Vip3Ab和Cry1Ab用于管理抗性昆虫的组合用途

Vip3Ab和Cry1Ab用于管理抗性昆虫的组合用途
【专利摘要】本发明包括用于控制鳞翅目昆虫的方法和植物，所述植物包含与Cry1Ab蛋白组合的Vip3Ab杀虫蛋白以延迟或防止昆虫，特别是棉铃虫形成抗性。
【专利说明】Vip3Ab和CryIAb用于管理抗性昆虫的组合用途
[0001]发明背景
[0002]人类种植玉米(corn)以供食物和能量应用。人类还种植许多其它作物，包括大豆和棉花。昆虫食用并损害植物，并且由此削弱这些人类努力。每年花费数十亿美元来控制昆虫有害物，并且它们造成的损害损失额外的数十亿。合成的有机化学杀虫剂已经是用于控制昆虫有害物的主要工具，但是生物学杀虫剂，诸如自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis, Bt)衍生的杀虫蛋白(insecticidal protein)已经在一些领域中发挥重要作用。经由用Bt杀虫蛋白基因转化生成昆虫抗性植物的能力已经使现代农业发生革命，而且提高杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。
[0003]已经使用几种Bt蛋白来创建至今已经成功登记并商业化的昆虫抗性转基因植物。这些包括玉米中的CryIAb、CryIAc、CryIF和Cry3Bb、棉花中的CrylAc和Cry2Ab、和马铃薯中的Cry3A。
[0004]除了在2种蛋白质的组合杀虫谱是期望的(例如，玉米中的CrylAb和Cry3Bb组合以分别提供对鳞翅目害虫和根虫的抗性)或蛋白质的独立作用使它们可用作用于延迟易感昆虫群中抗性形成的工具(例如，棉花中的CrylAc和Cry2Ab组合以提供烟草蚜虫的抗性管理)的情况中外，表达这些蛋白质的商业产品表达单一蛋白质。还可见US2009 0313717,其涉及用于控制谷实夜蛾(Helicoverpa zea)或棉铃虫(Helicoverpaarmigera)的 Cry2 蛋白及 Vip3Aa、CrylF、或 CrylA。WO 2009 132850 涉及用于控制草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的 CrylF 或 CrylA 和 Vip3Aa。US 2008 0311096 部分涉及用于控制CrylF抗性ECB的Cry IAb。
[0005]也就是说，已经导致此技术的快速且普遍采用的昆虫抗性转基因植物的一些质量(quality)还引起如下的忧虑，即害虫(pest)群体会形成对由这些植物生成的杀虫蛋白的抗性。已经提示了保留基于Bt的昆虫抗性性状的效用的几种策略，其包括与避难所(refuge)组合以及与不同毒素交替、或在不同毒素共部署中部署(deploy)高剂量的蛋白质(McGaughey 等(1998)，“B.t.Resistance Management, ”NatureBiotechnol.16:144-146)。
[0006]为了在IRM叠加中使用而选定的蛋白质需要独立地施加其杀虫效果，使得对一种蛋白质形成的抗性未赋予对第二种蛋白质的抗性(即，没有对蛋白质的交叉抗性)。如果例如在对“蛋白质A”的抗性方面选定的害虫群对“蛋白质B”敏感，那么会推断没有交叉抗性，并且蛋白质A和蛋白质B的组合会有效延迟对单独的蛋白质A的抗性。
[0007]在没有抗性昆虫群的情况中，可以基于假设与作用机制和交叉抗性潜力相关的其它特征做出评估。已经提示了受体介导的结合在鉴定有可能不展现出交叉抗性的杀虫蛋白中的效用(van Mellaert等1999)。缺乏此方法中固有的交叉抗性的关键预测物(predictor)是杀虫蛋白在敏感的昆虫物种中不竞争受体。
[0008]在两种Bt毒素竞争相同受体的情况中，则若所述受体在所述昆虫中突变，使得毒素之一不再结合所述受体，并且如此针对昆虫不再是杀虫性的，则情况可能是昆虫也会对第二种毒素(其竞争性结合相同受体)有抗性。也就是说，昆虫被说成与这两种Bt毒素有交叉抗性。然而，若两种毒素结合两种不同受体，则这可以是如下的指示，即昆虫不会对那两种毒素同时有抗性。
[0009]CrylFa可用于控制许多鳞翅目害虫物种，包括欧洲玉米螟(European cornborer) (ECB ;玉米螟(Ostrinia nubilalis) (Hiibner))和秋粘虫(fall army worm) (FAff ；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)),并且针对甘鹿螟(sugarcane borer) (SCB ;小鹿螟(Diatraea saccharalis))是有活性的。CrylFa蛋白(如在含有事件TC1507的玉米植物中生成的)负责供FAW控制用的行业领先的昆虫抗性性状。CrylFa在Herculex ?、SmartStax?、和WideStrike?产品中进一步部署。
[0010]其它Cry毒素列于官方B.t.命名委员会的站点(Crickmore等；lifesc1.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。目前有几乎 60 个“Cry”毒素大类(Cryl_Cry59)，及其它Cyt毒素和VIP毒素等。许多数字组各自具有大写字母亚组，而大写字母亚组具有小写字母亚-亚组。(例如，Cryl具有A-L,而CrylA具有a_i)。
[0011]发明概述
[0012]本发明部分涉及如下的发现，即Vip3Ab和CrylAb彼此不竞争对来自谷实夜蛾(棉铃虫(corn earworm) ；CEff)的肠受体的结合。本发明还部分涉及如下的令人1惊讶的发现，即Vip3Ab针对对CrylAb有抗性的菱纹背蛾(diamondback moth, DBM)是有活性的。
[0013]凭借本公开内容的益处,本领域技术人员会认可，表达Vip3Ab和CrylAb,或其杀虫部分的植物会可用于延迟或防止形成针对任一单独的这些杀虫蛋白的抗性。
[0014]如此,本发明部 分涉及与CrylAb蛋白组合使用Vip3Ab蛋白。本发明的范围内包括生成Vip3Ab加CrylAb的植物(及种植有此类植物的土地面积)。
[0015]本发明还部分涉及三种(或更多种)毒素的三重叠加(triple stack)或“金字塔(pyramid) ”,其中Vip3Ab和CrylAb是基础对。此类三重叠加可以提供三种蛋白质，其提供针对CEW的非竞争性作用。这可以有助于进一步降低或消除对避难所土地面积的需要。
[0016]附图简述
[0017]图1:在将纯化的毒素表面应用于人工昆虫饮食时全长Vip3Abl针对小菜蛾(Linnaeus) (DBM)、和 CrylA 抗性小菜蛾(rDBM)、美洲棉铃虫(Heliothis zea) (CEW)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda) (J.E.Smith) (FAff)和玉米螟(Ostrinia nubilalis)(Hubner), (ECB)幼虫的死亡率剂量响应。百分比死亡率基于每剂在8个昆虫上对毒素暴露后5天采集的读数。
[0018]图2:在将纯化的毒素表面(topically)应用于人工昆虫饮食时全长Vip3Abl针对小菜蛾(Linnaeus) (DBM)、和CrylA抗性小菜蛾(rDBM)、美洲棉铃虫(CEW)、草地夜蛾(J.E.Smith) (FAff)和玉米螟(HUbner)，(ECB)幼虫的生长抑制剂量响应。百分比生长抑制基于仅用缓冲液处理的8个幼虫的平均重量与暴露于毒素5天的幼虫的重量的比较。
[0019]图3 =125I CrylAb对从美洲棉铃虫制备的BBMV蛋白的结合的竞争性置换曲线。BBMV 浓度是 0.1Omg 蛋白质 /ml，且 125I CrylAb 是 0.25nM。125I CrylAb 的 100% 百分比特异性结合以缺乏非标记的CrylAb情况下的总体结合减去存在500nM CrylAb的情况下测量的非特异性结合测量。在高到1，OOOnM的浓度(比放射性标记的置换配体的浓度高4，000倍)测试Vip3Abl，并且其不置换125I CrylAb的结合。非放射性标记物在约2nM置换125ICrylAb 达 50%。[0020]序列简述
[0021]SEQ ID NO:1是N端片段CrylAb杀虫蛋白。
[0022]SEQ ID N0:2是全长Vip3Ab蛋白，其在结合研究中使用时经胰蛋白酶加工成核心片段(残基200-788)。
[0023]SEQ ID N0:3是全长CrylAb蛋白，其在结合研究中使用时经胰蛋白酶加工成核心片段(残基29-612) 。
[0024]发明详述
[0025]本发明部分得到如下的发现支持，即Vip3Ab和CrylAb彼此不竞争对来自谷实夜蛾(棉铃虫；CEW)的肠受体的结合。
[0026]本发明包括使用Vip3Ab和CrylAb来保护玉米和其它经济上重要的植物物种免于由CEW进食引起的损伤和产量损失及防止CEW群体形成对任一种这些蛋白质的抗性。
[0027]本发明提供了用于控制鳞翅目害虫的组合物，其包含生成含有CrylAb核心毒素的蛋白质和含有Vip3Ab核心毒素的蛋白质的细胞。
[0028]本发明进一步包含经转化以生成CrylAb杀虫蛋白和Vip3Ab杀虫蛋白两者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。在一些实施方案中，植物细胞是非增殖/非全能细胞。优选地，主题多核苷酸在遗传构建体中在非苏云金芽孢杆菌启动子(与该启动子可操作连接/包含该启动子)的控制下。主题多核苷酸可以包含实现植物中表达增强的植物密码子选择。
[0029]另外，意图本发明提供一种控制鳞翅目害虫的方法，包括使所述害虫或所述害虫的环境与有效量的组合物接触，所述组合物含有含CrylAb核心毒素的蛋白质，并且进一步含有含Vip3Ab核心毒素的蛋白质。
[0030]本发明的一个实施方案包括玉米植物及此类植物的种子，所述玉米包含编码含Vip3Ab核心毒素的蛋白质的植物表达型基因和编码含CrylAb核心毒素的蛋白质的植物表达型基因。
[0031]本发明的又一个实施方案包含玉米植物及此类植物的种子，其中编码含Vip3Ab核心毒素的蛋白质的植物表达型基因和编码含CrylAb核心毒素的蛋白质的植物表达型基因已经渐渗入所述玉米植物中。
[0032]如实施例中描述的，使用经放射性标记的CrylAb的竞争性受体结合研究显示了CrylAb核心毒素蛋白不竞争与Vip3Ab结合的CEW昆虫组织中的结合。这些结果还指示CrylAb和Vip3Ab蛋白的组合是一种减轻CEW群体中对CrylAb形成抗性(及同样地，形成对Vip3Ab的抗性)的有效手段，并且可能会提高表达这两种蛋白质的玉米植物中对此害虫的抗性水平。如此，部分基于本文中描述的数据，认为Vip3Ab和CrylAb蛋白的共生成(叠加)可以用于产生针对CEW的高剂量IRM叠加。
[0033]可以将其它蛋白质添加到此对以扩充昆虫控制谱。另一种部署选项会是与另一种第三毒素/基因组合使用CrylAb和Vip3Ab蛋白，以及使用此三重叠加来减轻CEW中对这些中任一种毒素形成抗性。如此，本发明的另一种部署选项会是在CEW能形成抗性群体的作物生长区中使用两种、三种、或更多种蛋白质。
[0034]因而，本发明还部分涉及三种(或更多种)毒素的三重叠加或“金字塔(pyramid) ”,其中CrylAb和Vip3Ab毒素是基础对。在一些优选的金字塔实施方案中，选定的蛋白质提供针对CEW的非竞争性作用。
[0035]本发明的范围内包括生成蛋白质的任何主题组合的植物(和种植有此类植物的土地面积)。还可以添加其它毒素/基因，但是上文所讨论的特定叠加有利地且令人惊讶地提供针对CEW的多种作用模式。这可以有助于降低或消除对避难所土地面积的需要。如此，本发明内包括如此种植有超过10英亩的田地。
[0036]也可以使用GENBANK来获得本文中公开的或提及的任何基因和蛋白质的序列。
[0037]可以使用本发明中描述的蛋白质组合来控制鳞翅目害虫。成年鳞翅目，例如蝴蝶和蛾主要以花蜜为食，并且是传粉的重要实现物(effector)。几乎所有鳞翅目幼虫，即毛虫以植物为食，并且许多是严重的害虫。毛虫在叶上或内部进食或者以植物的根或茎为食，对植物剥夺营养物，而且经常破坏植物的物理支持结构。另外，毛虫以果实、织物、和贮存的谷物和面粉为食，毁坏出售的这些产品或者严重降低其价值。如本文中所使用的，提及鳞翅目害虫指害虫的各个生命阶段，包括幼虫阶段。
[0038]本发明的一些嵌合毒素包括Bt毒素的完整N端核心毒素部分，并且在超出核心毒素部分末端的某个点处，蛋白质具有向异源原毒素(protoxin)序列的过渡。Bt毒素的N端杀虫活性的毒素部分称为“核心”毒素。自核心毒素区段至异源原毒素区段的过渡可以大致在毒素/原毒素连接处发生或者，在备选中，可以保留天然原毒素的部分(超出核心毒素部分延伸)，其中在下游发生向异源原毒素部分的过渡。
[0039]举例而言，本发明的一个嵌合毒素是CrylAb的完整核心毒素部分(约前600个氨基酸)和异源原毒素(C端分子的剩余部分)。在一个优选的实施方案中，嵌合毒素中包含原毒素的部分源自另一 CrylAb蛋白毒素。
[0040]本领域技术人员会领会，Bt毒素(即使在某个种类诸如CrylA内)在长度和核心毒素部分向原毒素部分过渡的精确位置上会以一定程度有所变化。通常，CrylAb毒素的长度是约1150至约1200个氨基酸。自核心毒素部分至原毒素部分的过渡通常会在全长毒素的约50%-约60%发生。本发明的嵌合毒素会包括整段(full expanse)的此N端核心毒素部分。如此,嵌合毒素会包含CrylAb Bt毒素蛋白的全长的至少约50%。这通常会是至少约590个氨基酸。关于原毒素部分，整段的CrylAb原毒素部分自核心毒素部分末端延伸至分子的C端。
[0041]基因和毒素。依照本发明有用的基因和毒素不仅包括公开的全长序列，而且还包括保留本文中明确例示的毒素的特征性杀虫(pesticidal)活性的这些序列、变体、突变体、和融合蛋白的片段。如本文中所使用的，术语基因的“变体”或“变异”指编码相同毒素或编码具有杀虫活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文中所使用的，术语“等同毒素”指与要求保护的毒素具有相同或基本上相同的针对靶害虫的生物学活性的毒素。
[0042]如本文中所使用的，按照“Revision of the Nomenclature for the Bacillusthuringiensis Pesticidal Crystal Proteins, ^N.Crickmore, D.R.Zeigler, J.Feitelson, E.Schnepf, J.Van Rie, D.Lereclus, J.Baum 和 D.H.Dean.Microbiology andMolecular Biology Reviews (1998)第 62 卷:807-813,边界代表约 95% (CryIAb 和 Vip3Ab)、78%(CrylF和Vip3A)、和45%(Cryl和Vip3)序列同一性。这些截留也可以仅仅应用于核心毒素(对于例如CrylAb)。例如，依照本发明使用的蛋白质可以与本文中例示或明确提出的蛋白质是至少75%，85%, 90%, 95%,或99% (及此范围内的任何整数增量)相同的(氨基酸同一性)。这包括由依照本发明使用的多核苷酸/DNA编码的蛋白质。
[0043]对于本领域技术人员应当显而易见的是，可以经由几种手段鉴定并获得编码活性毒素的基因。可以自保藏于培养物保藏所的分离物获得本文中例示的特定基因或基因部分。也可以例如通过使用基因合成仪以合成方式构建这些基因或其部分或变体。可以使用用于生成点突变的标准技术来容易地构建基因的变异。还有，可以使用商品化的外切核酸酶或内切核酸酶依照标准的规程来生成这些基因的片段。例如，可以使用酶诸如Bal31或定点诱变自这些基因的末端系统性剪断核苷酸。也可以使用多种限制酶来获得编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶来直接获得这些蛋白质毒素的活性片段。
[0044]保留例示的毒素的杀虫活性的片段和等同物会在本发明的范围内。还有，由于遗传密码的冗余，多种不同DNA序列可以编码本文中公开的氨基酸序列。完全在本领域技术人员的技术内的是创建编码相同的，或基本上相同的毒素的这些备选DNA序列。这些变体DNA序列在本发明的范围内。如本文中所使用的，提及“基本上相同的”序列指具有没有实质性影响杀虫活性的氨基酸取代、缺失、添加、或插入的序列。编码保留杀虫活性的蛋白质的基因的片段也包括在此定义中。
[0045]用于鉴定依照本发明有用的编码毒素的基因和基因部分的又一种方法是经由使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列凭借合适的标记物可以是可检出的或者可以以固有荧光生成，如记载于国际申请N0.W093/16094的。如本领域中公知的，若探针分子和核酸样品通过形成两种分子间强烈的键来杂交，则可以合理地假设探针和样品具有实质的同源性。优选地，通过本领域中公知的技术在严格条件下进行杂交，如记载于例如 Kel ler, G.H.，Μ.M.Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y.,第169-170页的。盐浓度和温度组合的一些例子如下(以严格性升高的次序):2X SSPE或SSC于室温；IX SSPE 或 SSC 于 42 °C ;0.1X SSPE 或 SSC 于 42 °C C ;0.1X SSPE 或 SSC 于 65 °C。探针的检测提供了一种用于以已知的方式测定杂交是否已经发生的手段。此类探针分析提供一种用于鉴定本发明的毒素编码基因的快速方法。可以使用DNA合成仪和标准的规程来合成依照本发明作为探针 使用的核苷酸区段。也可以使用这些核苷酸序列作为PCR引物以扩增本发明的基因。
[0046]变体毒素。已经在本文中明确例示本发明的某些毒素。因为这些毒素仅是本发明的毒素例示性的，所以应当容易显而易见的是，本发明包括具有例示毒素的相同或相似杀虫活性的变体或等同毒素(和编码等同毒素的核苷酸序列)。等同毒素与例示的毒素会具有氨基酸同源性。此氨基酸同源性通常会大于75%,优选大于90%,且最优选大于95%。氨基酸同源性在毒素中负责生物学活性或者牵涉决定最终负责生物学活性的三维构型的至关重要的区域中会是最高的。在这点上，某些氨基酸取代是可接受的，并且若这些取代在对于活性不是至关重要的区域中或者是不影响分子的三维构型的保守氨基酸取代，则可以是预期的。例如，氨基酸可以放入以下种类:非极性、不带电荷的极性、碱性、和酸性。其中的一类氨基酸用相同类型的另一种氨基酸替换的保守取代落入本发明的范围内，只要取代不实质性改变化合物的生物学活性。下文是属于每类的氨基酸的例子的列表。
[0047]
【权利要求】
1.一种转基因植物，其包含编码Vip3Ab杀虫蛋白的DNA和编码CrylAb杀虫蛋白的DNA。
2.权利要求1的植物的种子。
3.权利要求1的植物,其中所述DNA渐渗入所述植物中。
4.权利要求3的植物的种子。
5.包含非Bt避难所植物和权利要求1的多个植物的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于40%。
6.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于30%。
7.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于20%。
8.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于10%。
9.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物占所述田地中的所有作物植物的小于5% ο
10.权利要求5的植物田地，其中所述避难所植物在区组或条中(inblocksorstrips)。
11.种子混合物，其包含来自非Bt避难所植物的避难所种子和权利要求2的多个种子，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于40%。
12.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于 30%ο
13.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于 20%ο
14.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于 10% O
15.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占所述混合物中的所有种子的小于5% ο
16.一种管理谷实夜蛾昆虫对源自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白形成抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要求5的植物田地。
17.一种用于控制谷实夜蛾昆虫的组合物，所述组合物包含表达有效量的CrylAb杀虫蛋白和Vip3Ab杀虫蛋白两者的细胞。
18.权利要求17的组合物，其包含经过转化以表达CrylAb杀虫蛋白和Vip3Ab杀虫蛋白两者的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。
19.一种控制谷实夜蛾昆虫的方法，所述方法包括对所述昆虫提供有效量的权利要求17的组合物。
20.权利要求5的田地，其中所述植物占用超过10英亩。
21.权利要求1的植物，其中所述植物选自下组:玉米、大豆、和棉花。
22.权利要求1的植物，其中所述植物是玉米植物。
23.权利要求1、3、21、和22中任一项的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含所述编码所述CrylAb杀虫蛋白的DNA和所述编码所述Vip3Ab杀虫蛋白的DNA,其中所述CrylAb杀虫蛋白与SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO: 3是至少95%相同的，且所述Vip3Ab杀虫蛋白与SEQ ID NO: 2是至少95%相同的。
24.权利要求1、3、21、和22中任一项的植物，其中所述CrylAb杀虫蛋白包含SEQIDN0:1和/或SEQ ID N0:3，且所述Vip3Ab杀虫蛋白包含SEQ ID NO:2。
25.一种植物细胞 ，其包含编码Vip3Ab杀虫蛋白的DNA和编码CrylAb杀虫蛋白的DNA。
【文档编号】C07K14/325GK103533828SQ201180067814
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2011年12月16日 优先权日:2010年12月16日
【发明者】K.E.纳瓦, T.米德, A.T.伍斯利, S.伯顿, N.P.斯托勒, J.J.希茨 申请人:陶氏益农公司