专利名称：一种同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及糖胺聚糖和抗菌肽的制备，尤其是涉及一种同时制备单环刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法。
背景技术：
单环刺縊俗名海肠、海肠子，属于縊虫动物门、縊纲、无管縊目、刺縊科。体粗大，长约100-300mm，宽约25_27mm，体表满布大小不等的粒状突起，吻圆锥形；腹刚毛I对，粗大； 肛门周围有一圈9-13条褐色尾刚毛，是我国北方沿海泥沙岸潮间带下区及潮下带浅水区底栖生物的常见种。目前对单环刺縊研究集中在形态结构、胚胎发育、生活史、人工育苗技术、营养成分分析及血栓溶解酶等，对于单环刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的开发应用尚未见报道。糖胺聚糖是海洋生物中含量较丰富的物质，是由重复的二糖单位构成的长链多糖，具有明显的抗凝血、抗肿瘤、抗病毒和提高机体免疫力的作用；抗菌肽是动物免疫防御系统在诱导条件下产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，广泛存在于植物和动物体内，分子质量一般在4ku左右，抗菌肽是生物体内的内源性抗生素，是生物体先天性免疫体系的重要组成部分。
发明内容
本发明的目的是提供一种以单环刺縊为原材料，同时制备单环刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法。本发明的技术方案概述如下一种同时制备单环刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步骤(I)原料处理将原料单环刺縊洗净后，匀浆，制成匀浆液；(2)酶解向所述匀浆液中加入枯草杆菌中性蛋白酶，在43°C _47°C水浴条件下酶解4-6h,酶解液煮沸灭酶后,5000r-8000r/min离心10min-15min,得上清液；(3)超滤将所述上清液通过相对分子质量I万的中空纤维滤膜超滤分离，得到相对分子质量I万以下和相对分子质量I万以上的两种组分的液体；(4)糖胺聚糖的制备①除蛋白质将所述相对分子质量I万以上的组分的液体浓缩至该液体体积的 1/3-1/4，先用HCl水溶液调pH至2. 0，离心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液调pH至7. 0， 离心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最终质量浓度为3% -5%，离心除去蛋白质沉淀；②醇沉、洗涤将步骤①获得的上清液在搅拌下加入乙醇，使乙醇的体积浓度为 70% -80%，于 4°C条件下静置 20-28 小时，5000r_8000r/min 离心 10min_15min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤2-4次，得粗提糖胺聚糖；③阴离子交换柱层析将粗提糖胺聚糖溶于蒸馏水中，使其质量浓度为1% -3%,加到阴离子交换柱中，先用PH = 5. 0-5. 5乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗脱，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脱，洗脱液浓缩至洗脱液体积的1/2-1/4、透析、再浓缩至透析后液体积的 1/3-1/4 ；
④凝胶过滤层析将步骤③获得的浓缩液上样于S^hadexG-IOO凝胶过滤柱，进一步分离纯化，收集的流出液浓缩至流出液体积的1/4-1/6，浓缩液冷冻干燥得高纯糖胺聚糖；(5)抗菌肽制备将所述相对分子量I万以下组分的液体浓缩至该液体体积的 1/2-1/4,上样于SephadexG-IOO凝胶过滤柱,用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸钠水溶液洗脱,洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/2-1/3，浓缩液上样于S印hadexG-25凝胶过滤柱，0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/4-1/6，浓缩液冷冻干燥得抗菌肽纯品。最好的是步骤(2)中枯草杆菌中性蛋白酶的添加量是匀浆液质量的0. 8% -1%。阴离子交换柱的填料优选DEAE-52纤维素或Q-Sepharose Fast Flow。本发明的优点和积极效果是I.本发明的方法反应条件温和、制备过程绿色环保节能，一种原料同时制备两种活性物质，产品附加值高；2.本发明的方法采用单环刺縊为原料，制备的糖胺聚糖和抗菌肽纯度高；3.本方法在制备糖胺聚糖和抗菌肽的同时还可大量回收蛋白质，有利于单环刺縊的综合利用，所制备的糖胺聚糖具有明显的抗凝血(AT、PT和APTT三项指标均显著高于空白对照组)、清除自由基(对于羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力显著高于空白对照组)的效果，制备的抗菌肽对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌等具有明显的抑菌活性；所得的糖胺聚糖和抗菌肽还可为海珍动物养殖业提供优良的免疫增强剂和新型抗菌药物。
图I为单环刺縊糖胺聚糖对白兔TT实验的影响。图2为单环刺縊糖胺聚糖对白兔PT实验的影响。图3为单环刺縊糖胺聚糖对白兔APTT实验的影响。图4为抗囷妝抑囷圈测定结果。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本实施例所采用的提取客体是选自渤海广泛分布的縊虫动物-单环刺縊。实施例I一种同时制备单环刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括以下步骤(I)原料处理将单环刺縊洗净后，匀浆，制成匀浆液；(2)酶解向匀浆液中加入枯草杆菌中性蛋白酶，枯草杆菌中性蛋白酶的添加量是匀浆液质量的I %，在45°C水浴条件下酶解5h，酶解液煮沸灭酶后，6000r/min离心IOmin,得上清液； (3)超滤将上清液通过相对分子质量I万的中空纤维滤膜超滤分离，得到相对分子质量I万以下和相对分子质量I万以上的两种组分的液体；(4)糖胺聚糖的制备①除蛋白质将相对分子质量I万以上的组分的液体浓缩至该液体体积的1/3，先用HCl水溶液调pH至2. O，离心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液调pH至7. O，离心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最终质量浓度为4%，离心除去蛋白质沉淀；②醇沉、洗涤将步骤①获得的上清液在搅拌下加入乙醇，使乙醇的体积浓度为 80%,于4°C条件下静置24小时，6000r/min离心IOmin,移去上清液,沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤3次，得粗提糖胺聚糖；③阴离子交换柱层析将粗提糖胺聚糖溶于蒸馏水中，使其质量浓度为2%，加到填料为DEAE-52纤维素的阴离子交换柱中，先用pH = 5. 3乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗脱，再用 0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脱，洗脱液(抗凝血活性较强)浓缩至洗脱液体积的1/3、 透析、再浓缩至透析后液体积的1/3 ；④凝胶过滤层析将步骤③获得的浓缩液上样于S^hadexG-IOO凝胶过滤柱，进一步分离纯化，收集的流出液浓缩至流出液体积的1/5，浓缩液冷冻干燥得高纯糖胺聚糖；(5)抗菌肽制备将所述相对分子量I万以下组分的液体浓缩至该液体体积的 1/3,上样于SephadexG-IOO凝胶过滤柱,用0. 2mol/L pH = 7. O乙酸钠水溶液洗脱,洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/3,浓缩液上样于SephadexG-25凝胶过滤柱,0. 2mol/L pH = 7. O 乙酸钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/4，浓缩液冷冻干燥得抗菌肽纯品。通过检验，制备的糖胺聚糖纯度达94. 6%，得率为是原料重的0. 32%;抗菌肽纯度达92. 1%，得率为是原料重的0. 08%。实施例2一种同时制备单环刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步骤(I)原料处理将原料单环刺縊洗净后，匀浆，制成匀浆液；(2)酶解向所述匀浆液中加入枯草杆菌中性蛋白酶，枯草杆菌中性蛋白酶的添加量是匀浆液质量的0. 8%，在43°C水浴条件下酶解6h，酶解液煮沸灭酶后，8000r/min离心IOmin,得上清液；(3)超滤将所述上清液通过相对分子质量I万的中空纤维滤膜超滤分离，得到相对分子质量I万以下和相对分子质量I万以上的两种组分的液体；(4)糖胺聚糖的制备①除蛋白质将所述相对分子质量I万以上的组分的液体浓缩至该液体体积的 1/3，先用HCl水溶液调pH至2. O，离心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液调pH至7. O，离心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最终质量浓度为3%，离心除去蛋白质沉淀；②醇沉、洗涤将步骤①获得的上清液在搅拌下加入乙醇，使乙醇的体积浓度为 75%，于4°C条件下静置24小时，7000r/min离心13min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤3次，得粗提糖胺聚糖；③阴离子交换柱层析将粗提糖胺聚糖溶于蒸馏水中，使其质量浓度为1%，加到填料为DEAE-52纤维素的阴离子交换柱中，先用pH = 5. O乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗脱，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脱，洗脱液(抗凝血活性较强)浓缩至洗脱液体积的1/3、 透析、再浓缩至透析后液体积的1/3 ；④凝胶过滤层析将步骤③获得的浓缩液上样于S^hadexG-IOO凝胶过滤柱，进一步分离纯化，收集的流出液浓缩至流出液体积的1/4，浓缩液冷冻干燥得高纯糖胺聚糖；
(5)抗菌肽制备将所述相对分子量I万以下组分的液体浓缩至该液体体积的 1/2，上样于S印hadexG-100凝胶过滤柱，用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/2,浓缩液上样于SephadexG-25凝胶过滤柱,0. 2mol/L pH = 7. 0 乙酸钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/5，浓缩液冷冻干燥得抗菌肽纯品。通过检验，制备的糖胺聚糖纯度达92. 8%，得率为是原料重的0. 28%;抗菌肽纯度达92. 5%，得率为是原料重的0. 07%。实施例3一种同时制备单环刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步骤(I)原料处理将原料单环刺縊洗净后，匀浆，制成匀浆液；(2)酶解向所述匀浆液中加入枯草杆菌中性蛋白酶，枯草杆菌中性蛋白酶的添加量是匀浆液质量的0. 9%，在45°C水浴条件下酶解5h，酶解液煮沸灭酶后，5000r/min离心15min,得上清液；(3)超滤将所述上清液通过相对分子质量I万的中空纤维滤膜超滤分离，得到相对分子质量I万以下和相对分子质量I万以上的两种组分的液体；(4)糖胺聚糖的制备①除蛋白质将所述相对分子质量I万以上的组分的液体浓缩至该液体体积的 1/4，先用HCl水溶液调pH至2. 0，离心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液调pH至7. 0，离心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最终质量浓度为4%，离心除去蛋白质沉淀；②醇沉、洗涤将步骤①获得的上清液在搅拌下加入乙醇，使乙醇的体积浓度为 80%，于4°C条件下静置20小时，5000r/min离心15min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤2次，得粗提糖胺聚糖；③阴离子交换柱层析将粗提糖胺聚糖溶于蒸馏水中，使其质量浓度为2%，加到填料为Q-Sepharose Fast Flow的阴离子交换柱中，先用pH = 5. 3乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗脱，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脱，洗脱液(抗凝血活性较强)浓缩至洗脱液体积的1/2、透析、再浓缩至透析后液体积的1/3 ；④凝胶过滤层析将步骤③获得的浓缩液上样于S^hadexG-IOO凝胶过滤柱，进一步分离纯化，收集的流出液浓缩至流出液体积的1/5，浓缩液冷冻干燥得高纯糖胺聚糖；(5)抗菌肽制备将所述相对分子量I万以下组分的液体浓缩至该液体体积的 1/3,上样于SephadexG-IOO凝胶过滤柱,用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸钠水溶液洗脱,洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/3,浓缩液上样于SephadexG-25凝胶过滤柱,0. 2mol/L pH = 7. 0 乙酸钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/4，浓缩液冷冻干燥得抗菌肽纯品。通过检验，制备的糖胺聚糖纯度达94. 8%，得率为是原料重的0. 31%;抗菌肽纯度达91. 8%，得率为是原料重的0. 059%。实施例4一种同时制备单环刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步骤
(1)原料处理将原料单环刺縊洗净后，匀浆，制成匀浆液；(2)酶解向所述匀浆液中加入枯草杆菌中性蛋白酶，枯草杆菌中性蛋白酶的添加量是匀浆液质量的1%，在47°C水浴条件下酶解4h，酶解液煮沸灭酶后，6000r/min离心 13min,得上清液；(3)超滤将所述上清液通过相对分子质量I万的中空纤维滤膜超滤分离，得到相对分子质量I万以下和相对分子质量I万以上的两种组分的液体；(4)糖胺聚糖的制备①除蛋白质将所述相对分子质量I万以上的组分的液体浓缩至该液体体积的 1/4，先用HCl水溶液调pH至2. 0，离心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液调pH至7. 0，离心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最终质量浓度为5%，离心除去蛋白质沉淀；②醇沉、洗涤将步骤①获得的上清液在搅拌下加入乙醇，使乙醇的体积浓度为 70%，于4°C条件下静置28小时，8000r/min离心lOmin，移去上清液，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤4次，得粗提糖胺聚糖；③阴离子交换柱层析将粗提糖胺聚糖溶于蒸馏水中，使其质量浓度为3%，加到填料为Q-Sepharose Fast Flow的阴离子交换柱中，先用pH = 5. 5乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗脱，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脱，洗脱液(抗凝血活性较强)浓缩至洗脱液体积的1/4、透析、再浓缩至透析后液体积的1/4 ；④凝胶过滤层析将步骤③获得的浓缩液上样于S印hadexG-100凝胶过滤柱，进一步分离纯化，收集的流出液浓缩至流出液体积的1/6，浓缩液冷冻干燥得高纯糖胺聚糖；(5)抗菌肽制备将所述相对分子量I万以下组分的液体浓缩至该液体体积的 1/4,上样于SephadexG-IOO凝胶过滤柱,用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸钠水溶液洗脱,洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/3,浓缩液上样于SephadexG-25凝胶过滤柱,0. 2mol/L pH = 7. 0 乙酸钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/6，浓缩液冷冻干燥得抗菌肽纯品。通过检验，制备的糖胺聚糖纯度达94. 3%，得率为是原料重的0. 29%;抗菌肽纯度达93. 4%，得率为是原料重的0. 071 %。实施例5单环刺縊糖胺聚糖抗凝血I材料与方法I. I实验材料实验动物选用新西兰白兔，糖胺聚糖(GAG)来自单环刺縊(实施例I制备)。实验仪器=LG-PABER型凝血因子分析仪。I. 2实验方法采用体外实验法。(I)凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)的测定新西兰白兔，戊巴比妥钠麻醉，心脏取血，3. 8%枸橼酸钠抗凝(I 9)，混匀后以 3000r/min,离心15min,取上清,分离出贫血小板血衆(PPP),取PPP 100 U I,加入糖胺聚糖 10 u I,预温5min后加入预温15min的PT和TT试剂,用血小板聚集凝血因子分析仪测定凝固时间。(2)活化的部分凝血活酶时间(APTT)的测定
上面的方法分离出贫血小板血浆(PPP)，取PPP lOOiU，加入IOiU糖胺聚糖和 IOOu I APTT试剂，预温5min后加入预温15min的CaC12100 yl，用血小板聚集凝血因子分析仪测定凝固时间。2结果与分析实验设生理盐水为空白对照，0. 005mg/ml和0. 01mg/ml的肝素钠做阳性对照， 糖胺聚糖设置以肝素的最大浓度为起始浓度，0. 01mg/ml、0. 2mg/ml、0. 4mg/ml、0. 6mg/ml、
0.8mg /ml五个浓度组,进行体外抗凝血试验,结果见图1、2、3，从三个图看出，单环刺婦糖胺聚糖能明显延长PT和APTT，作用稍弱于肝素，对于TT也有一定的的延长作用。实施例6单环刺縊抗菌肽的抗菌活性I实验方法采用牛津杯法。副溶血弧菌和嗜水气单胞菌的浓度为2. 3 X 106CfU/ml，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的浓度为I. 2X106cfu/ml,向每个牛津杯中加入200 U I抗菌肽(实施例 I制备)，以青霉素做阳性对照，灭菌水做阴性对照，4°C静置24h后转入恒温培养箱，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌37°C培养24h，副溶血弧菌和嗜水气单胞菌30°C培养24h，培养后用游标卡尺测定抑菌圈直径，并根据其直径大小判断抑菌活性的强弱。2实验结果结果见图4，从图4看出，抗菌肽对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性，其中对副溶血弧菌抑菌活性最强，对嗜水气单胞菌次之，对金黄色葡萄球菌抑菌活性最弱。
权利要求
1.一种同时制备单环刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，其特征是包括如下步骤(1)原料处理将原料单环刺縊洗净后，匀浆，制成匀浆液；(2)酶解向所述匀浆液中加入枯草杆菌中性蛋白酶，在43°C_47°C水浴条件下酶解 4_6h,酶解液煮沸灭酶后,5000r-8000r/min离心10min-15min,得上清液；(3)超滤将所述上清液通过相对分子质量I万的中空纤维滤膜超滤分离，得到相对分子质量I万以下和相对分子质量I万以上的两种组分的液体； (4)糖胺聚糖的制备①除蛋白质将所述相对分子质量I万以上的组分的液体浓缩至该液体体积的 1/3-1/4，先用HCl水溶液调pH至2. O，离心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液调pH至7. 0， 离心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最终质量浓度为3% -5%，离心除去蛋白质沉淀；②醇沉、洗涤将步骤①获得的上清液在搅拌下加入乙醇，使乙醇的体积浓度为 70% -80%，于 4°C条件下静置 20-28 小时，5000r-8000r/min 离心 10min_15min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤2-4次，得粗提糖胺聚糖；③阴离子交换柱层析将粗提糖胺聚糖溶于蒸馏水中，使其质量浓度为1%_3%，力口到阴离子交换柱中，先用pH = 5. 0-5. 5乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗脱，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脱，洗脱液浓缩至洗脱液体积的1/2-1/4、透析、再浓缩至透析后液体积的 1/3-1/4 ；④凝胶过滤层析将步骤③获得的浓缩液上样于SephadexG-IOO凝胶过滤柱,进一步分离纯化，收集的流出液浓缩至流出液体积的1/4-1/6，浓缩液冷冻干燥得高纯糖胺聚糖；(5)抗菌肽制备将所述相对分子量I万以下组分的液体浓缩至该液体体积的 1/2-1/4,上样于SephadexG-IOO凝胶过滤柱,用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸钠水溶液洗脱,洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/2-1/3，浓缩液上样于S印hadexG-25凝胶过滤柱，0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/4-1/6，浓缩液冷冻干燥得抗菌肽纯品。
2.根据权利要求I所述的一种同时制备单环刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，其特征在于所述步骤(2)中枯草杆菌中性蛋白酶的添加量为所述匀浆液质量的0.8%-1%。
3.根据权利要求I所述的一种同时制备单环刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，其特征在于所述阴离子交换柱的填料为DEAE-52纤维素或Q-Sepharose Fast Flow。
全文摘要
本发明公开了一种同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步骤(1)原料处理将原料单环刺螠制成匀浆液；(2)酶解；(3)超滤；(4)糖胺聚糖的制备①除蛋白质；②醇沉、洗涤；③阴离子交换柱层析；④凝胶过滤层析得高纯糖胺聚糖；(5)抗菌肽制备。本发明的方法反应条件温和、制备过程绿色环保节能，产品附加值高；制备的糖胺聚糖和抗菌肽纯度高；可大量回收蛋白质，有利于单环刺螠的综合利用，所制备的糖胺聚糖具有明显的抗凝血、清除自由基的效果，制备的抗菌肽对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌等具有明显的抑菌活性；所得的糖胺聚糖和抗菌肽还可为海珍动物养殖业提供优良的免疫增强剂和新型抗菌药物。
文档编号C07K1/16GK102618614SQ20121010962
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者刘萍, 崔青曼, 袁春营, 韩旭 申请人:天津高蜚生物科技发展有限公司