奶蛋白
[0165].空气传播的变应原,例如胶乳(Hevea brasiliensis),草的花粉,例如黑麦草(Lolium perenne)、梯牧草(Phleum pratense)或草地早熟禾(Poa pratensis)
[0166]?鱼小白蛋白
[0167]?蜜蜂磷脂酶A2
[0168]对于本领域技术人员而言也应该清楚的是，本发明扩展至这样的方法，通过其产生本发明的肽或多肽，包括产生转基因植物和动物。
[0169]实施例4:变应原Der P I
[0170]Der p I是半胱氨酸蛋白酶,其为所谓房尘螨(HDM),屋尘螨(D.pteronyssinus)的主要变应原。HDM过敏是目前全世界最常见的变应性哮喘和鼻炎触因。如使用电脑算法鉴别的，Der P I 含有与一般 CDld 结合基序[FWTHY]-X2X3-[ I LMV]-X5X6-[FWTHY]匹配的 3个基序，它们是:
[0171]SEQ ID 13:FSGVAAT, Der p I 的氨基酸 38 至 44
[0172]SEQ ID 14:HSAIAAVI, Der p I 的氨基酸 135 至 141
[0173]SEQ ID 15:YPYVVIL, Der p I 的氨基酸 216 至 222
[0174]合成SEQ ID 13、SEQ ID 14和SEQ ID 15的肽并且用于加载CDld四聚物。
[0175]使用含有IOOygDer p I的50 μ I盐水,使Balb/c小鼠经受Der p I的鼻内施用。间隔一周连续三天地两次重复该挑战程序。在最后鼻腔滴注5天之后处死该小鼠，并且移除脾脏。通过磁珠分选纯化⑶4+T细胞，并且在加载有SEQ ID 13,SEQ ID 14或SEQ ID 15的肽的⑶Id四聚物存在下培育。通过荧光激活的细胞分选仪(facs)测定，观察到显著百分比的细胞(±10% )被四聚物着色，从而鉴定它们为⑶4+NKT细胞。因此推断出，SEQ ID
13、SEQ ID 14和SEQ ID 15的肽在结合至⑶Id和通过NKT细胞鉴别中发挥作用。
[0176]得自上述实验的⑶4+T细胞在表达⑶Id分子的呈现抗原的细胞存在下在培养基中培育。这种细胞是市售的，例如JAWS2细胞，其不表达MHCII类决定簇。JAWS2细胞加载有Der pi，并且通过测量作为NKT激活的标记的细胞因子例如IFN- Y和IL-4的产生，评价由⑶Id对Der p I衍生表位的呈现。可观察到细胞因子的显著产生，从而确认Der p I含有⑶Id分子呈现的表位。
[0177]接着，通过基因工程制备Der p I的突变形式，其中预测处于Pl位的用于SEQ ID
13、SEQ ID 14和SEQ ID 15的肽的⑶Id结合的3个氨基酸残基被丝氨酸取代。突变DerP I (SEQ ID 16)用于鼻腔滴注，如上文对天然序列中的Der p I (SEQ ID 17)所述。在这种情況下，观察到当用加载有SEQ ID 13的肽、SEQ ID 14的肽或SEQ ID 15的肽的四聚物培育时⑶4+T脾细胞无显著结合，从而表明突变Der p I已经丧失其激活对这些肽特异性的NKT细胞的能力。
[0178]此外，突变Der p I (SEQ ID 16)用于加载JAWS2细胞并且测试其激活NKT细胞的能力。对于这种实验，使用从用天然或突变结构的Der P I免疫的小鼠获得的NKT细胞。将IFN- Y和IL-4的产生当作NKT激活的指示。观察到，当在加载有突变Der p I的JAWS2细胞存在下培育时，从用天然序列Der P I免疫的小鼠获得的NKT细胞未能被激活。
[0179]因此推断出，天然序列的Der p I含有激活NKT细胞的功能性⑶Id限制性T细胞表位。此外，通过突变消除这种功能性CDld限制性表位足以消除NKT细胞激活。
[0180]实施例5:杭体
[0181]抗体作为治疗性药用于许多的指示中，从慢性炎性疾病例如类风湿性关节炎(如抗TNF- α抗体)或变应性哮喘(如抗IgE`抗体)到肿瘤(如抗CD20抗体)。超过120个治疗性抗体目前在从临床前到III期试验的各个阶段中用于临床应用，并且为常规临床实践所接受。
[0182]治疗性抗体是嵌合的或完全人源化的，其仅在可变部分的互补性测定区域中含有外来来源的序列。少数这种抗体来源于人所有组成部分，并因此被视为差免疫原性的。然而，即便当直接来源于人所有组成部分时，针对治疗性抗体的抗体由大部分治疗中的患者产生，并且，在显著比例的病例中，抗体的产生中和治疗性药的活性。
[0183]使用电脑算法进行对与人IgG抗体序列中CDld结合基序匹配的表位的搜索。这种基序之一在4种IgG亚类(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)每一者的CH2区域(重链恒定部分的第二域)中被鉴别，并且第二基序在IgGl、IgG2和IgG4的CH3环中被鉴别:
[0184]SEQ ID 18:YRVVSVL (IgGl 和 IgG4 的 CH2)
[0185]SEQ ID 19:FRVVSVL (IgG2 和 IgG3 的 CH2)
[0186]SEQ ID 20:HEALHNH(IgGK IgG2 和 IgG4 的 CH3 环)
[0187]产生对应于SEQ ID 18,SEQ ID 19和SEQ ID 20的合成肽，并且用于加载人CDld四聚物，按照上文实施例(参见例如针对变应原Der P I的实施例4)。通过对已经在前5天接受治疗性抗体注射的患者静脉穿刺，获得周围血液细胞。通过磁珠分选纯化CD4+T细胞。随后用加载有SEQ ID 18、SEQ ID 19或SEQ ID 20的肽的四聚物，培育所述细胞。通过facs分析鉴定由四聚物标记的显著比例的NKT细胞(±10% )。[0188]通过用Epstein Barr病毒转化,从周围血液B淋巴细胞获得IgG4同种型的单克隆人抗体。这种抗体的基因组序列得自转化的B细胞。构造含有对应cDNA序列的病毒载体并且用于CHO细胞的转染。所有这些方法是本领域已知的(参见例如，Jacquemin等人Blood92:496-506,1998)。
[0189]位于SEQ ID 18和SEQ ID 20的肽中I位的疏水的氨基酸残基被突变为丝氨酸和由转染CHO细胞产生的突变抗体。
[0190]在培养基中将如上获得的周围血液CD4+T细胞暴露于人树状细胞(通过本领域已知方法来源于人周围血液单核细胞)并用天然结构(SEQ ID 21)的抗体或其突变对应物(SEQ ID 22)加载。在用⑶4+T细胞培养5至7天之后，评价由天然或突变抗体激活的⑶4+T细胞的群体。使用NKG2D的抗体(仅与NK或NKT细胞相关的表面标记)将⑶4+NKT细胞与⑶4+T细胞分离。
[0191]观察到，当使用天然序列(SEQ ID 21)的抗体时，⑶4+T细胞和NKT细胞被激活，而抗体的突变形式(SEQ ID 22)仅激活II类限制性CD4+T细胞，并不激活NKT细胞。
[0192]推断出人IgG抗体含有对应于[FWTHY]-X2X3-[ I LMV]-X5X6-[FWTHY]基序的表位，所述表位具有被NKT细胞识别并激活NKT细胞的能力。此外，这种基序中关键疏水的氨基酸残基的突变足以阻止NKT细胞的激活。
[0193]应当理解的是本文提供的实施例并非详尽无遗，并且可能想象出含有各个数量的氨基酸取代或删除的蛋 白或肽的组合。举例而言，在实施例1中，可以描绘疏水氨基酸的取代的各个组合。
[0194]序列表
[0195]SEQ ID I
[0196]VIII 因子氨基酸 309-315(人)
[0197]FCHISSH
[0198]SEQ ID 2
[0199]VIII 因子氨基酸 1816-1822(人)
[0200]FffKVQHH
[0201]SEQ ID 3
[0202]VIII 因子氨基酸 1918-1924(人)
[0203]FHAINGY
[0204]SEQ ID 4
[0205]因子Al域(突变F309S和H315S处有下划线)(人)
【权利要求】
1.一种获得激活NKT细胞的能力降低的分离肽或多肽的方法，其包含以下步骤: a.鉴别至少一个NKT细胞表位，其中所述表位在Pl位和/或P7位包含疏水的氨基酸残基; b.通过用非疏水的残基取代Pl位和/或P7位的疏水的氨基酸残基，消除所述表位。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水的残基是F、W、T、H、Y。
3.根据权利要求2所述的方法，其中Pl位和/或P7位的至少一个F、W、T、H、Y由至少一个任意天然氨基酸、非天然氨基酸或非芳族氨基酸化合物替换，其中所述氨基酸不同于F、W、T、H、Y。
4.根据任一上述的权利要求所述的方法，其特征在于，所述至少一个NKT细胞表位在P4包含脂族残基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，P4中的所述脂族残基是1、L、M。
6.根据任一上述的权利要求所述的方法，其中所述NKT细胞表位包含[FffTHY] -X2X3-[ILMV] -X5X6-[FffTHY]基序，其中 I 位和 / 或 7 位中的至少一个 F、W、T、H、Y 被删除。
7.一种可以根据权利要求1至5获得的分离肽或多肽，其中所述肽或多肽由化学合成或由重组表达产生。
8.可根据权利要求1至6的方法获得的所述肽或多肽，其衍生自外源因子、病毒载体、通过食物、饲料、全身或吸入路径发生天然暴露的蛋白质、变应原或接种中所用传染剂，其中所述外源因子是凝血或纤维蛋白溶解因子、酶类、激素、细胞因子、细胞因子受体、增长因子或治疗性抗体，其中所述病毒载体衍生自腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒，其中发生天然暴露的所述蛋白质是用于饲料或食物的蛋白质、酶类、抗病毒或抗细菌药物、牧草花粉、树或野草的花粉、接触性致敏原、昆虫或膜翅目毒液，其中所述变应原是空气传播的变应原、食物变应原、昆虫或膜翅目毒液，并且其中所述传染剂是病毒、细菌或寄生虫。
9.可根据权利要求1获得的任何肽或多肽用作药物的用途。
10.根据权利要求7至8的任何肽或多肽用作药物的用途。
11.根据权利要求7至8的任何肽或多肽用作药物的用途，所述药物用于在哺乳动物中阻止或治疗针对外源因子、针对用于基因疗法或基因接种的病毒载体、针对通过食物、饲料、全身或吸入路径发生天然暴露的蛋白质的免疫应答。
12.根据权利要求7至8的任何肽或多肽用于变应性疾病中接种或用于传染剂的用途。
13.根据权利要求7至8的任何所述肽或多肽用作药物的用途，所述用于在哺乳动物中减少NKT细胞激活。
14.根据权利要求7至8中任一项的任何肽的用途，其中施用能够表达所述肽或多肽的核苷酸序列。
【文档编号】C07K14/435GK103596971SQ201180064053
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2011年11月24日 优先权日:2010年11月25日
【发明者】圣雷米·吉恩玛丽 申请人:伊姆耐特有限责任公司