专利名称：一种从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法
技术领域：
本发明涉及一种从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法。
背景技术：
松花粉为松科植物马尾松、油松或同属植物的花粉，是中国医学宝库中药食兼用品种，作为中国传统的药材，其药食兼用的历史已逾数千年，主要分布我国浙江、江苏、河北、辽宁、吉林、湖北等地。干燥松花粉为淡黄色的细粉末，呈均匀的小圆粒，体质轻飘，易飞扬，有滑润感，不沉于水，气微香，味有油腻感。松花粉含有多种营养成分，包括蛋白质、氨基酸、单糖、多糖、核酸、矿物质等多种活性成分。近代科学研究发现松花粉具有增强免疫力、抗疲劳、抗衰老、保护心血管等多种功能活性作用。 酶解肽类是以动、植物食物蛋白源为原料，经过生物酶水解、分离、精制得到的小分子蛋白(肽)的混合物，是存在于动物、植物、微生物体内的天然生物活性肽和蛋白质降解后产生的外源性生物活性肽。酶解肽分子量分布在一定范围，来源广、种类多，具有被人体快速吸收的特点，并根据蛋白来源的不同和分解程度不同具有抗氧化、调节免疫力、降血压等多种生理活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的生产方法，充分利用了松花粉这一宝贵的植物资源。本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法，包括以下步骤I)将所述松花粉进行破壁处理，得到破壁松花粉；2)对步骤I)中得到的破壁松花粉依次进行Tris-HCl溶液浸提、第一次离心、抽滤，得到分离液，其中，所述破壁松花粉与所述Tris-HCl溶液的体积百分比为I :20 30 ；3)将固体硫酸铵粉末加入到步骤2)中得到的分离液中，至硫酸铵硫酸铵达到100%饱和度，再进行蛋白质盐析并进行搅拌，得到盐析液，再将所述盐析液进行离心，得到沉淀物；4)向步骤3)中得到的沉淀物中再加入TriS-HCl溶液，不断搅拌至均匀，再进行三蒸水透析，得到透析内液；5)对步骤4)中得到透析内液进行真空冷冻干燥处理，即得到所述粗蛋白粉；6)对步骤5)中得到的粗蛋白粉用三蒸水复溶，得到蛋白液，调节蛋白液的浓度及PH值，再放入水浴锅中恒温水浴，再加入碱性蛋白酶，进行酶解，得到多肽混合液，再将酶解后的多肽混合液放入沸水浴中，钝化蛋白酶使其失活，取出后，迅速冷却，然后再进行第三次离心，取上清，冷冻干燥，即得酶解肽类。本发明的有益效果是应用本发明方法制备的松花粉蛋白及其酶解肽类，具有很高的营养价值，易于人体吸收，可用作食品和保健食品的原料。将酶解后的多肽混合液放入沸水浴中，钝化蛋白酶使其失活，取出后，迅速冷却，可防止其残余的碱性蛋白酶对肽进行破坏。松花粉外观为淡黄色细粉末，质体轻扬，极易飞散，手捻有润滑感，具有流体特性，破壁后松花粉物理性状发生改变，流体特性丧失，破壁花粉黏附性很强。从松花粉破壁前后的显微形态及营养成分分析看，破壁松花粉中总能量、总脂、淀粉含量明显提高。破壁后粗蛋白从12. 7%上升为13. 1%，淀粉从5. 4%增为7. 0% ;总脂从7. 3%增加到10. 0% ;总能量破壁后增加约5% ;天然松花粉粗灰分为3. 1%，松花粉破壁后粗灰分有所提高，达到3. 5%。天然松花粉进行破壁处理，可使其中某些营养成分得以充分释放。、
所述Tris-HCl溶液中Tris是指三羟甲基氨基甲烧，Tris-HCl溶液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。Tris-HCl溶液被用于不同pH条件下的蛋白质晶体生长。Tris-HCl溶液的低离子强度特点可用于线虫(C. elegans)核纤层蛋白(Iamin)的中间纤维的形成。Tris-HCl溶液也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一。所述浸提系指将药材中的可溶物转移到适宜溶剂中的过程。本发明的浸提方法为浸溃法。所述盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。所述蛋白质盐析是指向蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后，可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用叫作盐析，可复原。水的多次蒸馏可以提高水的电阻率，比如自来水电阻率为1900欧姆。一次蒸馏水的电阻率为0. 35兆欧，二次为I. 0兆欧，三次为I. 5兆欧，28次为16兆欧，根据实验用水的不同要求可以选择不同的多次蒸馏水。主要看实验类型，要求用一次水的实验可以用二次水，要求不严。所谓的二蒸水，一般多用于常规的化学检验，三蒸水，一般多用于生物和医疗上的检验。所述透析是指穿过膜的选择性扩散过程。可用于分离分子量大小不同的溶质，低于膜所截留阈值分子量的物质可扩散穿过膜，高于膜截留阈值分子量的物质则被保留在半透膜的另一侧。所述复溶是指用蒸馏水对粗蛋白粉重新溶解，并调节相应的蛋白液体浓度。在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。进一步，在步骤2)与步骤3)之间还包括以下步骤将步骤2)的步骤再重复一遍或者两遍，得到分离液，并与步骤2)中得到的分离液合并。进一步，所述松花粉为马尾松、油松、黄山松、白皮松、红松、华山松中的任意一种或几种的花粉。采用上述进一步方案的有益效果是，所述松花粉有以下功效I、抗疲劳松花粉可直接补充营养，也可通过改善消化功能，从食物中摄取营养，为身体补充能量，增加耐力，使之不易疲劳。松花粉还能调整神经系统，缓解精神和工作压力，解除各种负担造成的以及中老年人的易疲劳。松花粉可降低体内乳酸水平，适合加班工人、备考学生、赛前运动员等劳动强度大、脑力劳动重者服用。
2、抗衰老松花粉所含微量元素、黄酮类、精氨酸、维生素C、E、胡萝卜素及硒等，均有清除体内自由基作用，可提高机体抗氧化酶 类(如铜锌超氧化物歧化酶等)的活性，抑制脂质过氧化反应，消除老年斑，延缓细胞衰老。松花粉使人返老还童的原因还在于，其多样化的活性营养物质相互作用，调整全身功能，保持机体组织青春活力，使智力聪颖不衰，从而延缓衰老，增加寿命。3、护肤与美容松花粉含有丰富的氨基酸和全部天然维生素以及多种酶，能增强皮肤代谢，增加皮肤弹性，延缓皮肤衰老。维生素C、E和B族维生素协调作用，能够活化细胞，清除自由基，阻断黄褐斑、蝴蝶斑的产生，消除皮肤黑色素，减少、去除青春痘，使得皮肤洁白美丽；同时，对亮发秀发也有较好的效果。松花粉对皮肤疾患有很好的治疗作用。未破壁的松花粉有很强的吸水性，可燥湿收敛止血，外用可祛风止血、爽身消炎，对皮肤无刺激、无过敏等副作用；对湿疹、黄水疮、皮肤糜烂、浓水淋漓、外伤出血、尿布性皮炎等有很好的治疗作用。尤其用于婴幼儿童护肤爽身，防治小儿皮肤湿疹，疗效佳、见效快。松花粉防治老年人皮肤瘙痒疗效显著，也可防治褥疮。4、控制体重松花粉营养平衡，富纤维而低热量，所含脂肪酸中72. 5%为不饱和脂肪酸，与维生素E协同作用，可双向调节人体胆固醇，使肌肉结实、体态匀称。松花粉中的纤维素含量高达29%，它一方面能产生饱腹感，减少食物摄入，避免营养过剩；一方面又在脂肪代谢过程中抑制和延缓胆固醇与甘油三酯在淋巴中的吸收；同时，纤维素能促进肠道功能，加快粪便排泄，解放军总医院与德国合作进行的研究与实验证实，松花粉使粪便中胆固醇排泄量增加0. 8倍，甘油三脂排泄量增加2倍，从碳12到碳22的十余种脂肪酸排泄量最多增加约7倍。松花粉中的卵磷脂还加速体内脂肪的燃烧，它的利尿特性也有助于减肥。5、健脑益智脑细胞比其他体细胞更敏感，其功能无时无刻不受营养的左右。松花粉充满容易
吸收的蛋白质、氨基酸和卵磷脂，还有维生素、糖类、各种微量元素和核酸，这些都可滋补大
脑和神经系统，为大脑提供能量，使之思维敏捷，注意力集中，提高记忆，长时间学习工作而
不累；还能改善睡眠，解除烦躁，缓解压力，调节情绪，对儿童少年智力发展、克服好动，备考
学生提高成绩帮助极大。对脑动脉硬化和老年痴呆造成的语迟、消沉、怪癖、健忘也十分有.、/■
Mo6、心脑血管养护心脑血管疾病是体内脂质代谢失衡，血脂和胆固醇含量过高所致。松花粉营养平衡，富纤维而低热量，所含脂肪酸中72. 5%为不饱和脂肪酸，与维生素E协同作用，可双向调节人体胆固醇，松花粉中高达29%的纤维素一方面可减少食物摄入，一方面又抑制和延缓胆固醇与甘油三酯的吸收；同时，松花粉又加快粪便排泄，将多余脂肪排出体外，解放军总医院与德国合作进行的研究与实验证实，松花粉使粪便中胆固醇排泄量增加0. 8倍，甘油三脂排泄量增加2倍，从碳12到碳22的十余种脂肪酸排泄量最多增加约7倍。松花粉中的卵磷脂能加速脂肪燃烧，镁可激活酶系统，黄酮类可降低血脂和胆固醇；各种维生素可增加血管壁弹性，芦丁能增加毛细血管的通透性，改善心脏和大脑的微循环，食用松花粉可强化机体新陈代谢，增加脑细胞活力，调节内分泌系统，降低血脂水平，改善心脏和大脑的微循环，预防和辅助治疗心脑血管疾病。7、调整肠胃功能松花粉天然含有近百种人体所需的酶和所有矿物质，能促进胃肠蠕动，促进消化和吸收，对食欲不振、胃肠功能紊乱有明显调节作用。松花粉中的镁及维生素B6，可镇静不随意肌，消除不随意肌痉挛引起的便秘。松花粉中的泛酸可保护肠道粘膜，愈合溃疡，对胃溃疡、十二指肠溃疡、萎缩性胃炎、腹泻、肠炎等有很好的修复作用，特别是患者对治疗上述疾病的药物过敏或产生抗药性的时候。8、保肝护肝肝脏是人体蛋白质最多的脏器，蛋白质不足易形成脂肪肝，进而发展肝硬化、肝癌。松花粉含有丰富的胆碱，胆碱乙酰化形成乙酰胆碱，可促进磷脂的合成，有效地抗脂肪肝。松花粉中的游离氨基酸，特别是蛋氨酸，是肝脏的特效药；黄酮类对肝脏也十分有益。松花粉能促进肝细胞活性，使胆汁分泌正常，防止肝病发生。 松花粉还能提高免疫功能，促进肝脏解毒，对肝细胞有很好的保护作用。此外，松花粉可预防过量饮酒造成的肝脏伤害，有助于受伤肝脏功能的康复。9、防癌与抗癌松花粉营养完全而平衡，可防止癌细胞因营养失衡，免疫力低下而发展成癌症；松花粉可帮助已病患者快速恢复体力，增加抗病能力。松花粉含有多种有效抗癌物质，如
胡萝卜素、VE和微量元素硒、锗、多糖类等，它们协同作用，双向调节低下或亢进的免疫功能，增强细胞的解毒能力，可加强肌体对致癌因素的抵抗力。放化疗对造血系统、消化系统及免疫系统危害很大，松花粉能迅速进入血液提高免疫系统活力，消除放化疗的毒副作用，如疲劳无力、厌食呕吐、泻痢及泌尿紊乱、头疼失眠、心动过速、发热出汗、脱发等。松花粉含有丰富的维生素、活性酶、生物素、微量元素等活性物质，可以协调肠胃功能，刺激骨髓造血，增加细胞解毒能力，使受到损伤的器官恢复正常。10、其他疾病服用松花粉还有以下功效前列腺患者服用松花粉症状有明显改善；糖尿病人短期内体力增强，配合药物治疗血糖稳步下降，直至正常并最终停药；松花粉滋阴壮阳、能提高性能力，治疗阳痿；松花粉可以协调肠胃功能，刺激骨髓造血，并提供造血原料。吃两个月松花粉，红血球可上升25 30%，血红蛋白上升15%，并且有提高血浆免疫球蛋白的作用；可清除过敏体质；可缓解关节疼痛，使强直的关节恢复功能；哮喘、鼻炎、神经衰弱等许多疾病有意想不到的效果。进一步，在步骤2)及步骤4)中，所述Tris-HCl溶液的pH值均为8 9。进一步，在步骤2)中，所述浸提的工艺条件为在4°C的温度下，搅拌浸提5 8小时。进一步，所述第一次离心的工艺条件为离心时间为1(T25分钟，转速为1000(Tl2000rpm。进一步,在步骤3 )中，所述搅拌的时间为3(T60min。进一步，在步骤3)中，所述对盐析液进行离心的工艺条件为离心时间为1(T20分钟，转速为 1000(Tl2000rpm。
进一步，在步骤4)中，所述进行透析的时间为3天，进行透析所用的透析袋分子量为 1000(Tl4000Da。进一步，在步骤6)中，所述蛋白液的浓度为39T5%，pH值为8 10 ;所述进行恒温水浴的水浴温度为50°C 60°C。进一步，所述加入碱性蛋白酶后，使得酶浓度达到0. 069T0. 08%,酶活达到4000U/g 6000U/g ;所述进行酶解的时间为2 4小时。所述U/g中U，表示酶的活力单位,酶活力(enzyme activity)也称为酶活性,是指酶催化一定化学反应的能力。比活每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位是U/mg。比活越高则酶越纯。 进一步，在步骤6)中，所述进行沸水浴的温度为95 100°C，时间为10分钟。进一步，在步骤6)中，所述第三次离心的工艺条件为离心时间为2(T30分钟，转速为 1000(Tl2000rpm。
具体实施例方式以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例I取破壁松花粉500g，按1:20的比例加入调好pH=8的Tris-HCl进行花粉蛋白质的浸提，4°C浸提5小时，浸提液用高速冷冻离心机低温离心lOmin、转速为lOOOOrpm，抽滤、去除杂质、浸提重复三次，合并浸提液。向浸提液缓慢添加固体硫酸铵粉末，逐渐使硫酸铵达到100%饱和度,进行蛋白质盐析,缓慢搅拌30min,低温离心,转速为IOOOOrpm,离心IOmin,收集沉淀物。向沉淀物中加入pH=8的Tris-HCl进行混勻,三蒸水透析3天,透析袋截留分子量为lOOOODa，收集透析内液，冷冻干燥，得到粗提蛋白粉51.32g。将粗提蛋白质用三蒸水复溶，蛋白浓度为3%，调pH=8，放置于50°C水浴锅中恒温水浴，加入适量碱性蛋白酶，酶浓度达到0. 06%,酶活达到4000U/g，酶解2小时，沸水浴IOmin灭活酶，离心20min，转速为IOOOOrpm,取上清，冷冻干燥得酶解肽类粉。实施例2取破壁松花粉500g，按1:30的比例加入调好pH=9的Tris-HCl进行花粉蛋白质的浸提，4°C下浸提6小时，浸提液用高速冷冻离心机低温离心20min，转速为12000rpm，抽滤，去除杂质，浸提重复三次，合并浸提液。向浸提液缓慢添加固体硫酸铵粉末，逐渐使硫酸铵达到100%饱和度,进行蛋白质盐析,缓慢搅拌30min,低温离心,转速为12000rpm,离心15min,收集沉淀物。向沉淀物中加入pH值为9的Tris-HCl进行混勻,三蒸水透析3天,透析袋截留分子量为14000Da，收集透析内液，冷冻干燥，得到粗提蛋白粉49.65g。将粗提蛋白质用三蒸水复溶，蛋白浓度为5%，调pH=10，放置于60°C水浴锅中恒温水浴，加入适量碱性蛋白酶，酶浓度达到0. 08%，酶活达到6000U/g，酶解4小时,沸水浴IOmin灭活酶,离心 20min，转速为12000rpm，取上清，冷冻干燥得酶解肽类粉。实施例3取破壁松花粉500g，按1:25的比例加入调好pH=8. 5的Tris-HCl进行花粉蛋白质的浸提，4°C下浸提8小时,浸提液用高速冷冻离心机低温离心25min,转速为IlOOOrpm,抽滤，去除杂质，浸提重复三次，合并浸提液。向浸提液缓慢添加固体硫酸铵粉末，逐渐使硫酸铵达到100%饱和度,进行蛋白质盐析，缓慢搅拌30min,低温离心,转速为IIOOOrpm,离心20min,收集沉淀。向沉淀中加入pH值为9的Tris-HCl进行混勻,三蒸水透析3天,透析袋截留分子量为12000Da，收集透析内液，冷冻干燥，得到粗提蛋白粉50.65g。将粗提蛋白质用三蒸水复溶，蛋白浓度为4%，调pH=10，放置于55°C水浴锅中恒温水浴，加入适量碱性蛋白酶，酶浓度达到0. 07%,酶活达到5000U/g，酶解3小时，沸水浴IOmin灭活酶，离心20min，转速为llOOOrpm，取上清，冷冻干燥得酶解肽类粉。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将所述松花粉进行破壁处理，得到破壁松花粉； 2)对步骤I)中得到的破壁松花粉依次进行Tris-HCl溶液浸提、第一次离心、抽滤，得到分离液， 其中，所述破壁松花粉与所述Tris-HCl溶液的体积百分比为I :20 30 ； 3)将固体硫酸铵粉末加入到步骤2)中得到的分离液中，至硫酸铵硫酸铵达到100%饱和度，再进行蛋白质盐析并进行搅拌，得到盐析液，再将所述盐析液进行离心，得到沉淀物； 4)向步骤3)中得到的沉淀物中再加入Tris-HCl溶液，不断搅拌至均匀，再进行三蒸水透析，得到透析内液； 5)对步骤4)中得到透析内液进行真空冷冻干燥处理，即得到所述粗蛋白粉； 6)对步骤5)中得到的粗蛋白粉用三蒸水复溶，得到蛋白液，调节蛋白液的浓度及pH值，再放入水浴锅中恒温水浴，再加入碱性蛋白酶，进行酶解，得到多肽混合液，再将酶解后的多肽混合液放入沸水浴中，钝化蛋白酶使其失活，取出后，迅速冷却，然后再进行第三次离心，取上清，冷冻干燥，即得酶解肽类。
2.根据权利要求I所述的从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法，其特征在于，在步骤2)与步骤3)之间还包括以下步骤将步骤2)的步骤再重复一遍或者两遍，得到分离液，并与步骤2)中得到的分离液合井。
3.根据权利要求I或2所述的从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法，其特征在于，所述松花粉为马尾松、油松、黄山松、白皮松、红松、华山松中的任意一种或几种的花粉。
4.根据权利要求I或2所述的从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法，其特征在于，在步骤2)及步骤4)中，所述Tris-HCl溶液的pH值均为8 9。
5.根据权利要求I或2所述的从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述浸提的エ艺条件为在4°C的温度下，搅拌浸提51小时；所述第一次离心的エ艺条件为离心时间为10 25分钟，转速为1000(Tl2000rpm。
6.根据权利要求I或2所述的从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述搅拌的时间为3(T60min ;所述对盐析液进行离心的エ艺条件为 离心时间为10 20分钟，转速为1000(Tl2000rpm。
7.根据权利要求I或2所述的从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述进行透析的时间为3天，进行透析所用的透析袋分子量为10000 14000Da。
8.根据权利要求I或2所述的从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法，其特征在于，在步骤6)中，所述蛋白液的浓度为39T5%，pH值为8 10 ;所述进行恒温水浴的水浴温度为50°C 60°C。
9.根据权利要求I或2所述的从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法，其特征在于，在步骤6)中，所述加入碱性蛋白酶浓度为0. 069T0. 08%,使得酶活性达到4000U/g 6000U/g ;所述进行酶解的时间为2 4小吋。
10.根据权利要求I或2所述的从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法，其特征在于 ，在步骤6)中，所述进行沸水浴的温度为95 100で，时间为10分钟；所述第三次离心的エ艺条件为离心时间为20 30分钟，转速为1000(Tl2000rpm。
全文摘要
本发明涉及一种从松花粉中分离制备粗蛋白及酶解肽类的方法，包括以下步骤将松花粉进行破壁处理，得到破壁花粉；再进行Tris-HCl溶液浸提、离心、抽滤，收集分离液；再加入固体硫酸铵粉末，进行蛋白质盐析、离心，收集沉淀物；然后再加入Tris-HCl混匀，三蒸水透析，收集透析内液；将收集到的透析内液进行真空冷冻干燥处理，得到所述粗蛋白粉；将得到的粗蛋白粉用三蒸水复溶，放置于水浴锅中恒温水浴，加入碱性蛋白酶，进行酶解，沸水浴灭活酶，离心取上清，冷冻干燥得酶解肽类。应用本发明技术制备的松花粉粗蛋白粉及其酶解肽类，具有很高的营养价值，易于人体吸收，可用作食品和保健食品的原料。
文档编号C07K1/14GK102659917SQ20121016431
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月24日 优先权日2012年5月24日
发明者杨长军, 王桐, 王金荣, 石丽花, 耿越, 陈文媛 申请人:山东师范大学, 烟台新时代健康产业有限公司