专利名称：一种从禽畜血液中提取氯化血红素和珠蛋白肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种对禽畜血液进行精深加工的生产方法，主要涉及一种以禽畜血液为原料，利用水蛭蛋白酶提取氯化血红素和珠蛋白肽的方法。
背景技术：
畜禽血液含量因动物种类而异，以猪血为例，其重量约为生猪活体重的3% 5%。屠宰动物后所能收集到的血液约占总量60% 70%，其余的滞留于肝、肾、皮肤和体内。通常屠宰一头猪,约可收集2.0 3. Okg血液。我国从70年代开始逐渐认识到禽畜血液具有较高营养保健价值，但受诸多因素限制，对其利用还很不完善，导致大量宝贵的畜禽血液资源浪费，并且造成环境污染。70年代末期和80年代初期，国家开始重视禽畜血液的综合利用，将其作为重点课题进行攻关， 相继开发研究出一些禽畜血液制品。近几年来取得很大进展，相继出现许多重大科研成果，使其经济效益和社会效益大幅度提高，尤其是在畜禽饲料、营养补剂、血红素、血卟啉衍生物、氨基酸营养液等项目上的研究及应用，达到国际先进水平。过去十年中，中国禽畜饲养的地区化趋势日益明显，加之各地区都在实行集中屠宰制度，禽畜血液来源集中、广泛且安全可靠，因此充分利用禽畜血液在我国显得尤为重要。如何合理开发利用这一宝贵资源，已经引起国内有关部门的高度重视，尤其是提取在多种行业中均起重要作用的血红素更是众多研究的热点，利用禽畜血液制备高纯度氯化血红素及珠蛋白肽对于提高禽畜血液综合利用程度有举足轻重的地位，同时也是既有经济价值，又有社会价值的事业。血红素是血红蛋白的活性部位，是一类重要的天然卟啉铁化合物，广泛存在于高等动物的血液、肌肉中。从动物血液中提取的血红素产品一般是氯化高铁血红素简称氯化血红素，即原卟啉结合一个氯离子形成的氯化血红素。氯化血红素用于治疗缺铁性贫血，不仅疗效显著，治愈率高而且无胃肠道副作用，服用方便，易于患者接受，是目前疗效最好的补铁剂。珠蛋白肽是血红蛋白脱除血红素后的蛋白部分经酶解而成的小肽，比完全的游离氨基酸更易、更快被机体吸收利用，在促进免疫细胞增生、抗肿瘤、抗氧化、增强机体免疫力等方面有一定的功效。提取氯化血红素常见且工艺成熟的方法主要有醋酸钠法、蒸馏法、鞣酸法、羧甲基纤维素法和冰醋酸法。但在原理上，醋酸钠法、蒸馏法、鞣酸法都是利用丙酮进行制备。其工艺流程复杂，溶剂回收困难，不太适用于规模化工业生产，并且产品中会有机溶剂的残留，存在一定的安全隐患。采用生物酶解的方法将禽畜血液中的血红素及蛋白质分开，是一种较为可行的技术方案。但是由于市场上购买合适的蛋白酶制剂价格较高，对工业化生产成本影响极大
发明内容
为了克服现有工艺的问题和缺陷，充分利用禽畜血液资源，本发明提供一种利用以水蛭提取物作为蛋白酶制剂从禽畜血液中提取氯化血红素和珠蛋白肽的方法。水蛭，俗名蚂蟥，在内陆淡水水域内生长繁殖，是我国传统的特种药用水生动物，其干制品炮制后中医入药，具有治疗中风、高血压、清瘀、闭经、跌打损伤等功效。古代医书中记载有利用水蛭治疗多种疾病，谓其“主逐恶血、瘀血、月闭、破血消积聚”，医圣张仲景用其祛邪扶正，治疗“瘀血”、“水结”之症，显示了其独特的疗效。成年水蛭主要以动物的血液为食物，其消化系统所含的蛋白酶可以高效酶解所食血液中的蛋白质，以利于消化吸收。本发明主要是利用从水蛭提取物作为 蛋白酶制剂将禽畜血液中的血红素及蛋白质分开，并综合采用超声波技术及膜分离技术得到高纯度氯化血红素及珠蛋白肽共两种产物。本发明的日的可以通过下述技术方案来实现利用水蛭蛋白酶从禽畜血液中提取氯化血红素和珠蛋白肽的方法，其特征在于按以下步骤进行a、将水蛭洗净，晒干，切碎；b、将a步骤中切碎后的水蛭放入浓度为0. 05% 0. 12%的柠檬酸钠缓冲液中，料液比为I : 5，pH值为5. 0 6. 5，温度为35 50°C，浸泡10 30分钟，离心分离；C、将b步骤中离心分离得到的上清液中加入硫酸铵达到饱和度为30 % 50 %，进行分级沉淀，得到的上清液为水蛭蛋白酶溶液备用；d、将新鲜禽畜血液按0. 8% I. 0%的比例加入柠檬酸三钠作抗凝剂，均匀混合10分钟，然后离心分离，弃去上清液，收集下层血红蛋白细胞；e、将d步骤中收集的血红蛋白细胞按照I : I的比例与纯水混合，超声波处理15 20分钟破碎细胞；f、将e步骤中的细胞破碎液经100目筛网过滤，留下滤液调节pH值至2.0 3.5 ;g、将f步骤中调好pH值的细胞破碎液中迅速升温至85 95°C，保温10 15分钟，使蛋白质充分变性；按5%的比例加入由c步骤中得到的水蛭蛋白酶溶液进行酶解，调节PH值为5. 0 6. 5，酶解时间为100 180分钟，保持温度为40 60°C ;h、将g步骤得到的酶解液升温到85 90°C灭酶，时间为5分钟左右，调节pH值至4. 0 5. 5，离心分离得到的沉淀物经水洗后再脱水干燥即得到氯化血红素；i、将h步骤中离心分离得到的上清液经过微滤膜装置过滤，截留杂质、纤维和大分子蛋白等，得到微滤膜滤液，微滤膜过滤孔径为0. I I. Oum ；j、将i步骤中得到的微滤膜滤液再经过纳滤膜装置进行浓缩，为后续脱水干燥工序减轻负担，纳滤膜过滤孔径为0. I I. Onm ；k、再将j步骤中得到的纳滤膜浓缩液脱水干燥，得到珠蛋白肽。所述步骤b中的柠檬酸钠缓冲液浓度为0. 08% 0. 10%，pH值为5. 5 6. 0，温度为40 45°C，浸泡15 20分钟。所述步骤f中的细胞破碎液滤液调节pH值为2. 5 3. O。所述步骤g中的酶解过程调节pH值为5. 5 6. 0，酶解时间为120 150分钟，保持温度为45 50°C。所述步骤h中灭酶后的酶解液pH值调至4. 5 5. O。
本发明与已有工艺相比，具有以下优点本发明有效利用了禽畜血液资源，采用生物酶法与超声波技术、膜分离技术相结合，提取氯化血红素和珠蛋白肽。本发明利用水蛭提取物作为蛋白酶制剂将禽畜血液中的蛋白质进行降解并与血红素拆分，降低了 酶解提取工艺的生产成本。本发明工艺简单易行，操作安全，可以得到高品质的目标产物。本发明得到的氯化血红素的外观为黑色粉末，纯度大于90% ;珠蛋白肽的外观为粉红色，蛋白质纯度大于90%，其分子量主要分布在200 IOOODal之间。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细的说明实施例I :取水蛭100g，洗净后晒干；切碎；放入浓度为0. 08%的柠檬酸钠缓冲液中，料液比为I : 5，pH值为5. 5，温度为40°C，浸泡15分钟；离心分离，收集上清液；将上清液加入硫酸铵达到饱和度为30%，进行分级沉淀，得到的上清液水蛭蛋白酶溶液备用。取200ml新鲜猪血，按照0. 8%的比例加入抗凝剂柠檬酸三钠，均匀混合10分钟后离心分离，去掉上清液，收集下层血红蛋白细胞，约IOOml左右；再按照I : I的比例加入纯水，超声波处理15分钟破碎细胞；将破碎液经100目筛网过滤，留下滤液，用稀盐酸缓慢调节滤液pH值至2. 5 ；迅速升温至85°C，保温10分钟，使蛋白质充分变性；按5%的比例加入制备好的水蛭蛋白酶溶液进行酶解，调节PH值至5. 5，酶解时间为120分钟，保持温度为45°C ;酶解完成后再升温到85°C灭酶，时间为5分钟左右；调节酶解液pH值至4. 5，离心分离后分别得到沉淀物和上清液。沉淀物经过水洗后再脱水干燥即可得到氯化血红素；而上清液先经过滤孔径为0. 2um的微滤膜进行除杂，分别得到浓缩液和滤液；滤液再用过滤孔径为0. 2nm的纳滤膜进行浓缩；最后将浓缩液进行脱水干燥，可得到珠蛋白肽。实施例2 取水蛭2kg，洗净后晒干；切碎；放入浓度为0. 10%的柠檬酸钠缓冲液中，料液比为I : 5，pH值为6. 0，温度为45°C，浸泡20分钟；离心分离，收集上清液；将上清液加入硫酸铵达到饱和度为50%，进行分级沉淀，得到的上清液水蛭蛋白酶溶液备用。取IOOkg新鲜鸡血，按照I. 0%的比例加入抗凝剂柠檬酸三钠，均匀混合10分钟后离心分离，去掉上清液，收集下层血红蛋白细胞，约50kg左右；再按照I : I的比例加入纯水，超声波处理20分钟破碎细胞；将破碎液经过100目筛网过滤，留下滤液，用稀盐酸缓慢调节滤液pH值至3. 0 ;迅速升温至95°C，保温15分钟，使蛋白质充分变性；按5%的比例加入制备好的水蛭蛋白酶溶液进行酶解，调节PH值至6. 0，酶解时间为150分钟，保持温度为50°C ;酶解完成后再升温到90°C灭酶，时间为5分钟左右；调节酶解液pH值至5. 0，离心分离后分别得到沉淀物和上清液。沉淀物经过水洗后再脱水干燥即可得到氯化血红素；而上清液先经过滤孔径为0. 5um的微滤膜进行除杂，分别得到浓缩液和滤液；滤液再用过滤孔径为0. 5nm的纳滤膜进行浓缩；最后将浓缩液进行脱水干燥，可得到珠蛋白肽。
权利要求
1.一种从禽畜血液中提取氯化血红素和珠蛋白肽的方法，其特征在于按以下步骤进行 a、将水蛭洗净，晒干，切碎； b、将a步骤中切碎后的水蛭放入浓度为O.05% O. 12%的柠檬酸钠缓冲液中，料液比为I : 5，pH值为5. O 6. 5，温度为35 50°C，浸泡10 30分钟，离心分离； C、将b步骤中离心分离得到的上清液中加入硫酸铵达到饱和度为30% 50%，进行分级沉淀，得到的上清液为水蛭蛋白酶溶液备用； d、将新鲜禽畜血液按O.8% I. O %的比例加入柠檬酸三钠作抗凝剂，均匀混合10分钟，然后离心分离，弃去上清液，收集下层血红蛋白细胞； e、将d步骤中收集的血红蛋白细胞按照I: I的比例与纯水混合，超声波处理15 20分钟破碎细胞； f、将e步骤中的细胞破碎液经100目筛网过滤，留下滤液调节pH值至2.O 3. 5 ; g、将f步骤中调好pH值的细胞破碎液中迅速升温至85 95°C，保温10 15分钟，使蛋白质充分变性；按5%的比例加入由c步骤中得到的水蛭蛋白酶溶液进行酶解，调节pH值为5. O 6. 5，酶解时间为100 180分钟，保持温度为40 60°C ; h、将g步骤得到的酶解液升温到85 90°C灭酶，时间为5分钟左右，调节pH值至4.O 5. 5，离心分离得到的沉淀物经水洗后再脱水干燥即得到氯化血红素； i、将h步骤中离心分离得到的上清液经过微滤膜装置过滤，截留杂质、纤维和大分子蛋白等，得到微滤膜滤液，微滤膜过滤孔径为O. I I. Oum ； j、将i步骤中得到的微滤膜滤液再经过纳滤膜装置进行浓缩，为后续脱水干燥工序减轻负担，纳滤膜过滤孔径为O. I I. Onm ； k、再将j步骤中得到的纳滤膜浓缩液脱水干燥，得到珠蛋白肽。
2.根据权利要求I所述的一种从禽畜血液中提取氯化血红素和珠蛋白肽的方法，其特征在于所述步骤a中的柠檬酸钠缓冲液浓度为O. 08% O. 10%，pH值为5. 5 6. 0，温度为40 45°C，浸泡15 20分钟。
3.根据权利要求I所述的一种从禽畜血液中提取氯化血红素和珠蛋白肽的方法，其特征在于所述步骤f中的细胞破碎液滤液调节pH值为2. 5 3. O。
4.根据权利要求I所述的一种从禽畜血液中提取氯化血红素和珠蛋白肽的方法，其特征在于所述步骤g中的酶解过程调节pH值为5. 5 6.0，酶解时间为120 150分钟，保持温度为45 50°C。
5.根据权利要求I所述的一种从禽畜血液中提取氯化血红素和珠蛋白肽的方法，其特征在于所述步骤h中灭酶后的酶解液pH值调至4. 5 5. O。
全文摘要
本发明涉及一种以禽畜血液为原料，利用水蛭蛋白酶提取氯化血红素和珠蛋白肽的方法。主要步骤是1.中温浸提制备水蛭蛋白酶备用；2.取新鲜禽畜血液抗凝处理后离心收集血红蛋白细胞；3.加入一倍纯水，超声波处理破碎细胞；4.筛网过滤，留下滤液调节pH值；5.加入水蛭蛋白酶进行酶解；6.调节酶解液pH值离心分离；7.离心后的沉淀物经水洗后再脱水干燥即得到氯化血红素；离心后的上清液进行微滤膜除杂，纳滤膜浓缩，其浓缩液再脱水干燥可得到珠蛋白肽。本发明充分利用禽畜血液资源，并以水蛭提取物为酶制剂生产具有高附加值的氯化血红素及珠蛋白肽，工艺简单易行，生产成本较低，适合于工业化生产。
文档编号C07D487/22GK102659791SQ20121010604
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者万端极, 司佳, 吴尧, 吴正奇, 廖宇杰, 徐国念, 徐礼鹏, 李猷, 杨涛, 王雄, 肖诗英, 蔡君, 邹华蓉, 马超 申请人:武汉普赛特膜技术循环利用有限公司