专利名称：一种呈味肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种呈味肽及其制备方法和在食品领域的应用。
背景技术：
食品中存在许多呈味物质(例如甜味物质、鲜味物质、咸味物质、酸味物质等)，这些物质一般为游离氨基酸、肽、呈味核苷酸、无机盐等。在肉及肉制品中呈味物质以游离氨基酸和肽占有较重要的角色，这是由人类的味觉受体——味蕾与呈味物质的结构和性质所决定的。氨基酸和肽中的氨基和羧基两性基团具有缓冲能力，使得其具有复杂的呈味功能， 能同时参与并影响食品的滋味的形成，能提高食品的总体风味，改进食品的质构，使食品的总体味感协调、细腻、醇厚浓郁。这些年来，科研工作者们都尝试着从各式各样的美味食物中分离提取起关键作用的呈味肽(也称风味增强肽、美味肽等)，其具有良好的加工特性、营养功能和生理活性，并且对食品的滋味具有很大的影响，可以用于食品佐料，例如可以用作调味品或香精香料的
重要基料。Yamasaki 等人(A peptide with delicious taste.Agricultural and Biological Chemistry. 1978，42，1761-1765.)在 1978 年的研究表明某些肽可以使食物变得更加美味，并首次从木瓜蛋白酶处理的牛肉中分离出了具有“鲜美的”味道牛肉辛肽。随后，又有研究者们采用凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱、串联质谱等分离纯化技术并结合滋味稀释分析方法和电子舌测定方法，从奶酪，豆浆，酪蛋白、大豆蛋白、鸡蛋白质酶解物，乳蛋白酶解物和火腿酶解物中分离并鉴定出大量的呈味肽(例如 Glu-Glu、Glu-Val、Ala-Asp-Glu、Ala_Glu_Asp、Asp_Glu_Glu、Ser-Pro_Glu、Glu_Glu_Asn、 Leu-Ser-Glu-Arg-Tyr-Pro等)。然而，从食物中分离纯化后获得的物质大多都为含有多种呈味肽的混合物。目前与食品滋味较相关的单一组分呈味肽，已弄清结构和性质的仅有少数几种， 诸如谷胱甘肽(三肽)，肌肽、鹅肌肽、蛇肉肽(二肽)，这些小肽的pH值在中性附近，具有很强的缓冲能力(通常认为味道变浓与这种缓冲能力有关)。然而凭借目前的分离提取技术，加之肽在不同条件下性质不稳定和氨基酸序列测定的难度，我们难以从食物中分离获得高纯度的单一组分呈味肽。众所周知,河豚鱼(也称河飩)鱼肉质细嫩、鲜美,但是河豚鱼体内含有剧毒的神经毒素，食用极不安全，因此至今未在我国开放。如果能够提取河豚鱼肉中的关键呈味物质或者能够模拟其滋味特征，那么就可以让消费者在完全安全的情况下享受河豚鱼鲜美的味道。邓婕春等人(红鳍东方飩食用口感及风味差异研究.食品学院，上海上海海洋大学，2009 58.)的研究表明，红鳍东方豚肉的呈味物质的人工合成液(其主要成分为游离氨基酸、呈味核苷酸、无机盐)与豚肉的天然抽提液的滋味特征相似程度较小，这三大成分不足以模拟红旗东方飩水溶性呈味物质的滋味特征，由此判断，红鳍东方豚肉的滋味除了跟游离氨基酸、呈味核苷酸和无机盐有关外，还可能受呈味肽(尤其是低聚肽)影响较大。到目前为止，对河豚中呈味物质的报道主要集中在游离氨基酸、呈味核苷酸(例如ATP及其关联物)、无机盐离子上，对构成河豚鱼肉鲜美浓郁的重要滋味物质一呈味肽的研究，国内外都还未见相关报道。
发明内容
本发明一方面提供了一种呈味肽，其具有SEQ ID No 1的氨基酸序列或者具有通过在SEQ ID No 1氨基酸序列中缺失、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列。在本发明的一个具体实施方案中，所述的呈味肽具有SEQ ID No :1的氨基酸序列。 优选的，该呈味肽有鲜味和甜味的滋味特征。更优选的，该呈味肽具有河豚肉质的或类似河豚肉质的滋味特征。所述的鲜味、甜味为风味物质技术领域的技术人员所熟知的滋味特征技术术语。所述的河豚肉质的滋味特征为风味物质技术领域的技术人员所熟知的常规滋味特征。众所周知，自然产生的蛋白质或多肽可能发生突变，例如，多肽的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或替换，这通常是由于编码该多肽的DNA的多态性或突变，或者由于体内或合成后多肽的修饰。当然，也可以人为地方式修改多肽的氨基酸序列，引入突变，但是，如果这些突变对多肽的活性或结构的保留影响不大的话，那么这些突变后获得的多肽仍具有无突变多肽实质相同或接近的生物活性。因此，只要其具有呈味功能，具有通过在SEQ ID No 1氨基酸序列中缺失、插入和 /或替换一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列的多肽仍然包括在本发明之内。在本发明的另一个具体实施方案中，所述呈味肽具有通过在SEQ ID No:l氨基酸序列中缺失、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列。优选的，该呈味肽有鲜味和甜味的滋味特征。更优选的，该呈味肽具有河豚肉质的滋味特征。在本发明的一个具体实施方案中，所述的呈味肽来源于暗纹东方飩的肌肉。本发明另一方面提供了上述呈味肽的制备方法，所述的呈味肽为人工合成或者从暗纹东方飩体内提取。在本发明的一个具体实施方案中，上述呈味肽的制备方法包括以下步骤，首先从暗纹东方飩肌肉中提取水溶性成分，再对该水溶性成分进行超滤，再对超滤组分进行进一步分离纯化。在本发明的一个具体实施方式
中，对超滤组分进行层析后，选择鲜味和甜味最强的组分(人工感官评定和电子舌分析系统测定)，优选的，采用Sephadex G_15凝胶色谱方法进行层析。在本发明的一个具体实施方式
中，对层析后选择的鲜味和甜味最强组分进行进一步层析分离，再选择其中鲜味和甜味最强的组分(人工感官评定和电子舌分析系统测定)进行成分鉴定，优选的，采用RP-HPLC方法进行层析。在呈味物质技术领域，鉴定呈味物质的呈味/滋味特征通常采用人工感官评定结合电子舌对呈味的呈味特性进行评价，使得结果更准确、更客观。人工感官评定是采用滋味稀释分析方法(TDA)评定出每个样品的稀释因子即TD 值，值越大到则表明样品的滋味特性越强。TD值得测定将待测组分溶解于ImL水中，按 I I (体积比)将其稀释，每个稀释水平溶液采用3点测定进行评定，当某个稀释水平的溶液与2个空白(饮用水)之间的滋味差异刚好能被识别出来，那么这个稀释倍数即为TD值。在利用电子舌分析系统测定物质的呈味特征时，通常采用一些业内公认的标准品作为对照，例如鉴定甜味的标准品为40mM的蔗糖溶液，鉴定咸味的标准品为12mM的NaCl 溶液，鉴定酸味的标准品为IOmM的柠檬酸溶液，鉴定鲜味的标准品为4mM的谷氨酸钠溶液。 最终以待测样品与标准品之间的距离远近来判断待测样品的滋味特征强度。本发明还提供了一种呈味肽的制备方法，该方法包括以下步骤，首先从暗纹东方飩的肌肉中提取水溶性成分，再截留其中分子量小于3000Da的超滤组分；再对所述的超滤组分进行进一步分离纯化后获得具有SEQ ID No 1的氨基酸序列的呈味肽。在本发明的一个具体实施方式
中，对超滤组分进行层析后，选择鲜味和甜味最强的组分(人工感官评定和电子舌分析系统测定)，优选的，采用Sephadex G_15凝胶色谱方法进行层析。在本发明的一个具体实施方式
中，对层析后选择的鲜味和甜味最强组分进行进一步层析分离，再选择其中鲜味和甜味最强的组分(人工感官评定和电子舌分析系统测定)进行成分鉴定，优选的，采用RP-HPLC方法进行层析。本发明另一方面提供了上述的呈味肽在食品领域的应用。本发明还提供了一种食品调味品，该食品调味品中包含上述的呈味肽。呈味肽作为呈味物质的一种，一般应用于食品领域，这是本领域技术人员所熟知的。至于呈味肽应用于食品调味品，例如用作食品调味品的基料或辅料，这些都是呈味物质的常规应用，是本领域技术人员可以预见的。本发明另一方面提供了一种呈味化合物，该呈味化合物以上述的呈味肽为单体经化学修饰后获得。所述的化学修饰包括中间残基修饰(与Glu-、Asn-、Thr-修饰等)等本领域技术人员所熟知的多肽的化学修饰方法。修饰后获得的化合物具有呈味功能。本发明还提供了上述的呈味化合物在食品领域的应用。本发明还提供了一种食品调味品，该食品调味品中包含上述的呈味化合物。同样的，呈味化合物应用于食品领域，这是本领域技术人员所熟知的。至于呈味化合物应用于食品调味品，例如用作食品调味品的基料或辅料，这些都是呈味物质的常规应用，是本领域技术人员可以预见的。
谱；
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图级质谱图
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图I为分子量小于3000Da的超滤组分经Sephadex G_15凝胶色谱分离后的层析二级质谱图。
具体实施例方式实施例I提取、分离、纯化并鉴定具有SEQ ID No 1氨基酸序列的呈味肽步骤(I):获得河豚的寡肽(水溶性)提取液原材料河豚鱼为江苏中洋集团养殖的暗纹东方飩。其经过江苏中洋集团的河豚鱼厨师剖杀分装后冰鲜运送回实验室。将暗纹东方飩的肌肉尽可能的从鱼体上分割下来。 用绞肉机绞碎，加4倍的水，用匀浆机匀浆，100°C加热3小时。用四层纱布过滤，滤液在 IlOOOg下离心20分钟。收集上清液。步骤(2):河豚寡肽提取液的分离、纯化将第一步获得的上清液(河豚多肽提取液)利用分子量截留范围为3000Da的超滤膜对其进行超滤分离，将分子量小于3000Da的超滤组分(本文中用Pz表示)收集，冷冻干燥后储存于_80°C冰箱中。将超滤组分(冻干后的样品粉末)配制成浓度为100mg/ml的溶液，用S印hadex G-15凝胶色谱进行进一步的分离(洗脱液为去离子水，流速为0.75mL/min)。层析图谱结果参见图1，横坐标表示洗脱时间(Elution Time),单位小时(h),纵坐标表示检测波长为 220nm。从图I可以看到5个吸收峰(PU P2、P3、P4、P5)，收集洗脱过程先后获得的5个洗脱组分(也称层析组分，依次用？1、？2、？3、？4、？5表示)。冷冻干燥后储存于-80°C下。从图I的结果可以看出，超滤后的组分经过Sephadex G_15凝胶色谱分离成五个主要组分，其中组分P2的物质含量最高。(分子量大小排序是Pl > P2 > P3 > P4 > P5)。步骤(3):利用人工感官评定和电子舌系统分析联用的方式来测定超滤组分Pz和层析组分P1-P5的呈味特性人工感官评定方法滋味稀释分析(TDA)法如下分别取Pz、P1-P5的冻干样品各lOOmg，加水定容于 IOOml的容量瓶中。再依次取ImL加9mL水进行逐步稀释，各个组分逐步稀释的溶液按照浓度增加的顺序呈给经过训练的评价员(8名3男，5女，经过培训的感官评定员)，每个稀释水平溶液采用3点测定进行评定。当某个稀释水平的溶液与两个空白(水)之间的滋味差异刚好能被识别出来，记录此时的稀释倍数，即稀释值(TD)。TD最终结果值取各评价员评定结果的平均值，评定结果之间的差异应低于或等于一个稀释水平。感官评分数据利用 SPSS 17. O进行单因素方差分析，若有显著性差异，则进行邓肯多重范围检验。每份样品在不同时间内重复三次。均为常温下评定。每位感官员还需评价每次呈上样品的滋味特性。超滤组分Pz和层析组分P1-P5的滋味稀释分析结果参见图2。图2柱状图中，横坐标表示超滤组分Pz和层析组分(P1-P5)，纵坐标表示每个组分的稀释值(即滋味强度)。从图2结果可以看出超滤组分Pz和层析组分P2的TD值最高，在相同含量范围内，最具有味感。超滤组分Pz和层析组分P1-P5的人工感官滋味特性评价结果参见下表表I
权利要求
1.一种呈味肽，其特征在于其具有SEQ ID No :I的氨基酸序列或者具有通过在SEQ ID No 1氨基酸序列中缺失、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列。
2.如权利要求I所述的呈味肽，其特征在于所述的呈味肽来源于暗纹东方飩的肌肉。
3.如权利要求I所述的呈味肽的制备方法，其特征在于所述的呈味肽为人工合成或者从暗纹东方飩体内提取。
4.一种呈味肽的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤，首先从暗纹东方飩的肌肉中提取水溶性成分，再截留其中分子量小于3000Da的超滤组分；再对所述的超滤组分进行进一步分离纯化后获得具有SEQ ID No 1的氨基酸序列的呈味肽。
5.如权利要求I或2所述的呈味肽在食品领域的应用。
6.一种食品调味品，其特征在于该食品调味品中包含权利要求I或2所述的呈味肽。
7.—种呈味化合物，其特征在于该呈味化合物以权利要求I或2所述的呈味肽为单体经化学修饰后获得。
8.如权利要求7所述的呈味化合物在食品领域的应用。
9.一种食品调味品，其特征在于该食品调味品中包含权利要求7所述的呈味化合物。
全文摘要
本发明涉及一种呈味肽及其制备方法和在食品领域的应用，该呈味肽具有SEQ ID No1的氨基酸序列或者具有通过在SEQ ID No1氨基酸序列中缺失、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列。
文档编号C07K7/06GK102603870SQ20121010224
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者刘源, 张梅秀, 王锡昌 申请人:上海海洋大学