专利名称：抑血管生成素的药物用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体是涉及一种生物材料的药物用途，更具体地说，本发明研究了一种抑血管生成素作为抗炎药物有效成份的应用。
背景技术：
抑血管生成素(angiostatin),又称血管抑素、血管生成抑制素，是纤溶酶原(plasminogen)在体内的天然水解产物，能够有效抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和管状结构的形成而参与对血管生成(angiogenesis)的调节。血管生成是指从已经存在的血管生长出新的分枝血管的过程，该过程在胚胎发育组织器官形成中发挥重要作用，而在一般成体组织(除雌性生殖系统等组织)并不活跃。然而在某些病理条件下，如伤口愈合、炎症、肿瘤的生长和恶性转移、动脉粥样硬化时，却常常伴随活跃的血管生成过程。某一组织在某一特定时间是否能够进行血管生成取决于在本地环境中促血管生成因子和血管生成抑制·分子之间的平衡。目前为止，已经发现近30种内源性的血管生成抑制因子。抑血管生成素对血管生成的抑制作用，提示其作为一种特异性的针对血管内皮细胞的药物治疗与血管生成有关的疾病的可能性。1994年，哈佛医学院的Folkman实验室首次从肺癌转移模型小鼠的血清和尿液中分离得到一种抑血管生成素。由于纤溶酶原存在不同的裂解位点，因此在不同的细胞环境中会产生不同形式的抑血管生成素。抑血管生成素是在细胞膜上还是进入细胞内来完成其对内皮细胞的抑制作用，尚未见报道。无论是纤溶酶原还是纤溶酶在细胞膜表面都存在多种受体，然而它们并没有抑制血管生成功能，这说明抑血管生成素可能通过不同的细胞表面受体发挥作用。此外，不同的抑血管生成素以及不同的翻译后修饰过程都会导致抑血管生成素以不同的方式结合并将信号传递到胞内。除了细胞表面受体外，抑血管生成素也能结合胞外的某些分子如组织型纤溶酶原抑制因子，说明抑血管生成素也可以通过调节细胞周围的蛋白水解活性参与血管生成过程。肿瘤的生长和转移过程离不开血管生成，在过去几年里，大量的研究表明重组或纯化的抑血管生成素蛋白能显著抑制多种原发性肿瘤的生长。目前，关于抑血管生成素的临床应用已进入一期阶段。炎症是威胁人类健康的一种常见病和多发病。炎性反应是由多种介质参与、炎性因子与机体不断斗争直至达到一个平衡的复杂过程。目前抗炎药主要包括留体类抗炎药(steroia anti-inflammatory drugs, SAIDs)、非留体类抗炎药(non-steroiaanti-inflammatory drugs,NSAIDs)和中药。甾体类药物虽然有极好的疗效,但长期使用可引起水盐代谢和糖、脂肪、蛋白质代谢的严重紊乱；非留体类药物是目前临床上炎症治疗应用最广泛的药物，由于NSAIDs抑制了前列腺素(PGs)的合成，因此在起抗炎作用的同时，也造成了对胃肠道的副作用，主要表现为胃、十二指肠溃疡引起的上消化道出血；还可引起钠水潴留和水肿、高血症、肾病综合征并发间质性肾炎、肾功能不全、急性间质性肾炎、肾乳头坏死等严重的肾损害；亦可增加使用人群发生血栓性不良事件(心肌梗死、不稳定心绞痛、心脏血栓、猝死等)、充血性心力衰竭、高血压、冠心病等的风险；还可能发生肝损害、嗜睡、神情恍惚、头痛、头晕、耳鸣、视神经炎、哮喘、皮肤损害等其他不良反应；另外，从近几年的文献可以看出，对抗炎中药的研究还比较肤浅，对中药具体作用过程的了解还不够系统。肿瘤血管生成(angiogenesis)是指血管内皮细胞从现存的血管系统中分化、迁移而形成新的微血管的复杂生物学过程。成人的血管内皮细胞基本处于静止状态，在伤口愈合、组织修复、女性生育和月经期、胎儿发育等生理刺激下会生成新的血管，这属于生理性血管生成。此时的血管生成是处于刺激因子和抑制因子的严格控制和协调下，在有限时间内的一种有序的生理过程，增生的内皮细胞很快恢复为正常的静止状态。当血管生成调节机制失控和血管生成过度时，则成为致病因素，导致风湿性关节炎、糖尿病性或黄斑变性视网膜病变、婴儿血管瘤和恶性肿瘤等血管生成依赖性疾病的发生和发展。早在1971年，Folkman阐明了肿瘤血管生成在肿瘤发展、转移和扩散中的重要意义，并提出血管发生的抑制剂可能会成为一种新型的、有价值的肿瘤治疗手段。目前，破坏血管生 成在癌症研究中占据重要的地位。内源性和外源性的肿瘤血管生成抑制物为这类疾病的治疗提供新的临床用药方向。专利申请201010252717. 7公开了一种从尖吻蝮蛇蛇毒中提取的抑血管生成素结构及其制备方法，以及应用其制备的抗肿瘤药物，本发明对该结构的抑血管生成素的药用价值进行深入实验测量，发现其还具备新的抗炎特性，为抗炎药物的研制提供了一种新的途径和方向。
发明内容
本发明旨在解决现有抗炎药物研究中的技术发展停滞不前状态，提出一种新的抗炎药物研究方向。实现上述发明目的的技术方案为，抑血管生成素的药物用途，抑血管生成素作为活性成份制备抗炎药物中的应用。上述作为抗炎药物活性成份的抑血管生成素采用还原性SDS-PAGE法测定显示为两条带，分别称α链和β链，分子量分别为12000 22000道尔顿、9000 19000道尔顿，其中，α链的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，β链的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述作为抗炎药物活性成份的抑血管生成素经双向电泳后会分别产生与所述α链和β链对应的异构体各三个。上述作为抗炎药物活性成份的抑血管生成素的制备方法包括如下步骤
(a)将尖吻蝮蛇粗毒溶解于缓冲液中，其中蛇毒与缓冲液的体积比为I 2 10，离心得到上清液，这里所用的缓冲液是pH 7. O 9. 0，O. 01 O. lmol/L的Tris-HCl缓冲液，离心次数2次，离心速度为4000r/min,每次离心15min ；
(b)将所得上清液过二乙胺乙基阴离子交换层析柱进行层析，得到抑血管生成素粗溶液,层析具体为层析pH 6. O 9. O的O. 01 O. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液和O. 05 O. 6mol/L NaCl溶液作为洗脱液进行线性梯度洗脱，洗脱时间为1440min，洗脱流速5ml/min0(C)将杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体与亲和层析载体偶联，制备得免疫亲和层析柱，这里的亲和层析柱载体为4B琼脂糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶、羧甲基葡聚糖凝胶中的任意一种；
(d)用所得免疫亲和层析柱纯化步骤(b)所得抑血管生成素粗溶液，以洗脱缓冲液洗脱，收集得到抑血管生成素，所用洗脱缓冲液为PH2. O 4. 0,0. 01 O. 03 mo I/L的Gly-HCl缓冲液。本发明所研究发现的抑血管生成素作为一种新型的天然蛋白质类抗炎药物，其对身体不存在明显的毒副作用，具有广阔的应用前景，是传统抗炎药物研究在另一方面的开拓。
图I是根据本发明的抑血管生成素的制备工艺流程 图2是抑血管生成素对小鼠RAW 264. 7巨噬细胞的测量结果。
具体实施例方式本发明的技术方案主要是涉及抑血管生成素作为抗炎药物的药物用途，先根据具体实验测量详述确定其抗炎效果。(I)对大鼠后足急性炎症的治疗作用
采用向大鼠后足皮下注射炎性物质(包括角叉藻聚糖)的方法诱导大鼠后足急性炎症。在炎症诱导前的Ih 口服给予抑血管生成素(2. 5mg/kg)、卩引哚美辛(indomethacin,阳性对照药，10mg/kg)或溶媒(O. 5%羧甲基纤维素钠CMC)。炎症诱导时，向大鼠的右后足跖肌下组织注射溶于生理盐水中(O. 9% w/v NaCl)新鲜制备的角叉藻聚糖溶液(O. 1ml, 1% w/v)ο未注射的左后足作为对照。在炎症诱导前的Ih以及注射炎性物质后O. 5-6h所设的不同时间，使用容积测量器对每只动物的两只后足进行容积测定。按以下公式计算各大鼠在各时间点右后足容积的增加百分数(足部肿胀)增加百分数(％)= 100* (A-B)/B，A代表注射后各时间点的足容积，B代表注射前的足容积。与未给药的左足对照，注射角叉藻聚糖溶液后大鼠右后足产生了明显的炎症。该抑血管生成素对角叉藻聚糖诱导的大鼠急性足部肿胀效应的主要实验结果如下
权利要求
1.抑血管生成素的药物用途，其特征在于，抑血管生成素作为活性成份制备抗炎药物的应用。
2.如权利要求I所述的抑血管生成素的药物用途，其特征在于，作为抗炎药物活性成份的抑血管生成素采用还原性SDS-PAGE法测定显示为两条带，分别称a链和P链，分子量分别为12000 22000道尔顿、9000 19000道尔顿，其中，a链的氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示，P链的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.如权利要求2所述的抑血管生成素的药物用途，其特征在于，作为抗炎药物活性成份的抑血管生成素经双向电泳后会分别产生与所述a链和3链对应的异构体各三个。
4.如权利要求I至3任一项抑血管生成素的药物用途，其特征在于，作为抗炎药物活性成份的抑血管生成素的制备方法包括如下步骤 (a)将尖吻蝮蛇粗毒溶解于缓冲液中，其中蛇毒与缓冲液的体积比为I 2 10，离心得到上清液，这里所用的缓冲液是pH 7. 0 9. 0，0. 01 0. lmol/L的Tris-HCl缓冲液，离心次数2次，离心速度为4000r/min,每次离心15min ； (b)将所得上清液过二乙胺乙基阴离子交换层析柱进行层析，得到抑血管生成素粗溶液,层析具体为层析pH 6. 0 9. 0的0. 01 0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液和0. 05 0.6mol/L NaCl溶液作为洗脱液进行线性梯度洗脱，洗脱时间为1440min，洗脱流速5ml/min ； (C)将杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体与亲和层析载体偶联，制备得免疫亲和层析柱，这里的亲和层析柱载体为4B琼脂糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶、羧甲基葡聚糖凝胶中的任意一种； Cd)用所得免疫亲和层析柱纯化步骤(b)所得抑血管生成素粗溶液，以洗脱缓冲液洗脱，收集得到抑血管生成素，所用洗脱缓冲液为pH2. 0 4. 0,0. 01 0. 03 mo I/L的Gly-HCl缓冲液。
全文摘要
本发明公开了抑血管生成素的药物用途，抑血管生成素作为活性成份制备抗炎药物的应用，作为抗炎药物活性成份的抑血管生成素采用还原性SDS-PAGE法测定显示为两条带，分别称α链和β链，分子量分别为12000～22000道尔顿、9000～19000道尔顿，其中，α链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，β链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，经双向电泳后会分别产生与所述α链和β链对应的异构体各三个。本发明研究发现的抑血管生成素作为新型的天然蛋白质类抗炎药物，其对人身体不存在明显的毒副作用，具有广阔的应用前景，是传统抗炎药物研究在另一方面的开拓。
文档编号C07K14/435GK102847137SQ20121022443
公开日2013年1月2日 申请日期2012年7月2日 优先权日2012年7月2日
发明者李小羿, 张国辉, 戴向荣, 凌娟, 吴艳, 胡代娣 申请人:兆科药业(香港)有限公司