专利名称：一种脱氧河鲀毒素的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种脱氧河飩毒素的提取方法，属于海洋生物技术领域。
背景技术：
河飩毒素(tetrodotoxin，TTX)是从河飩鱼的内脏中提取出的一种毒性极强的非蛋白物质之一，具有独特的化学结构和药理性质，是一种著名的神经毒素；其毒性比氰化纳高1250倍。现代医学研究表明，河飩毒素还广泛存在于虾虎鱼、蝾螈、章鱼、贝类、螺类、海星、蟹类等海洋生物体内。河飩毒素的结晶是一种氨基氢化喹唑啉类型化合物，分子式为C11H17N3O8,分子量为3 19. 27。这种令人生畏的毒素，只需O. 3mg-0. 5mg就可致人于死地，因为它能专一地阻断神经细胞膜Na+通道，所以，河飩毒素具有镇痛、戒毒、镇痉、镇痒、局麻等功效。多年来，河飩毒素研发一直备受国内外科学家的密切关注。脱氧河飩毒素(deoxytetrodotoxin，deoxyTTX)是河飩毒素的衍生物，是一种氨基全氢喹唑啉型化合物，主要应用于神经生物学、生理学、药理学和其他科学研究。deoxyTTX与TTX在一般情况下同时存在于同一生物体中，都广泛存在于河飩鱼、虾虎鱼、螺类、蓝环章鱼、蟹类、海星、海生陆产的两栖类、软体动物和节肢动物等海洋生物体内，并且，主要存在于河飩鱼的卵巢、肝脏、皮肤和肠胃中。其中，deoxyTTX虽然分布于多种生物中，但是，在天然生物体中，deoxyTTX含量极微，在粗品TTX所含的多种衍生物中，deoxyTTX的含量也是非常少。而且，deoxyTTX与TTX所含的多种衍生物的分子量、分子结构、理化性质非常接近，因此，要单一提取deoxyTTX非常困难。目前，关于deoxyTTX的制取方法，尚未见有报道。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种脱氧河飩毒素的提取方法，该方法是在河飩毒素的废弃母液中提取脱氧河飩毒素；主要使用醇醚扩散法纯化河飩毒素，不仅可提高河飩毒素的纯度，同时可使脱氧河飩毒素聚集于母液中，以该母液为原料，通过色谱分离和层析脱盐方法处理后，达到提取脱氧河飩毒素的目的；该制备方法工艺简单，生产成本低，容易实施，同时可使精制河飩毒素后的废弃母液得到了充分的利用。为了达到上述目的，一种脱氧河飩毒素提取方法按下列步骤提取的一、制备河飩毒素母液先将粗品河飩毒素置于玻璃烧杯中，加浓度为7% -15%的醋酸溶解，得到“A”溶液，在“A”溶液中加入剂量为“A”溶液量1-10倍的无水乙醇，搅拌均勻，溶解后得到“B”溶液，将“B”溶液通过离心机分离，除去其中的不溶物，得到河飩毒素上清液；将河飩毒素上清液倒入烧杯后，移到密闭容器中，然后在密闭容器内放置一杯乙醚溶液，将密闭容器内的温度控制在10°C _35°C;当乙醚向河飩毒素-醋酸-乙醇-水溶液扩散后，经过10-60小时的反应，即可析出河飩毒素结晶，得到母液“C” ；二、高效液相色谱分离
将母液“C”真空加热浓缩后，加入氨水将母液“C”pH值调节至7. 5-10后，析出沉淀物，将此沉淀物通过水洗、真空冷冻干燥处理后，即可获得白色的含脱氧河飩毒素沉淀物；将此白色的含脱氧河飩毒素沉淀物加入浓度为20% -30%的醋酸或磷酸溶解，得到“D”溶液；使用高效制备液相色谱仪对“D”溶液进行液相色谱分离，色谱条件C18反相柱；流动相为含有lmmol/L-15mmol/L离子对试剂的O. 05mol/L-0. 5mol/L缓冲液和O. 5% -5%甲醇，其流动相的流速为6mL/min-15mL/min ;使用示差折光检测器或紫外检测器进行检测；在高效液相色谱分离过程中，按出峰图谱可收集到脱氧河飩毒素的馏分；
三、层析脱盐处理将上述脱氧河飩毒素馏分，缓慢加入装有生物凝胶或酸性阳离子树脂的层析柱中，再用浓度为3% -20%的醋酸溶液进行洗脱，收集pH值为4-7的馏分；然后使用氨水将此馏分的PH值调节至7. 5-10，即可析出白色固体；将白色固体经过水洗和真空冷冻干燥处理后，即可得到纯度较高的脱氧河飩毒素结晶。所述的离子对试剂包括辛烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、己烷磺酸钠、戊烷磺酸钠。所述的缓冲液可使用磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。所述的流动相的pH值为5-7。脱氧河飩毒素的具体提取方法(试验例)一、制备河飩毒素母液取粗品TTX 800mg，置于玻璃烧杯中，用12mL浓度为15%的醋酸溶解，得到“A”溶液，在“A”溶液中加入50mL无水乙醇，搅拌均匀，溶解后得到“B”溶液，将“B”溶液通过离心机分离，除去其中的不溶物，得到河飩毒素上清液；将河飩毒素上清液倒入烧杯后，移到密闭容器中，然后在密闭容器内放置一杯乙醚溶液，将密闭容器内的温度控制在28°C，由于乙醚溶液的挥发性极强，瓶内的乙醚溶液会自然挥发扩散，当乙醚的挥发物与河飩毒素上清液相溶后，经过36小时的反应；即可析出河飩毒素结晶，并得到母液“C” ；二、高效液相色谱分离将母液“C”真空加热浓缩后，加入氨水将母液“C”pH值调节至8. 5后，析出沉淀物，将沉淀物通过水洗、真空冷冻干燥处理后，即可获得白色的含脱氧河飩毒素沉淀物；将此沉淀物加入浓度为15%的醋酸溶解，得到“D”溶液；使用高效制备液相色谱仪对“D”溶液进行液相色谱分离，色谱条件C18反相柱(20mmX250mm);流动相为含有2mmol/L-10mmol/L庚烷磺酸钠的O. 08mol/L磷酸盐缓冲液和O. 8%的甲醇，其流动相的流速为10mL/min ;使用示差折光检测器进行检测；在高效液相色谱分离过程中，按出峰图谱可收集到脱氧河飩毒素的懼分250mL ；三、层析脱盐处理将上述脱氧河飩毒素馏分250mL，缓慢加入装有酸性阳离子树脂的层析柱中(20mmX 400mm)，再用浓度为10%的醋酸溶液进行洗脱，收集pH值为4_7的馏分；然后使用氨水将此馏分的pH值调节至9. O,即可析出白色固体；将白色固体经过水洗和真空冷冻干燥处理后，即可得到纯度较高的脱氧河飩毒素结晶llmg。本发明脱氧河飩毒素的样品鉴定结论将上述脱氧河飩毒素结晶样品经中国科学院化学研究所作质谱(SIMS)测定和美国斯坦福大学化学系作核磁共振光谱(1H-NMR)测定。
测定结果ll_deoxyTTX的分子式和结构如下分子式=C11H17O7N3分子量303.11结构式
权利要求
1.ー种脱氧河飩毒素的提取方法，其特征包括以下步骤 一、制备河飩毒素母液 先将粗品河飩毒素置于玻璃烧杯中，加浓度为7% -15%的醋酸溶解，得到“A”溶液，在“A”溶液中加入剂量为“A”溶液量1-10倍的无水こ醇，搅拌均匀，溶解后得到“B”溶液，将“B”溶液通过离心机分离，除去其中的不溶物，得到河飩毒素上清液；将河飩毒素上清液倒入烧杯后，移到密闭容器中，然后在密闭容器内放置一杯こ醚溶液，将密闭容器内的温度控制在10°C -35 °C ；当こ醚向河飩毒素-醋酸-こ醇-水溶液扩散后，经过10-60小时的反应，即可析出河飩毒素结晶，得到母液“C” ； ニ、高效液相色谱分离 将母液“C”真空加热浓缩后，加入氨水将母液“C”pH值调节至7. 5-10后，析出沉淀物，将此沉淀物通过水洗、真空冷冻干燥处理后，即可获得白色的含脱氧河飩毒素沉淀物；将此白色的含脱氧河飩毒素沉淀物加入浓度为20% -30%的醋酸或磷酸溶解，得到“D”溶液；使用高效制备液相色谱仪对“D”溶液进行液相色谱分离，色谱条件C18反相柱；流动相为含有lmmol/L-15mmol/L离子对试剂的O. 05mol/L-0. 5mol/L缓冲液和O. 5% -5%甲醇，其流动相的流速为6mL/min-15mL/min ;使用示差折光检测器或紫外检测器进行检测；在高效液相色谱分离过程中，按出峰图谱可收集到脱氧河飩毒素的馏分； 三、层析脱盐处理 将上述脱氧河飩毒素馏分，缓慢加入装有生物凝胶或酸性阳离子树脂的层析柱中，再用浓度为3% -20%的醋酸溶液进行洗脱，收集pH值为4-7的馏分；然后使用氨水将此馏分的PH值调节至7. 5-10，即可析出白色固体；将白色固体经过水洗和真空冷冻干燥处理后，即可得到纯度较高的脱氧河飩毒素結晶。
2.根据权利要求I所述的ー种脱氧河飩毒素的提取方法，其特征在于所述的第二步骤中的离子对试剂，主要包括辛烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、己烷磺酸钠和戊烷磺酸钠。
3.根据权利要求I所述的ー种脱氧河飩毒素的提取方法，其特征在于所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。
全文摘要
一种脱氧河鲀毒素的提取方法，先将粗品河鲀毒素用醋酸溶解，并加入无水乙醇搅拌均匀，离心除去其中的不溶物，得到河鲀毒素上清液，将上清液在装有乙醚的密闭容器中加温，析出河鲀毒素结晶，并得到母液；将上述母液浓缩后，加入氨水调节pH值，析出沉淀物，将此沉淀物通过处理后，即可获得含脱氧河鲀毒素沉淀物；将此沉淀物加入醋酸或磷酸溶解，使用高效制备液相色谱仪对其进行液相色谱分离，使用示差折光检测器或紫外检测器进行检测，按出峰图谱可收集到脱氧河鲀毒素的馏分；将上述馏分，加入层析柱中，用醋酸溶液进行洗脱，收集馏分；然后使用氨水调节此馏分的pH值即可析出白色固体将白色固体，经过处理后，即可得到脱氧河鲀毒素结晶。
文档编号C07D491/22GK102627652SQ20121007128
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者冯子龙, 吴新民, 赵振良, 赵海涛, 郝志毅, 黄海枫, 黄致强 申请人:河北省海洋与水产科学研究院