专利名称：一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备胸腺素多肽的方法，具体涉及一种通过胸腺素a-I与内含肽融合表达、融合蛋白在内含肽介导下断裂释放出胸腺素多肽的方法，即利用内含肽制备胸腺素多肽的方法。
背景技术：
胸腺素alpha I (Thymosin a-I)是由28个氨基酸残基组成的多肽，等电点为
4.2，无二级结构无二硫键，唯一的修饰是N-末端乙酰化。胸腺素a-I的氨基酸序列为N-Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C,它是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂，可以使T细胞成熟和分化，可促使成熟的T细胞、NK细胞分泌各种淋巴因子如白介素_2、Y -干扰素，也可以同时促进白介素-2受体的生成。胸腺素a -I作为一种免疫增强剂，主要用于治疗免疫缺陷和免疫抑制类疾病。当病人患癌症或感染某些病毒如HIV、HBV或经过放化疗后，其免疫系统往往会被逐渐抑制甚至破坏，而不能发挥对病毒或癌细胞的正常杀伤作用。胸腺素a-1可以恢复T淋巴细胞的功能，促进成熟T细胞的增殖，促进淋巴细胞在病原组织及癌细胞周围的聚集，促进淋巴因子及淋巴因子受体的产生，增强免疫细胞的作用，提高机体对病毒和癌症的抵抗能力。胸腺素a -I在医疗上的应用主要有以下几个方面⑴癌症的治疗，已证实其对恶性黑色素瘤、肺癌、白血病、鳞状上皮细胞癌、直结肠癌有效；(2)病毒性肝炎(HBV)的治疗；(3)艾滋病病毒(HIV)的治疗；(4)放疗和化疗病人的免疫系统恢复。胸腺素a -I不仅对多种恶性肿瘤、病毒性肝炎、HIV等常见、多发、高死亡率性的疾病有良好的治疗和缓解作用，还在新生儿免疫、老年人医疗保健方面具有很大的应用潜力。目前，国内制备胸腺素a-I常用的方法是从动物的胸腺中提取，这种方法的缺点是操作复杂，提取纯度不高，且来源受动物数量限制。国外制备胸腺素a-I常用的方法是化学合成法，该方法的缺点是成本较高且容易造成环境污染。本发明的目的是利用基因工程技术，根据胸腺素a-I的氨基酸序列，推导并合成其编码核苷酸序列，以融合的方式与纯化标签、内含肽同时表达，利用纯化标签快速纯化出融合蛋白；利用内含肽自切割去除纯化标签获得胸腺素多肽。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备胸腺素多肽的方法，将胸腺素和内含肽融合表达，克服多肽因其分子量太小难以在常用的原核表达系统如大肠杆菌中表达，以及即使能够表达也因宿主内蛋白酶的水解导致多肽产物不均一的问题，且后期纯化只需改变融合蛋白溶液的PH等条件，即能使内含肽与胸腺素断裂，释放出胸腺素。该方法可以大量制备胸腺素，且成本低、无污染，适宜工业化大生产。为了达到上述目的，本发明提供了一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，该方、法包含步骤1，合成胸腺素a -I基因片段；步骤2，利用核酸内切酶、连接酶将合成的胸腺素a-I基因片段融合入纯化标签基因和内含肽基因中，获得融合蛋白重组基因，并导入宿主细胞中进行表达；步骤3，发酵该宿主细胞，使其表达目的融合蛋白，从而获得包含胸腺素、纯化标签和内含肽的融合蛋白产物；步骤4，利用所述的纯化标签对步骤3所得的融合蛋白产物进行纯化，得到纯化后的融合蛋白；步骤5，利用内含肽的自剪切效应对步骤4所述纯化后的融合蛋白进行裂解，获得胸腺素28肽单体；步骤6，加入乙酰化试剂对步骤5所述的胸腺素28肽单体的N末端进行乙酰化修饰，获得天然结构的胸腺素a-I ;步骤7，纯化所得的天然结构胸腺素a-I。上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，所述的纯化标签包含组氨酸标签His-tag、几丁质结合域CBD等。用基因工程的方法来表达蛋白质，必须经过纯化才能实现最终目的，将目的蛋白和一个亲和纯化短标签进行融合表达，通过亲和纯化标签蛋白来纯化目的蛋白是常用的间接手段，当融合蛋白溶液流经亲和纯化介质时，融合蛋白由于纯化标签的存在会被特异亲和吸附，杂质被洗掉后再洗脱目标蛋白，即达到使目的蛋白纯化 的目的。上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，步骤I所述的胸腺素a -I基因为GeneBank公用数据库公布的人胸腺素a-I 28肽的基因序列。上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，步骤I所述的胸腺素a -I基因是向上海生工、英潍捷基等基因合成公司订制合成的。上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，所述的步骤2中构建的融合蛋白的基因排列方式为纯化标签(Tag)-内含肽(Intein)-胸腺素(Thymosin)或胸腺素-内含肽-纯化标签。所述的融合蛋白的三部分即纯化标签、内含肽、胸腺素之间的连接方式包含直接连接以及借助其它蛋白连接肽连接。上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，步骤2和步骤3所述的融合蛋白的表达包含直接表达以及将其再与其他蛋白融合表达。上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，步骤2和步骤3所述的宿主细胞,包含原核生物宿主细胞，以及酵母、真菌和其他真核生物宿主细胞，即,可以使融合蛋白重组基因在各种原核表达系统以及酵母、真菌和其他真核表达系统中进行表达。上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，步骤3所述的发酵宿主细胞获得胸腺素融合蛋白产物，是指在发酵罐中接种步骤2所述的宿主细胞，经适合的条件培养并诱导宿主细胞表达目的融合蛋白；所述的步骤3中还包含步骤3. I，发酵培养结束后离心发酵液收集宿主细胞，并用一定体积的缓冲液将其重悬，超声破碎或者高压匀浆破碎宿主细胞，离心去除不溶物，得到上清液即融合蛋白产物的溶液。上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，步骤4所述的对融合蛋白进行纯化，是指将融合蛋白通过离过亲和层析柱，经缓冲液洗涤去除杂质蛋白，再通过洗脱缓冲液洗脱出目的融合蛋白，使融合蛋白产物得以纯化，所得蛋白纯度大于90%。上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，步骤5所述的融合蛋白裂解获得胸腺素28肽单体，是指在pH值为5-7、温度为4°C -37°C条件下，内含肽发生剪切反应将胸腺素从融合蛋白中剪切下来，然后将所得的蛋白溶液通过亲和层析柱，胸腺素28肽将穿过该柱，纯化标签则结合在柱上，分离得到胸腺素28肽单体。
上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，步骤6所述的28肽单体乙酰化，是指将所得的胸腺素28肽溶液的pH值调成酸性，加入乙酰化试剂对胸腺素28肽的N末端进行乙酰化修饰，得到天然结构的胸腺素a -I。所述的乙酰化试剂包含乙酰氯、乙酸酐以及
羟基琥珀酰亚胺乙酸酯。上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，步骤7所述的纯化所得的天然结构胸腺素a-1，包含利用反相高效液相层析(RP-HPLC)的方法进行纯化。利用RP-HPLC等技术能够获得纯度达98%以上的天然结构胸腺素a -I。本发明提供的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法具有以下优点
I.以融合形式表达胸腺素a-1，克服了多肽分子量较小难以在大肠杆菌中成功表达的困难。 2.融合蛋白具有纯化标签，能通过一步亲和层析获得较纯的目的蛋白，工艺简单、成本低。3.融合蛋白中含有内含肽序列，能够进行精确切割，释放出胸腺素多肽，反应条件简单，易于操作和工业化。4.体外乙酰化获得天然结构的胸腺素，且对环境无污染。
图I为本发明的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法的实施例I中用SDS-PAGE检测经过Ni-Sepharose层析柱纯化的融合蛋白的结果示意图。图2为本发明的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法的实施例I中用SDS-PAGE检测裂解融合蛋白得到的胸腺素28肽的结果示意图。图3为乙酰化胸腺素和未乙酰化胸腺素的质谱图。图4为本发明的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法制备的胸腺素28肽的纯化与乙酰化的RP-HPLC结果示意图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步地说明。本发明属于基因重组生物合成技术领域，利用生物合成方法和体外修饰技术生产胸腺素a -I。通过生物工程技术，将胸腺素基因进行重组，在宿主细胞中表达该重组基因获得纯化标签-内含肽-胸腺素融合蛋白，利用内含肽的自剪切效应，使融合蛋白在体外自切割释放出胸腺素28肽，再通过体外乙酰化修饰，获得与化学合成品结构完全一致的胸腺素
Ct -I 0首先，按照GeneBank公用数据库公布的人胸腺素a-I 28肽的基因序列合成胸腺素a-I基因，其5’端含有Lgu I、3’端含有Xhol I酶切位点。再利用核酸内切酶、连接酶将合成的胸腺素基因融合入纯化标签基因和内含肽基因中，获得融合蛋白重组表达载体，并导入宿主细胞如大肠杆菌感受态细胞中。在发酵罐中接种该宿主菌,经适合的条件培养并诱导宿主菌表达目的融合蛋白；发酵结束后离心发酵液收集菌体，用一定体积的缓冲液将菌体重悬，超声破碎或者高压匀浆破碎菌体，离心去除不溶物。离心上清过亲和层析柱，经缓冲液洗涤去除杂质蛋白，再通过洗脱缓冲液洗脱出目的融合蛋白，蛋白纯度大于90%。改变融合蛋白缓冲液的pH值为5-7、4°C_37°C条件下利用内含肽的自剪切作用将胸腺素从融合蛋白中剪切下来，剪切反应后将蛋白溶液再过一次亲和层析柱，胸腺素28肽将穿过该柱，纯化标签结合在柱上，从而分离出胸腺素28肽。将获得的多肽溶液调成酸性，加入乙酰化试剂(乙酰氯、乙酸酐或羟基琥珀酰亚胺乙酸酯等)对胸腺素28肽N末端进行乙酰化修饰，反应结束后，利用RP-HPLC纯化出天然结构的胸腺素a -I。实施例I
I.pET32a/ intein /Thymosin a -I 表达质粒的构建。合成胸腺素alpha I (Thymosin a-I)基因，5’端含有 Lgu I、3’端含有 Xhol I酶切位点，将合成好的基因克隆到PMD18-T载体上(以上步骤均为基因合成公司完成)。将得到的pMD18_T Vector/ Thymosin a-I质粒转化大肠杆菌DH5 a感受态细 胞。其转化方法为取I ML质粒加入到100 ML大肠杆菌DH5a感受态细胞，于冰上放置30min ;然后置于42°C水浴中90s，再放回到冰上3_5min ;然后加入800 ML LB培养基(Luria-Bertani培养基)，于37°C孵育45min ;然后2500rpm离心5min收集菌体,弃去700ML培养基，剩余200 ML培养基涂布于含50ML/mL氨苄青霉素的琼脂糖平板培养过夜。挑取平板上长出的单克隆，于5mL含50 ML/mL氨苄青霉素的LB培养基中震荡培养过夜。取2mL过夜培养菌液用质粒抽提试剂盒提取pMD18_T Vector/ Thymosin a-I质粒，PCR扩增获得胸腺素a -I基因，PCR反应体系为质粒IML ；PCR mix IOML ;正向、反向引物各1ML，加水补至20ML。扩增条件是95°C变性30s ;54°C退火30s，72°C延伸30s ;共35个循环。再经琼脂糖凝胶电泳纯化后用胶回收试剂盒回收，得到目的基因片段为90bp。将pTwin-1质粒转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中进行克隆。用质粒抽提试剂盒提取pTwin-1质粒，PCR扩增获得内含肽(intein)基因片段，PCR反应体系为质粒IML ；PCR mix 10ML ;正向、反向引物各1ML，加水补至20ML。扩增条件是95°C变性30s ;54°C退火30s，72°C延伸60s ;共30个循环。再经琼脂糖凝胶电泳纯化后用胶回收试剂盒回收，得到目的基因片段为462bp。将PCR获得的Thymosin a -I基因片段和intein基因片段按I: I混合(2ML+2ML)，加入4ML PCR mix后，于95°C变性30s ;54°C退火30s，72°C延伸60s，循环10次。以此反应产物为模板进行PCR，反应体系为反应产物IML ；PCR mix IOML ;正向、反向引物各1ML，力口水补至20ML。扩增条件是95°C变性30s ;54°C退火30s，72°C延伸90s ;共30个循环。PCR产物用Nco I ,Xhol I酶切，反应体系为PCR产物16ML，酶切Buffer 2ML，Nco I ,Xhol I酶各1ML，于37°C反应15min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后用胶回收试剂盒回收，得到Nco I、Xhol I酶切好的intein/Thymosin a-I融合片段,片段大小为552bp。用质粒抽提试剂盒提取pET_32a质粒,用Nco I、Xhol I酶切该质粒,酶切反应体系为pET_32a质粒 10ML，酶切 Buffer 2ML，Nco I ,Xhol I 酶各 1ML，加水补至 20ML，于 37°C反应15min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后用胶回收试剂盒回收，得到Nco I、Xhol I酶切好的pET-32a质粒，片段大小为5000bp。用T4-DNA连接酶将上述intein/Thymosin a -I融合片段与用Nco I、Xhol I酶切的pET32a载体连接,反应体系为intein/Thymosin a -I融合片段6ML, Nco I、Xhol I酶切好的pET-32a质粒2ML，T4-DNA连接酶1ML，连接Buffer 1ML，于16°C反应45min得到pET32a/ intein /Thymosin a-I表达质粒。将连接产物转化大肠杆菌TGl感受态细胞,抽质粒测序鉴定目的序列。2.融合蛋白的表达及产物纯化。将pET32a/ intein /Thymosin a-I质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，挑取单菌落接种至含50 ii g/ml Amp的LB培养基中，37°C、250rpm/min振摇过夜。过夜菌按2% (v/v)接种于新鲜LB培养基(含50 u g/ml Amp), 37°C >200rpm/min振摇培养至0D600约为0. 6 0. 8,加入终浓度为lmmol/L IPTG诱导6h,离心(6000rpm/min, IOmin, 4°C )收集菌体。
按每克菌体加入7. 5ml缓冲液的比例加入裂解缓冲液(PBS)，4°C超声破碎(400w，lOmin)，将裂解的菌液12000g/min，4°C离心15min，收集上清。上清液上样至预先用平衡缓冲液平衡的G25层析柱，用洗脱液洗脱，收集蛋白溶液。再将收集的蛋白溶液上样至预先用平衡缓冲液平衡的Ni-Sepharose层析柱，用5mM咪唑洗涤缓冲液充分洗涤，再用含70mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱，收集蛋白峰，用SDS-PAGE检测蛋白纯度，参见图I所示。收集目的蛋白峰，调整蛋白缓冲液的PH值至6. 2，在25°C条件下，融合蛋白中内含肽的自剪切作用使胸腺素a-I (28肽)被剪切下来。将蛋白溶液上样至预先用平衡缓冲液平衡的DEAE Sepharose层析柱，用洗脱液洗脱，收集蛋白峰，用SDS-PAGE检测蛋白纯度，参见图2所示。实施例2
I. pTwin-l/Thymosin a -I 表达质粒的构建。如实施例I中所述,从基因合成公司购置pMD18_T Vector/ Thymosin a-I质粒，转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，然后用质粒抽提试剂盒提取质粒，通过PCR扩增获得Thymosin a-I基因，所得目的基因片段为90bp。将pTwin-1质粒用Lgu I、Pst I进行双酶切，反应体系为pMD18_T Vector/Thymosin a -I 质粒 10ML,酶切 Buffer 2M-L, Nco I、Xhol I 酶各 lML,加水补至 20ML,于37°C反应15min。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后用胶回收试剂盒回收，片段大小为7375bp。将回收好的目的基因片段和Lgu I ,Pst I酶切的pTwin-1载体(用CIAP处理，去除平末端磷酸基团)用T4-DNA连接酶连接形成pTwin-l/Thymosin a -I,将连接产物转化大肠杆菌TGl感受态细胞，抽质粒测序鉴定目的序列。2.融合蛋白的表达及产物纯化。pTwin-1/ Thymosin a-I质粒转化大肠杆菌ER2566感受态细胞,挑取单菌落接种至含50 ii g/ml Amp的LB培养基中，37°C、200rpm/min振摇过夜。过夜菌按2% (v/v)接种于新鲜LB培养基(含50 ii g/ml Amp)，37°C、200rpm/min振摇培养至0D600约为0. 6^0. 8，加入终浓度为lmmol/L IPTG诱导6h,离心(6000rpm/min, lOmin, 4°C )收集菌体。按每克菌体加入7. 5ml缓冲液的比例加入裂解缓冲液(PBS)，4°C超声破碎(400w，lOmin)，将裂解的菌液用12000g/min，4°C离心15min，收集上清。上清液上样至预先用平衡缓冲液平衡的G25层析柱，洗脱液洗脱层析柱，收集蛋白峰。再将收集的蛋白溶液上样至预先用平衡缓冲液平衡的几丁质亲和层析柱，洗涤缓冲液充分洗涤，然后调整几丁质柱的PH为6. 2，25°C过夜，利用内含肽的自剪切作用将胸腺素a -I多肽从融合蛋白中剪切下来，用洗脱缓冲液将胸腺素a -I多肽洗脱下来，收集蛋白峰，SDS-PAGE检测蛋白纯度。
实施例3 :重组胸腺素28肽的体外乙酰化。胸腺素a -I分子量为3108Da,未乙酰化的胸腺素分子量则比其小42,为3066,参见图3所示。用乙酸将实施例I或实施例2所得的胸腺素a -I 28肽溶液pH调整到2_3，然后按照每IOmin每IOmL溶液中加入2 ML乙酸酐的速度加入乙酸酐，于冰上持续搅拌反应。利用RP-HPLC监测反应，至乙酰化胸腺素不再累积时停止反应。用RP-HPLC纯化出天然结构胸腺素a-I。参见图4所示，图中的I、II、III、IV分别代表融合蛋白裂解后、融合蛋白裂解后经DEAE纯化、纯化后的胸腺素28肽经体外乙酰化反应，和乙酰化反应后RP-HPLC纯化出的胸腺素；峰1、2、3则分别代表未乙酰化的胸腺素、内含肽和乙酰化胸腺素。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的 多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
权利要求
1.一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，该方法包含 步骤I，合成胸腺素a-I基因片段； 步骤2，利用核酸内切酶、连接酶将合成的胸腺素a-I基因片段融合入纯化标签基因和内含肽基因中，获得融合蛋白重组基因，并导入宿主细胞中进行表达； 步骤3，发酵该宿主细胞，使其表达目的融合蛋白从而获得胸腺素融合蛋白； 步骤4，利用所述的纯化标签对步骤3所得的融合蛋白进行纯化，得到纯化后的融合蛋白； 步骤5，利用内含肽的自剪切效应对步骤4所述纯化后的融合蛋白进行裂解，获得胸腺素28肽单体； 步骤6，加入乙酰化试剂对步骤5所述的胸腺素28肽单体的N末端进行乙酰化修饰，获得天然结构的胸腺素a-I ； 步骤7，纯化所得的天然结构胸腺素a-I。
2.如权利要求I所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，所述的纯化标签包含组氨酸标签、几丁质结合域。
3.如权利要求I或2所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，所述的步骤2中构建的融合蛋白重组基因的排列方式为纯化标签-内含肽-胸腺素或胸腺素-内含肽-纯化标签；所述的纯化标签、内含肽、胸腺素之间的连接方式为直接连接或借助蛋白连接肽连接。
4.如权利要求3所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤2所述的表达包含直接表达以及与其他蛋白融合表达。
5.如权利要求4所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤2所述的宿主细胞，包含原核生物宿主细胞，以及酵母、真菌和其他真核生物宿主细胞。
6.如权利要求5所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤3所述的发酵宿主细胞，是指在发酵罐中接种步骤2所述的宿主细胞，进行发酵培养使其表达目的融合蛋白；所述的步骤3还包含步骤3. 1，在发酵培养结束后离心发酵液收集宿主细胞，并用缓冲液将其重悬，超声破碎或者高压匀浆破碎宿主细胞，离心去除不溶物，得到上清液即融合蛋白溶液。
7.如权利要求I所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤4所述的对融合蛋白进行纯化，是指将融合蛋白通过亲和层析柱，经缓冲液洗涤去除杂质蛋白，再通过洗脱缓冲液洗脱出目的融合蛋白。
8.如权利要求I所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤5所述的融合蛋白裂解获得胸腺素28肽单体，是指在pH值为5-7、温度为4°C _37°C条件下，内含肽发生剪切反应将胸腺素从融合蛋白中剪切下来，然后将所得的蛋白溶液通过亲和层析柱，分离得到胸腺素28肽单体。
9.如权利要求I所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤6所述的乙酰化试剂包含乙酰氯、乙酸酐以及羟基琥珀酰亚胺乙酸酯。
10.如权利要求I所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤7所述的纯化所得的天然结构胸腺素a -1，包含利用反相高效液相层析的方法进行纯化。
全文摘要
本发明公开了一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，该方法包含步骤1，合成胸腺素α-1基因片段；步骤2，利用核酸内切酶、连接酶将合成的胸腺素α-1基因融合入纯化标签基因和内含肽基因中，获得融合蛋白重组基因，并导入宿主细胞中；步骤3，发酵该宿主细胞获得胸腺素融合蛋白；步骤4，利用纯化标签对步骤3所得的融合蛋白进行纯化；步骤5，对步骤4所得的融合蛋白进行切割，获得胸腺素28肽单体；步骤6，对该28肽单体进行乙酰化，获得天然结构的胸腺素α-1；步骤7，纯化所得的天然结构胸腺素α-1。本发明提供的制备胸腺素多肽的方法，使多肽在宿主细胞中易于表达，工艺简单、成本低，易于操作和工业化，且对环境无污染。
文档编号C07K1/20GK102676534SQ201210106698
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者周亮, 洪亮, 祝君 申请人:上海育臣生物工程技术有限公司