专利名称：一种去除西瓜叶片Rubisco酶干扰，分离剩余低丰度蛋白质的电泳方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域,涉及一种去除植物叶片Rubisco酶干扰,富集和分离剩余低丰度蛋白质的电泳方法，更特别的是涉及一种去除西瓜叶片Rubisco酶干扰，富集和分离剩余低丰度蛋白质的电泳方法。
背景技术：
西瓜是我国重要的经济作物之一，也是世界性重要的水果型蔬菜，研究其抗逆性机理和营养品质功能因子对于西瓜的栽培和生产尤其重要。西瓜叶片蛋白质组学研究能够为西瓜的抗逆性栽培和营养品质分析提供重要的功能信息。蛋白质双向电泳是蛋白质组学研究分离蛋白质最常用的技术手段。然而，西瓜叶片中大约有50%的可溶性蛋白质为核酮糖 I，5_ 二憐酸羧化 / 加氧酶(Ribulose-1, 5-bisphosphate carbox-ylase/oxygenase, Rubisco)，导致西瓜叶片中其他低丰度蛋白质提取不完全或者遮挡和限制了低丰度蛋白质进入二维凝胶和低丰度蛋白质在凝胶上的显现，使得西瓜叶片蛋白质组学研究的质谱鉴定结果大多为Rubisco的大小亚基，妨碍了其他低丰度蛋白质的分离和鉴定，尤其是一些调控因子和信号因子很难或不能被双向电泳分离到，成为困扰西瓜叶片蛋白质组研究的难题。目前，去除叶片Rubisco酶干扰的方法主要有以下四种1)Rubisco免疫耗竭柱 (Immunodepletion columns) (Cellar et al. , 2008)和抗体亲和的方法(Hashimoto and Komatsu, 2007)。这两种方式虽然能够有效地去除植物叶片中的Rubisco酶，但均基于免疫学原理，要求抗体特异性非常强，成本较高，一般实验室无法进行。2)肌醇六磷酸沉淀法 利用肌醇六磷酸与不同浓度的Ca2+结合作为沉淀介质，在高温孵育的条件下去除叶片中的 Rubisco0该方法操作繁琐复杂，且其去除操作需在高温下进行(37°C或42°C)，可能导致其他蛋白质，尤其是一些调控因子和信号因子的降解和损失(Krishnan and Natarajan, 2009 ;李红兵和康振生，2011)。3)高浓度的二硫苏糖醇(DTT)沉淀法(Cho et al. ,2008), 其原理和有效性还有待进一步考察和验证。4)聚乙二醇沉淀法聚乙二醇(PEG)是一种常用的用来沉淀蛋白质的水溶性非离子聚合物，不同浓度的PEG沉淀出来的蛋白质不同，在盐浓度和PH值一定的介质中，与蛋白质的等电点和分子量有关。采用PEG去除植物叶片中Rubisco简便有效，成本低。自Kim et al. (2001)采用不同浓度的PEG对水稻叶片全蛋白进行分馏以除去水稻叶片中Rubisco酶后，15%或16% 的PEG很快就被一些研究者广泛运用在水稻叶片低丰度蛋白质组学研究中(Lee et al.， 2007 ；Lee et al.，2010)。然而，由于采用PEG沉淀蛋白质与蛋白质的分子量和等电点有关，不同植物叶片的Rubisco酶分子量和等电点存在一定的差异(柴常星等，1985)，因此， 采用15%或者16% PEG去除水稻叶片Rubisco酶的方法并不适用于西瓜叶片上。另外,单子叶植物水稻叶片中含有大量的纤维素和木质素，各个组分和含量与西瓜叶片蛋白质组成均不相同，其所用的酚抽法或丙酮沉淀法抽提剩余蛋白质的方法也不是抽提西瓜叶片蛋白质的最佳方案。因此，本发明试图找到一个去除西瓜叶片Rubisco酶的最佳的PEG浓度,能够简便快速的富集剩余的低丰度蛋白质，并创建了一种适合分离西瓜叶片低丰度蛋白质双向电泳的方法，对于西瓜的抗逆性研究和品质育种有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种去除西瓜叶片Rubisco的方法。本发明的另一目的是提供一种去除西瓜叶片Rubisco干扰，分离剩余蛋白质的双向电泳方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种去除西瓜叶片Rubisco的方法利用18% (g/100ml,下同)的PEG-4000去除西瓜叶片中的Rubisco。该方法具体为采集西瓜成熟叶片，置于研磨中，加入液氮研磨至粒径为O. Olmm
0.05mm粉末，迅速转至离心管中，在离心管中按体积比I : 3加入预冷匀浆缓冲液后混匀， 将离心管水平置于冰上孵育10分钟，4°C下于1500g，离心3分钟，弃沉淀，保留上清，4°C下于l，5000g，离心20分钟，弃沉淀，保留上清；在上清液中加入18%的PEG-4000，水平置于冰上孵育20分钟，4°C下于l，5000g，离心25分钟，弃沉淀，保留上清。一种去除西瓜叶片Rubisco干扰，分离剩余蛋白质的方法，先利用18 %的 PEG-4000沉淀西瓜叶片中的Rubisco，再通过双向电泳分离西瓜叶片剩余蛋白质。 该方法优选包括如下步骤A)采集西瓜成熟叶片，置于研磨中，加入液氮研磨至粒径为O. Olmm O. 05mm 粉末，迅速转至离心管中，在离心管中按体积比I : 3加入预冷匀浆缓冲液后混匀，将离心管水平置于冰上孵育10分钟，4°C下于1500g，离心3分钟，弃沉淀，保留上清，4°C下于
1,5000g,离心20分钟,弃沉淀,保留上清；B)在上清液中加入18 %的PEG-4000，水平置于冰上孵育20分钟，4°C下于 l，5000g,离心25分钟,弃沉淀,保留上清；C)在提取的上清中加入10% (v/v)三氯乙酸-丙酮溶液，于-20°C放置过夜，所述的入10% (v/v)三氯乙酸-丙酮溶液中含有O. 07%的β-巯基乙醇；D)取出离心管，4°C下于2，5000g，离心25分钟，弃上清，保留沉淀，加入含O. 07% 的巯基乙醇的丙酮清洗沉淀，于_20°C放置I小时。重复上述洗涤离心操作4次至离心管中蛋白质沉淀发白，无杂色，弃上清，保留沉淀；E)将留有沉淀的离心管置于通风橱中，室温下干燥20-30分钟，得蛋白粉末；F)在含有蛋白粉末的离心管中加入裂解液，室温下放置40-60分钟；G)4°C下于3，000(^，离心30分钟，弃沉淀，保留上清，置于-801保存备用；H)对步骤G所得上清先进行等电聚焦电泳，再进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳；步骤A中所述的匀浆缓冲液为PH 8. 3,0. 5M的Tris-HCl，含2% (v/v)的NP-40， 20mMMgCl2,2% (v/v)的 β-巯基乙醇和 I % (v/v)的 PMSF ;步骤F中所述的裂解液含8M尿素，IM硫脲，2%的CHAPS，65mM DTT, O. 08 % IPG buffer(PH4-7)。
所述等电聚焦电泳中，蛋白质上样量为800ug/18cm胶条，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中采用的染色方法为常规考马斯亮蓝R-250方法。有益效果本发明通过采用不同浓度的PEG-4000去除西瓜叶片Rubisco，发现18% PEG是去除西瓜叶片Rubisco的最佳浓度,一方面,能够最大限度地去除西瓜叶片Rubsico ;另一方面，剩余的蛋白质得到了明显的富集，尤其是低分子量(分子量约为23. 4kDa)的蛋白质在 I-DE和2-DE图谱上均达到了显现和分离的效果。采用18% PEG去除西瓜叶片的Rubisco 后，剩余蛋白质的2-DE图谱上，Rubsico的大小亚基大部分消失,剩余的蛋白点大部分表达量均上调，分离到的蛋白质增加了 48.4%，在分子量小于25. OkDa的区域出现大量新的蛋白点(63±15个)，经反复实验证明，重复性好，图谱清晰，结果可靠。该方法能够大量，快速，有效的去除西瓜叶片中的高丰度的Rub i sCo,使得叶片中其他较低丰度的蛋白质得到富集，达到双向电泳可提取和分离的目的。采用本发明中所述的PEG沉淀Rubisco,分离剩余蛋白质的方法不干扰后续的质谱鉴定分析，有利于西瓜叶片除Rubisco以外的较低丰度蛋白质组学的研究，适用于西瓜叶片较低丰度蛋白质的双向电泳。
图I 为在步骤 I. C 中加入不同浓度 PEG-4000 (O %，10 %，12 %，14%，16 %和 18 % ) 后，西瓜叶片蛋白质的SDS-PAGE图谱图2为西瓜叶片全蛋白(图2A)和18% PEG去除西瓜叶片Rubisco后所得上清 (图2B)按上述步骤提取所得蛋白质的双向电泳图谱。
具体实施例方式下面以西瓜(Citrullus Ianatus Mansfeld)叶片为例，阐明本发明的去除双子叶植物叶片Rubsico,分离剩余蛋白质的双向电泳方法实施例I沉淀西瓜叶片Rubisco的最佳PEG浓度筛选A.取西瓜(Citrullus Ianatus Mansfeld)幼苗成熟叶片2g,置于液氮中快速研磨至精细粉末(粒径约为O. Olmm),用小药匙迅速将粉末转至IOml离心管中，加入7ml预冷匀浆缓冲液，然后在涡旋仪上振动混匀，水平置于冰上孵育10分钟。B.4°C下于1500g，离心3分钟，弃沉淀，保留上清；再于4°C下于l，5000g，离心20
分钟，弃沉淀，保留上清。C.在上清液中加入不同浓度PEG-4000，水平置于冰上孵育20分钟，4°C下于 I, 5000g,离心25分钟,弃沉淀,保留上清。D.将步骤C中所得上清用Brandford法进行蛋白质定量至2ug/ul,加入等体积变性液，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳，筛选出去除Rubisco的最佳PEG浓度为18%。其中，上述变性液组成为pH6. 8 的 Tris-HCl O. Immol · Λ 20 % 甘油(v/v)， 20% SDS(v/v)5% β -巯基乙醇(ν/ν)，0· 01%溴酚蓝。SDS-PAGE浓缩胶浓度5%，分离胶浓度12. 5%，在Bio-Rad公司Mini-PROTAEN System上进行，上样量12ug，电泳设置参数恒压先80V/20min，后140V/40min。电泳结束后采用常规考马斯亮蓝染色法染色(染色液含 R-2500. I % (w/v),甲醇40% (ν/ν),冰醋酸10% (ν/ν),定容后过滤)2h,后用脱色液(甲醇冰醋酸和去离子水体积比为I : I : 8)中脱色，反复脱色至蛋白条带在背景上清晰。 脱色至背景色透明后，用LabScan图像扫描软件扫描得SDS-PAGE电泳图。由图I可知，在步骤I. C中所得上清加入不同浓度PEG-4000后对西瓜叶片全蛋白Rubisco去除效果不同 随着PEG浓度增加，Rubisco大小亚基(LSR和SSR)含量逐渐下降，其余蛋白质条带也逐渐增强，当PEG浓度为16% (g/100ml，下同)和18% (g/100ml，下同)时，大量低丰度蛋白质得到富集，条带明显增强，在分子量25. OkDa和分子量18. 4kDa之间(分子量约23. 2kDa) 甚至出现了新的蛋白条带。然而，16% PEG对Rubisco的去除效果不理想,LSR和SSR仍然明显存在；采用18% PEG时，不仅能有效地去除西瓜叶片Rubisco，LSR和SSR条带均明显减弱，且剩余蛋白质得到明显地富集，条带增强；采用20% PEG会将大量非靶标目的蛋白质也会被去掉(由于加入20% PEG后，剩余蛋白质含量已经非常低，无法进行SDS-PAGE实验， 故数据没有显示)。因此，我们确定18% PEG-4000为去除西瓜叶片Rubisco，富集剩余蛋白质的最佳浓度。实施例2I)沉淀西瓜叶片Rubisco后,剩余蛋白质样品的制备A.重复实施例I步骤A-B，得全蛋白上清，向上清中加入60%的PEG-4000，使得 PEG-4000在溶液中的终浓度达到18%，在涡旋仪上振动混匀，水平置于冰上孵育20分钟， 4°C下于1，5000g，离心25分钟，弃沉淀，保留上清。B.向上清中加入8倍体积的10%的三氯乙酸-丙酮溶液(w/v，含0.07%的β-巯基乙醇)，于_20°C放置过夜。4°C下于2，5000g，离心25分钟，弃上清，保留沉淀。C.向沉淀中加入8ml丙酮(含0. 07%的β -巯基乙醇)清洗沉淀，于_20°C放置 I小时，与B步骤相同条件下离心，弃上清，保留沉淀。D.重复步骤C 3-4次至离心管中蛋白质沉淀发白，无杂色，弃上清，保留沉淀。E.将留有沉淀的离心管置于通风橱中，室温下干燥20-30分钟，得蛋白粉末。F.在含有蛋白粉末的离心管中加入400-500ul裂解液，室温下裂解40_60分钟。G. 4°C下于3，0000g，离心30分钟，弃沉淀，保留上清，置于_80°C保存备用。2)蛋白质定量用Brandford法定量蛋白。3)双向凝胶电泳水化及第一向等电聚焦电泳参照GE Healthcare公司仪器说明进行。蛋白定量后， 取上样水化液 8M 尿素，IM 硫脲，2% 的 CHAPS,0. 08% IPG buffer (PH4-7), 0. Olmg 溴酚蓝， 用前加入65mM 二硫苏糖醇稀释成350ul溶液(含800ug蛋白质)，用Iml移液枪小心吸尽离心管中所有溶液，避免产生气泡，再小心地打入Immobiline DryStrip泡涨盘(美国GE Healthcare)中，避免产生气泡。将预先解冻的pH4_7的18cm的IPG胶条(购自美国GE Healthcare)胶面朝下放在泡涨盘中的溶液上，除去胶面与溶液之间的气泡，使胶面与溶液充分接触润湿，再用5ml矿物油覆盖胶条，室温下(25°C )放置12小时。用镊子夹住IPG胶条的负极端，从Immobiline DryStrip泡涨盘中取出泡涨好的IPG胶条(泡涨好的胶条厚度约为1mm)，用Iml超纯水冲洗IPG胶条的胶面，用滤纸小心吸掉IPG胶条上的超纯水，再将IPG胶条转至等电聚焦仪(Ettan IPGphor III，美国GE Healthcare)的Manifold胶条槽(美国GE Healthcare)上(胶面朝上，正极与IPGphor仪器阳极平台接触，负极与IPGphor仪器阴极接触)，在IPG胶条的正负两端各放置一张预先用125ul超纯水润湿过的电极纸片，分别加上电极。接着进行第一向等电聚焦电泳，具体参数设置如下一步升压，100V/lh，200V/lh， 500V/lh，1000V/lh，逐步升压 10000V/5h，然后 10000V 至累积电压 75000Vhr，最后在 500V 恒压下维持5h。以上操作可选择的方式是蛋白定量后，取上样水化液SM尿素，IM硫脲，2%的 CHAPS, O. 08% IPG buffer (PH4-7)，O. Olmg 溴酚蓝，用前加入 65mM二硫苏糖醇稀释成 350ul 溶液(含800ug蛋白质)，用Iml移液枪小心吸尽离心管中所有溶液，避免产生气泡，再小心地打入18cm的标准胶条槽中，避免产生气泡。将预先解冻的pH4-7的18cm的IPG胶条(购自美国GE Healthcare)胶面朝下放入标准胶条槽中，除去胶面与溶液之间的气泡，使胶面与溶液充分接触润湿，再用2. 5ml矿物油覆盖胶条，进行等电聚焦。等电聚焦参数设置为 50V 水化 12h ;一步升压，100V/lh, 200V/lh, 500V/lh, 1000V/lh ;逐步升压 10000V/5h,然后 10000V至累积电压75000Vhr，最后在500V恒压下维持5h。等电聚焦结束后，胶条依次在平衡液I (6M Urean, 30 %甘油，2 % SDS, 50m molTris-Hcl, PH 8. 8,1 % DTT)和平衡液 II，(6M Urean，30 % 甘油，2 % SDS，50m mo I Tris-HCl, PH 8. 8,2. 5% IAA)中各平衡 15 分钟。第二向SDS-PAGE在美国GE Healthcare公司，Ettan DALTsix垂直电泳仪上进行，封胶琼脂糖浓度为0. 5%，分离胶浓度为12. 5%，在15°C恒温下，设置参数IW/胶条电泳
I.5h，再改成15W/胶条2. 5 3h。4)蛋白染色及凝胶图像分析采用常规考马斯亮蓝R-250染色方法染色(染色液含R-2500. 1% (w/v),甲醇 40% (ν/ν)，冰醋酸10% (ν/ν)，定容后过滤)过夜，然后在脱色液(甲醇冰醋酸和去离子水体积比为I : I : 8)中脱色，反复更换脱色液直至蛋白点在背景上变成清晰。脱色至背景色透明后用LabScan图像扫描软件扫描，采用Imagemaster 2D Platinum6. O软件分析处理图像。本发明采用上述TCA-丙酮沉淀法来抽提西瓜叶片剩余低丰度蛋白质，简化了蛋白质抽提步骤，筛选出一种适合去除西瓜叶片Rubisco酶干扰的最佳PEG浓度。在同样的上样量(800ug)下，西瓜叶片全蛋白(图2A，未加入PEG)的双向电泳图谱上共分离到523± 12 个蛋白点，采用18% PEG沉淀西瓜叶片的Rubisco后,对上清(即剩余的蛋白质)进行双向电泳，共分离到776±24个蛋白点，Rubisco的大小亚基大多消失，大部分蛋白点表达量上调，大量丰度较低的蛋白点在双向电泳图谱上达到可分离的强度，且表达量较高，尤其是分子量较低的蛋白(分子量低于25. OkDa的蛋白，共63±15个)(图2B和表I)。表I采用Imagemaster 6. O对图2所得双向电泳图谱分离到的总蛋白点和差异蛋白点的统计分析
项目全蛋白(个)沉淀Rubsico后的剩余蛋白(个)总蛋白523±12776±24表达量上调的蛋白466±11表达量下调或消失的蛋白47±5新出现的蛋白253±18分子量低于25. OkDa的新蛋白63±1权利要求
1.一种简便、有效、快速去除西瓜叶片Rubisco的方法,其特征在于利用18% (w/v)的 PEG-4000去除西瓜叶片中的Rubisco。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于该方法具体为采集西瓜成熟叶片，置于研磨中，加入液氮研磨至粒径为O. Olmm O. 05mm粉末，迅速转至离心管中，在离心管中按体积比I : 3加入预冷匀浆缓冲液后混匀，将离心管水平置于冰上孵育10分钟，4°C下于 1500g,离心3分钟,弃沉淀,保留上清，4°C下于1，5000g,离心20分钟,弃沉淀,保留上清； 在上清液中加入18%的PEG-4000，水平置于冰上孵育20分钟，4°C下于1，5000g,离心25分钟，弃沉淀，保留上清。
3.—种去除西瓜叶片Rubisco干扰,分离剩余蛋白质的方法,其特征在于先利用18% (w/v)的PEG-4000去除西瓜叶片中的Rubisco,再通过TCA-丙酮沉淀法来抽提剩余蛋白质，最后再利用双向电泳分离西瓜叶片剩余蛋白质。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于该方法包括如下步骤A)采集西瓜成熟叶片，置于研磨中，加入液氮研磨至粒径为O.Olmm O. 05mm粉末，迅速转至离心管中，在离心管中按体积比I : 3加入预冷匀浆缓冲液后混匀，将离心管水平置于冰上孵育10分钟，4°C下于1500g，离心3分钟，弃沉淀，保留上清，4°C下于1，5000g，离心 20分钟,弃沉淀,保留上清；B)在上清液中加入18%的PEG-4000，水平置于冰上孵育20分钟，4°C下于1，5000g，离心25分钟,弃沉淀,保留上清；C)在提取的上清中加入8倍体积的10%(w/v)三氯乙酸-丙酮溶液，于_20°C放置过夜，所述的10% (w/v)三氯乙酸-丙酮溶液中含有O. 07%的β-巯基乙醇；D)取出离心管，4°C下于2，5000g，离心25分钟，弃上清，保留沉淀，加入含8mlO. 07% 的巯基乙醇的丙酮溶液清洗沉淀，于_20°C放置I小时，于4°C下2，5000g，离心25分钟，弃上清，保留沉淀；重复上述洗涤离心操作4次至离心管中蛋白质沉淀发白，无杂色，弃上清，保留沉淀；E)将留有沉淀的离心管置于通风橱中，室温下干燥20-30分钟，得蛋白粉末；F)在含有蛋白粉末的离心管中加入裂解液，室温下放置40-60分钟；G)4°C下于3，OOOOg，离心30分钟，弃沉淀，保留上清，置于_80°C保存备用；H)对步骤G所得上清先进行等电聚焦电泳，再进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。
5.根据权利要求4所述的方法，步骤A中所述的匀浆缓冲液为0.5M的Tris-HCl (pH8.3)，含 2% (v/v)的 NP-40，20mM MgC12,2% (v/v)的 β-巯基乙醇和 1% (ν/ν)的 PMSF。
6.根据权利要求4所述的方法，步骤F中所述的裂解液含SM尿素，IM硫脲，2%的 CHAPS, 65mM DTT，0.08% 的 IPG buffer (pH4_7)。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述等电聚焦电泳中，蛋白质上样量为 800ug/18cm胶条，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶浓度为12. 5 %，采用的染色方法为常规考马斯亮蓝R-250方法。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了一种去除植物叶片Rubisco，富集和分离剩余蛋白质的电泳方法。该方法先利用18％的PEG-4000去除西瓜叶片中的Rubisco，再通过TCA-丙酮沉淀法抽提剩余蛋白质，进行双向电泳分离西瓜叶片剩余蛋白质。与全蛋白质双向电泳图谱相比，采用18％PEG沉淀西瓜叶片Rubsico后，Rubsico的大小亚基大部分消失，剩余的蛋白点大部分表达量均上调，分离到的蛋白质增加了48.4％，在分子量小于25.0kDa的区域出现大量新的蛋白点(63±15个)，经反复实验证明，重复性好，图谱清晰，结果可靠。
文档编号C07K1/28GK102584972SQ201210058590
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者严蓓, 何立中, 孙锦, 李斌, 郭世荣, 阳燕娟 申请人:南京农业大学