专利名称：具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乳清蛋白肽与糖进行美拉德反应的改性方法，具体的说，本发明涉及一种具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽及其制备方法和应用。本发明属于食品添加剂领域
背景技术：
蛋白通过与糖进行美拉德反应可以改善蛋白的许多功能性，如水溶性，热稳定性、乳化性、抗氧化性等，可以应用于食品添加剂、保健品、药物载体等领域。但使用蛋白多肽进行美拉德反应的研究比较少见。乳清蛋白本身就具有一定的抗氧化作用，而水解后的乳清蛋白肽抗氧化效果得到了提升，目前已有关于乳清蛋白水解物在铁催化卵磷脂脂质氧化体系、铜催化脂质氧化体系中抗氧化作用的研究；还有利用乳清蛋白、α-乳白蛋白和β_乳球蛋白制备抗氧化肽，及将乳清水解物应用于煮制的猪肉馅饼中减少冷藏过程中脂类氧化的报道。既然蛋白的糖基化反应与蛋白的水解反应都有提升抗氧化效果，那么将二者有机的结合，就会制备出高效的抗氧化产品。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种制备具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽的方法；本发明的目的之二在于提供一种由本发明方法制备得到的具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽；本发明的目的之三在于提供本发明的具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽在制备抗氧化剂中的应用。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明的一种制备抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽的方法，其特征在于包括以下步骤(I)将乳清蛋白溶液进行热处理；(2)热处理后的乳清蛋白溶液降温后加入碱性蛋白酶进行水解反应；(3)水解反应产物经灭酶，加入糖加热进行糖基化反应；(4)冷却，离心取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得。在本发明中，优选的，步骤(I)中所述的乳清蛋白溶液的浓度为2-10% (w/w)，优选为5% (w/w);所述的热处理为将乳清蛋白溶液在90-98°C温度下处理3-8分钟；更优选的，将乳清蛋白溶液在95°C温度下处理5分钟，然后冷却。在本发明中，优选的，步骤(2)中所加入的碱性蛋白酶的体积与乳清蛋白底物的重量比为(I 3) 100，也就是相当于每IOOg的乳清蛋白底物所需要的碱性蛋白酶的体积为l-3mL,优选为2mL。在本发明的一个具体实施例中，所采用的乳清蛋白溶液的质量浓度为5% (w/w),如果乳清蛋白溶液的总重量为lOOOg，则其中所含有的乳清蛋白底物为50g，按照所加入的碱性蛋白酶的体积与乳清蛋白底物的重量比为2 100计算，应加入碱性蛋白酶的体积为Imlo其中，碱性蛋白的酶活力为1-20万U/g。碱性蛋白酶是经细菌原生质体诱变方法造育的2709枯草杆微生物通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，属于一种丝氨酸胞外高碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。主要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300Da。在本发明中，优选的，步骤(2)中所述的水解反应在以下条件下进行水解反应温 度为50-60°C，pH值为8. 0-9. 0，水解反应时间为4_6小时；更优选的，在以下条件进行水解反应水解反应温度为65°C，pH值为8. 5，水解反应时间为5小时。本发明通过试验发现，采用此水解条件进行水解反应，水解度(DH)可以达到35. 30%。在本发明中，优选的，步骤(3)中所述的糖基化反应在以下条件下进行pH值8. O 9. 0，水解得到的多肽混合液加入糖，使加入的糖的终浓度为6 10% (w/w)，在50 90°C温度下搅拌加热3 5小时，其中，所述的糖优选为葡萄糖。在本发明中，优选的，步骤(4)中所述的离心步骤所采用的离心力为1000 1200 X g，离心的时间为10 15min。在本发明中，优选的，还包括在糖基化反应结束后，冷却，离心之前将糖基化的产物进一步进行分离，得到分子量在800-5000Da之间的多肽混合物，得到的混合物再经过冷却，离心取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得。优选的，所述的将糖基化的产物进一步进行分离，采用的是超滤的方法，优选采用中空纤维膜进行，膜孔径分别为800Da、5000Da，超滤的温度为20°C，压力为O. IMPa0采用中空纤维超滤膜对糖基化产物进行分离，所得到的产物主要含有分子量为800-5000Da的糖基化乳清蛋白多肽，具有高的抗氧化活性和清除自由基的能力。本发明还提供了由本发明所述的方法制备得到的糖基化乳清蛋白多肽，优选的，所述的糖基化乳清蛋白多肽主要由分子量在800-5000Da之间的混合糖基化乳清蛋白多肽组成。进一步的，本发明还提供了所述的糖基化乳清蛋白多肽在制备抗氧化剂中的应用。实验证明，本发明所述的糖基化乳清蛋白多肽，其抗氧化活性稳定，在加热温度为50-95°C、pH值为4-8、光照以及防腐剂(苯甲酸钠)的作用下都能够保持非常稳定的抗氧化活性。与现有技术相比，本发明的制备方法操作简单，与其他合成抗氧化剂相比安全可靠，适合工业化生产，能够大幅度提高乳清蛋白资源的利用率，提高乳清综合利用的水平。所制备的糖基化乳清蛋白抗氧化肽抗氧化活性高，稳定性强。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实验材料购买来源碱性蛋白酶购自西安沃尔森生物技术有限公司；产品编号E⑶063，酶活力1-20万 U/g ；乳清蛋白购买自美国Hilmar公司；产品编号9410乳清分离蛋白，蛋白含量92. 8%。
中空纤维膜为美国FS-TFC流体膜实施例I乳清蛋白溶液浓度为5% (w/w)，在95°C，5min的热处理之后，降到60°C温度，加入碱性蛋白酶进行水解，所加入的碱性蛋白酶的体积与乳清蛋白底物的重量比为2 100，也就是相当于每IOOg的乳清蛋白底物所需要的碱性蛋白酶的体积为2mL，在温度为60°C、pH值为8. 5的条件下，水解5h(经检测，水解度(DH)达到了 35. 30% );将水解产物经煮沸灭酶，再加入葡萄糖，使加入的葡萄糖的终浓度达到8% (w/w)，在90°C下搅拌加热3h，反应后迅速降温，经1200Xg离心lOmin，除去沉淀，上清液浓缩，冷冻干燥，即得。实施例2乳清蛋白溶液浓度为2% (w/w)，在90°C，8min的热处理之后，降到60°C温度，力口入碱性蛋白酶进行水解，所加入的碱性蛋白酶的体积与乳清蛋白底物的重量比为2 100，也就是相当于每IOOg的乳清蛋白底物所需要的碱性蛋白酶的体积为2mL，在温度为50°C、pH值为8. O的条件下，水解4h ;将水解产物经煮沸灭酶，再加入葡萄糖，使加入的葡萄糖的终浓度达到6% (w/w),在60°C下搅拌加热4h,反应后迅速降温,经IOOOXg离心15min,除去沉淀，上清液浓缩，冷冻干燥，即得。实施例3乳清蛋白溶液浓度为5% (w/w)，在95°C，5min的热处理之后，降到60°C温度，加入碱性蛋白酶进行水解，所加入的碱性蛋白酶的体积与乳清蛋白底物的重量比为2 100，也就是相当于每IOOg的乳清蛋白底物所需要的碱性蛋白酶的体积为2mL，在60°C温度、pH值8. 5的条件下，水解5h(经检测，水解度(DH)达到了 35. 30% );将水解产物经煮沸灭酶，再加入葡萄糖，使加入的葡萄糖的终浓度达到8% (w/V)，90°C下搅拌加热3h，反应后迅速降温，经1200 Xg离心15min，除去沉淀，上清液经过超滤再进行冷冻干燥而制成，超滤采用中空纤维膜进行，膜孔径分别为800Da、5000Da，超滤的温度为20°C，压力为0. IMPa0得到主要含有分子量为800-5000Da之间的糖基化乳清蛋白多肽的混合物。实施例4乳清蛋白溶液浓度为10% (w/w)，在98°C，8min的热处理之后，降到60°C温度，力口入碱性蛋白酶进行水解，所加入的碱性蛋白酶的体积与乳清蛋白底物的重量比为3 100，也就是相当于每IOOg的乳清蛋白所需要的碱性蛋白酶的体积为3mL，在60°C温度、pH值9.0的条件下，水解6h ;将水解产物经煮沸灭酶，再加入葡萄糖，使加入的葡萄糖的终浓度达到10% (w/w), 75°C下搅拌加热4h,反应后迅速降温,经1000 Xg离心15min,除去沉淀，上清液经过超滤再进行冷冻干燥而制成，超滤采用中空纤维膜进行，膜孔径分别为800Da、5000Da，超滤的温度为20°C，压力为O. IMPa0得到主要含有分子量为800_5000Da之间的糖
基化乳清蛋白多肽的混合物。试验例I本发明糖基化乳清蛋白多肽的抗氧化活性试验I、供试样品实施例I和实施例3所制备的糖基化乳清蛋白多肽；2、试验方法及结果抗氧化活性在卵磷脂脂质氧化体系(简称Lipsome氧化体系)中进行，Lipsome氧化体系配制方法为称取O. 89472g氯化钾，O. 0776g组氨酸，加水稀释到IOOmL,调其pH值到6. 8，再取纯度20 %的大豆卵磷脂Ig溶于氯化钾-组氨酸缓冲溶液中，制成2mg/mL的脂质体。进行抗氧化试验时取稀释10倍的脂质体5mL，加入样品lmL，以及加入O. ImL50mm Fecl3溶液和O. ImL IOmm抗坏血酸盐溶液，37°C水浴lh，糖基化乳清蛋白抗氧化肽的TBARS (硫代巴比妥酸值)2. 03mg/L,与乳清蛋白相比降低40-50%，与水解后的乳清蛋白肽相比降低10-20% ;还原能力(FRAP值)1873μπι0Ιν1，与乳清蛋白相比提高了 6_8倍，与水解后的乳清蛋白肽相比提高了 2-3倍；对ABTS自由基的清除率84. 23%，与乳清蛋白相比提高7-8倍，与水解后的乳清蛋白肽相比提高了 3-4倍；羟基清除率59. 31%，与乳清蛋白相比提高8-10倍，与水解后的乳清蛋白肽相比提高了 4-5倍。将所得到的糖基化乳清蛋白抗氧化肽经过中空纤维超滤膜分为分子量分布范围不同的三段0. 8KDa以下，O. 8-5KDa，5KDa以上。其中O. 8_5KDa效果最好，TBARS(硫代巴比妥酸值)1.86 (mg/L);还原能力(FRAP值)2118 μ moL/L J^ABTS自由基的清除率99. 08%;羟基清除率66. 23%, Cu2+螯合能力达88. 28%, Fe2+螯合能力达41.47%.试验例2本发明糖基化乳清蛋白多肽的抗氧化活性稳定试验供试样品实施例1-4所制备的糖基化乳清蛋白多肽； 在加热温度为50_95°C、pH值为4-8、光照以及防腐剂(苯甲酸钠)的作用下测定抗氧化活性(还原能力FRAP值，对ABTS自由基的清除率)。结果表明糖基化乳清蛋白多肽在以上条件变化下，抗氧化活性变化极小，仍然具有较强的抗氧化活性。
权利要求
1.一种制备具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)将乳清蛋白溶液进行热处理； (2)热处理后的乳清蛋白溶液降温后加入碱性蛋白酶进行水解反应； (3)水解反应产物经灭酶后，加入糖，加热，进行糖基化反应； (4)冷却，离心取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得。
2.按照权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述的乳清蛋白溶液的浓度为2-10% (w/w)，优选为5% (w/w);所述的热处理为将乳清蛋白溶液在90-98°C温度下处理3-8分钟；优选的，将乳清蛋白溶液在95°C温度下处理5分钟，然后冷却。
3.按照权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)中所加入的碱性蛋白酶的体积与乳清蛋白底物的重量比为(I 3) 100，即每IOOg的乳清蛋白底物所需要的碱性蛋白酶的体积为l_3ml，优选为2ml。
4.按照权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的水解反应在以下条件下进行水解反应温度为50-60°C，pH值为8. 0-9. 0，水解反应时间为4_6小时；优选的，在以下条件进行水解反应水解反应温度为65°C，pH值为8. 5，水解反应时间为5小时。
5.按照权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的糖基化反应在以下条件下进行pH值8. O 9. 0，水解得到的多肽混合液加入糖，使加入的糖的终浓度为6 10% (w/w),在50 90°C温度下搅拌加热3 5小时,其中，所述的糖为葡萄糖。
6.按照权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述的离心步骤所采用的离心力为1000 1200 X g，离心的时间为10 15min。
7.按照权利要求I所述的方法，其特征在于还包括在糖基化反应结束后，将糖基化的产物进一步进行分离，得到分子量在800-5000Da之间的多肽混合物。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于所述的将糖基化的产物进一步进行分离，采用的是超滤的方法，优选采用中空纤维膜进行，膜孔径分别为800Da、5000Da，超滤的温度为20°C，压力为O. IMPa0
9.由权利要求1-8任一项所述的方法所制备得到的糖基化乳清蛋白多肽，优选的，所述的糖基化乳清蛋白多肽主要由分子量在800-5000Da之间的混合糖基化乳清蛋白多肽组成。
10.权利要求9所述的糖基化乳清蛋白多肽在制备抗氧化剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白多肽及其制备方法和应用。本发明的一种制备具有抗氧化活性的糖基化乳清蛋白抗氧化肽的方法，是将乳清蛋白先通过碱性蛋白酶水解为蛋白肽后，经煮沸灭活酶活力、冷却、再与糖混合一定温度搅拌加热，进行美拉德反应一定时间后迅速降温、离心除去沉淀，上清液可直接进行冷冻干燥，或经过超滤再进行冷冻干燥。按照本发明的方法制备得到的糖基化乳清蛋白多肽，其具有较强的抗氧化作用，较许多天然抗氧化剂稳定性强，并且使用的原料均为可食用的食品，所以安全性高。
文档编号C07K1/107GK102628073SQ20121008571
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者刁新平, 孔保华, 孙常雁, 孙瑶 申请人:东北农业大学