专利名称：Bt杀虫蛋白Cry1Ac-a的表达体系的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种人工合成的Bt杀虫蛋白 Cry I Ac-a的表达体系，包括人工合成的Si杀虫蛋白的基因，含有这种基因的表达载体和该基因表达的产物。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(ifeci77i/5· thur ingiens , Si)杀虫晶体蛋白对农业上许多重要害虫都具有高特异的杀虫活性，但是对人、脊椎动物、植物都完全无害，在自然界中可以被完全降解，因此被广泛用于虫害防治。转Bt作物的应用为害虫防治开辟了新途径，降低了化学杀虫剂的使用量。随着水稻转基因技术研发和转基因品种培育的开展，我国目前培育出了多个转Si基因的水稻品种，这些品种在通过生物安全评价后将被环境释放而推广应用，以满足不断增长的粮食需求。转Bt作物新品种在被大量应用于农业生产前，必须对其进行生物安全性评价，以确保转基因品种的使用安全和环境安全。转基因生物安全评价主要是对转入的异源蛋白释放后产生的影响进行评估，因此进行转基因生物安全评价就必须获得大量与转基因作物表达一致的蛋白。CrylAc蛋白是价杀虫晶体蛋白中的一种,对鳞翅目(Lepidoptera)昆虫具有特异性的高毒杀能力，是目前转基因水稻中普遍使用的的一种杀虫晶体蛋白。转入水稻的 CrylAc蛋白通常经过修饰激活。蛋白质的生物活性表现出与其氨基酸序列的高度相关性， 氨基酸序列决定蛋白质的高级结构，而高级结构是蛋白质生物活性的基础，氨基酸序列的微小差别可能导致生物活性的完全不同，因此，转Si基因品种中的CrylAc蛋白与其在苏云金芽孢杆菌中原始的大小、结构和活性均有差别。本发明之前，CrylAc蛋白的获得一直依赖于进口。进口的高纯CrylAc蛋白价格十分昂贵，而且也与转入水稻中的编码基因产生的杀虫蛋白有差异。而利用苏云金芽孢杆菌提取得到的蛋白与转入水稻的CrylAc蛋白存在结构上的差异，并且作为原毒素，不能在宿主体外表现出生物活性。使用酶切激活后又引入杂蛋白，因此不能够直接利用其进行科学的评价实验。由于杂蛋白的存在需要再次进行分离提纯才能保证蛋白纯度，操作繁琐复杂。除此之外，Bt毒蛋白占植物总可溶性蛋白中的比例很小，从转基因植物体中直接分离难度较大，很难从转基因作物中直接获得足够的该杀虫蛋白。普通的蛋白质原核表达体系由于存在密码子偏好性的问题，也难以得到CrylAc蛋白的高效表达。本发明对CrylAc编码框和编码序列进行了改造和优化，使之能够在大肠杆菌中稳定表达得到CrylAc-a，CrylAc_a与转入水稻中的编码序列表达的杀虫蛋白在氨基酸序列和结构上保持一致。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人工合成的Bt杀虫蛋白CrylAc-a的表达体系，包括人工合成的Si杀虫蛋白的基因，含有这种基因的表达载体和该基因表达的产物，以克服上述技术缺陷，使得该蛋白在大肠杆菌中高表达，高效、低成本获得CrylAc-a蛋白。本发明提供的人工合成的Si杀虫蛋白的基因，是对CrylAc编码框和编码序列进行了改造和优化而获得，即对CrylAc蛋白编码框优化后再进行大肠杆菌密码子偏好优化， 并在5’端和3’端分别引入与表达载体一致的I和^0/ I酶切位点，氨基酸序列末端加入终止密码子TAA而获得。该基因序列见序列表SEQ ID No. 1，记为CrylAc-a。编码表达的的CrylAc-a蛋白氨基酸序列与转入水稻的杀虫蛋白氨基酸序列一致，具有杀虫活性，氨基酸序列见序列表SEQ ID No. 2。改造后的CrylAc-a蛋白由615个氨基酸组成，分子量为68. 7KD，等电点为5. 42。本发明提供的上述基因的表达载体，是将化学合成的上述基因CrylAc-a的DNA 片段通过I和及^7 I双酶切后连接到同样酶切PET43. Ia载体上(pET43. Ia质粒载体可由市售，本实验室保藏)而获得，记为PET43. Ia-Bt0同本发明还提供利用上述含该基因表达载体生产的重组CrylAc-a杀虫蛋白。其方法是将获得的重组载体转入表达宿主BL21菌株中，得到表达菌，记为BL21 (pET43. Ia-Bt), 发酵重组表达菌株，加入IPTG诱导高效表达，即获得有活性的CrylAc-a杀虫蛋白。综上，CrylAc-a蛋白的表达方法,其步骤可归纳如下
(1)CrylAc蛋白的密码子优化,人工合成核酸片段,得到CrylAc-a ；
(2)步骤(I)中CrylAc-a编码序列与所述表达载体的连接，获得重组质粒 pET43. Ia-Bt ；
(3)Cry lAc-a蛋白质粒转化受体菌并诱导表达,获得CrylAc-a蛋白；
(4)Cry lAc-a蛋白的鉴定。本发明的优点和效果在于
一、通过密码子优化的办法，既克服了大肠杆菌密码子偏好的缺点，又显著降低了 mRNA 的二级结构，使蛋白获得高表达。二、成功获得BL21 (pET43. Ia-Bt)表达菌株，并能够通过该表达菌株诱导表达获得与转基因水稻表达的异源蛋白氨基酸序列一致的蛋白，即CrylAc-a杀虫蛋白。
图I.本发明构建的重组表达载体ρΕΤ43· Ia-Bt示意图(在pET43. Ia载体中加入 Cry lAc-a 基因)。图2. pET43. Ia-Bt重组质粒酶切鉴定图谱。其中，1，DNA2000 marker ;2，未酶切质粒；3，Nde I单酶切；4，EcoR I单酶切；5，Nde I + EcoR I双酶切。图3. pET43. Ia-Bt表达菌SDS-PAGE。其中，1，未诱导表达菌体；2，诱导表达后菌体；3，诱导表达破菌上清；4，诱导表达破菌沉淀。
具体实施例方式I、Cry lAc-a核苷酸序列优化、合成与表达重组质粒的构建。在保证杀虫活性的前提下，为促进Cry lAc-a蛋白在大肠杆菌中的表达，对杀虫基因CrylAc编码框和密码子进行改造和优化。按大肠杆菌密码子偏好优化CrylAc-a蛋白基因中的碱基序列，优化后的序列见序列表SEQ ID NO. 1，其序列长度为1857bp，此外还包括起始密码子ATG，终止密码子TAA，以及5’ NdeI和3’ EcoRI酶切位点。将基因片段通过Λ汝I和及I连接到同样酶切处理的pET43. Ia载体中(见附图I)。目的片段两端分别加上了限制性内切酶NdeI、EcoR I的酶切位点，经相应酶切后与载体相连接。酶切体系如表3-1，37°C恒温水浴4小时。酶切体系I
enzymatic system I
权利要求
1.人工合成的Si杀虫蛋白的基因，其特征在于是对CrylAc编码框和编码序列进行改造和优化而获得，即对CrylAc蛋白编码框优化后再进行大肠杆菌密码子偏好优化，并在5’ 端和3’端分别引入与表达载体一致的I和I酶切位点，氨基酸序列末端加入终止密码子TAA而获得；其氨基酸序列为SEQ. ID. No. I所示，记为CrylAc_a ;编码表达的杀虫蛋白氨基酸序列为SEQ. ID. No. 2所示。
2.一种如根据权利要求I所述的人工合成的Si杀虫蛋白的基因的表达载体，其特征在于，是将化学合成的基因CrylAc-a的DNA片段通过I和I双酶切后连接到同样酶切pET43. Ia载体上而获得，记为pET43. Ia-Bt。
3.—种重组CrylAc-a杀虫蛋白，其特征在于由下述步骤获得利用权利要求2所述的表达载体转入表达宿主BL21菌株中，得到表达菌，记为BL21 (pET43. Ia-Bt)，发酵该表达菌，加入IPTG诱导高效表达，即获得有活性的重组CrylAc-a杀虫蛋白。
全文摘要
本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体为一种人工合成的Bt杀虫蛋白Cry1Ac-a的表达体系。该表达体系包括表达载体和Cry1Ac-a蛋白基因片段，所述基因片段根据大肠杆菌密码子偏爱性进行优化而获得，优化后的Cry1Ac-a蛋白由615个氨基酸组成，分子量为68.7KD，等电点为5.42。本发明还包括利用重组菌株经IPTG诱导获得蛋白高效表达的方法。本发明克服了大肠杆菌表达密码子偏好的缺点，显著降低了mRNA的二级结构，使得该蛋白在大肠杆菌中高表达，为高效、低成本获得Cry1Ac-a蛋白提供了切实可行的解决方案。
文档编号C07K14/325GK102586286SQ20121005757
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者冯延叶, 宋志平, 杨忠, 肖满秋, 覃晓萍 申请人:复旦大学