专利名称：桉树pgef12基因及其植物表达载体、宿主细胞和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因及其应用，特别是涉及桉树PGEF12基因及其植物表达载体、宿主细胞和其在促进植物营养生长和提高植物生长量上的应用。
背景技术：
林木在净化大气、防风固沙、保持水土、维持生态平衡和生物多样性、提供优质木材和高产优质林果等方面发挥着重要的作用，具有巨大的生态效益、社会效益和经济价值。林木等木本植物基因资源丰富，遗传多样性复杂，带有许多具有潜在应用价值但目前尚未得到充分发掘和有效分离的基因。近年来随着分子生物学、分子遗传学、基因组学和生物信息学等学科的发展，文库构建和筛选技术、基因克隆技术和高通量测序技术等技术的建立
和改进，越来越多的林木基因得到分离和鉴定，为林木的分子育种与以及林木优良基因的发掘和应用奠定了基础(李少锋等人，植物学报46(1): 79-107(2011))。目前，对已分离的林木基因的功能鉴定主要采用以下方法1)与模式植物的同源基因或功能已经过鉴定的基因进行相似性比较，建立进化树；2)对蛋白质结构与和功能进行预测分析；3)通过转录水平或蛋白表达水平的分析方法，例如半定量或定量RT-PCR、Western Blotting等，研究目的基因的时空表达以及对环境因子的响应；4)把基因的与适当的元件相连接制作成表达盒，并组装到相应的植物表达载体，通过遗传转化技术将表达盒转化到模式植物或来源物种中，从而改变目标基因在宿主中的表达量，如因过量表达而表达上调，或因反义抑制或者RNA干扰而表达下调，并而通过观察转基因植株的性状，研究基因的功能(何光源等人，植物基因工程，清华大学出版社(2007);王关林等人，植物基因工程，科学出版社(2009))。对于模式植物，一般选用为拟南芥(Arabidopsis thaliana)或者烟草(Nicotianatabacum)。 Mouradov 等(Proceedings of the National Academy of Sciences 95:6537-6542 (1998))将在辐射松(Pinus radiata)的/^方规7 OVZ7)，一个与拟南芥的Z说/TUFY) /FLORICAULA基因高度同源的基因转入拟南芥，发现转入的植株可以互补发育途径中对应基因的LFY缺失，从而表明NLY与FLY的在功能上的相似性。Sonoda等(Plant Biotechnology 26: 115-120 (2009))将赤桉HD-Zip class II 转录因子EcHBl 基因转入烟草，转基因植株纤维长度和干重增加，叶片、根和茎的生长量均高于对照。这两种植物的遗传背景清楚，遗传转化系统也较为成熟，尤其是拟南芥，作为基因组最早被测序的植物，其基因组序列、代谢途径以及生长发育的分子机制等方面有大量的研究，能为转基因后代的性状和机理分析提供较为完善的参考数据。因此，通过遗传转化模式植物的方法鉴定基因功能的结果可信性高，所得的结果距离分子育种的应用比较接近。桉树是桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)的总称。作为一种集观赏、用材、纸浆原料、药用于一体的优良树种，桉树由于其生长速度快、移栽成活率高等优点，得到广泛的种植。通过分子生物学及基因组学手段筛选及鉴定桉树的优良基因，并从中发掘具有能促进植物营养生长和提高植物生物量应用价值的基因，除了可通过基因工程改造获得高产优良桉树品种奠定基础外，还可以为其他林木、蔬菜及作物的分子育种提供优良的基因资源。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种桉树PGEF12基因及其植物表达载体、宿主细胞和在促进植物营养生长和提高植物生长量上的应用，以有效促进植物营养生长，提高植物生物量。为解决上述技术问题，第一方面，本发明提供一种桉树PGEF12基因，其cDNA序列具有如下特征
核苷酸序列为SEQ ID NO: I所示的DNA序列；或者 编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2的多肽。第二方面，本发明还提供一种植物表达载体，其包含如上所述的桉树PGEF12基因 或其片段。进一步地，所述植物表达载体为pCAMBIA1301。优选地，所述植物表达载体为重组载体 pCAMBIAl301-PGEFl2。第三方面，本发明还提供一种宿主细胞，其包含如上所述的桉树PGEF12基因或其片段或者如上任一项所述的植物表达载体。进一步地，所述宿主细胞选自大肠杆菌、农杆菌或植物细胞。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞选自大肠杆菌Transl-Tl菌株、农杆菌GV3101菌株或双子叶植物的细胞。第四方面，本发明还提供一种如上所述的基因、植物表达载体或宿主细胞在促进植物营养生长和提高植物生物量方面的应用，具体是将所述基因或其片段和/或植物表达载体转化入植物，或者用所述宿主细胞感染植物。在一个实施方案中，通过本领域公知的方法，例如根癌农杆菌介导的转化法，基因PGEF12或重组载体pCAMBIAl301-PGEFl2被转化入植物，该植物的转化后代与未导入基因PGEF12或重组载体pCAMBIAl301-PGEFl2的对照植物相比，叶片等营养器官的生长得到促进，表现为叶片数增多，植株直径增大，同时地上部分生长量得到提高。在第二个实施方案中，通过本领域公知的方法，例如根癌农杆菌介导的转化法，基因PGEF12或重组载体pCAMBIAl301-PGEFl2被转化入植物，该植物的转化后代与未导入基因PGEF12或重组载体pCAMBIAl301-PGEFl2的对照植物相比，根的生长得到促进，表现为根的长度增加。在第三个实施方案中，通过本领域公知的方法，例如根癌农杆菌介导的转化法，基因PGEF12或重组载体pCAMBIAl301-PGEFl2被转化入植物，该植物的转化后与未导入基因PGEF12或重组载体pCAMBIAl301-PGEFl2的对照植物相比，在组培条件下营养生长得到促进，生长量得到提高。通过采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果通过实验证实，本发明提供的源于桉树的PGEF12基因及其编码的多肽具有促进植物营养生长和提高植物生物量的功能。具体来说，在植物中提高PGEF12的表达量可以增加植物叶片数、植株直径，促进根的生长，以及提高生物量。与现有技术相比，本发明的技术方案可应用于提高林木、蔬菜和经济作物的产量。
上述的营养生长是指植物在发育的营养期(Vegetative Phase of Development)的生长发育过程。这个过程从胚胎发生开始，一直延续至植物的整个生长周期，包括种子萌发和幼苗形成、根和茎的延长和分支、叶片的形成与延伸，以及根和茎的次生加厚(Taiz等人，Plant Physiology, Sinauer Associates,第三版(2002) ；Leyser 等人，Mechanismsin Plant Development, Blackwell Science Ltd. (2003)X
图I是PGEF12编码的多肽的氨基酸序列利用NCBI网站的⑶-Search检索蛋白保守域数据库(CDD v3. 05 - 42589 PSSMs)输出的结果。图2是未转化的Col-O拟南芥和过表达PGEF12拟南芥植株在移栽后28天的地上部分生长状况对比照片。图3是未转化的Col-O拟南芥和过表达PGEF12拟南芥植株在移栽后28天的莲座直径和叶片数统计柱状图。图4是未转化的Col-O拟南芥根生长状况的照片。图5是过表达PGEF12拟南芥植株根生长状况的照片。图6是是未转化的Col-O拟南芥和过表达PGEF12拟南芥幼苗的根长统计柱状图。
具体实施例方式下面通过具体实施例并参照附图对本发明进行更详细的说明。应该理解的是，以下所述的实施例仅是用于说明而不是限制本发明。一、PGEF12基因的克隆与序列分析
I.桉树cDNA的制备
选取新鲜的桉树(Mucalyptus)叶片，例如桉属尾巨桉品种DH32-29 {EucalyptusurophyllaXgrandis cv DH32-29)叶片,迅速放入液氮中冷冻,然后放入-80° C超低温冰箱(SANY0，MDF-382E)中保存备用。根据现有的十六烧基三甲基溴化胺(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide, CTAB)提取法(Chang 等人，Plant Molecular Biology Reporter 11(2): 113-116 (1993))提取桉树叶片总RNA。使用不含RNA酶的DNA酶(Takara，目录号D2270A)处理提取的RNA以清除里面混杂的的基因组DNA。取约5 U g的桉树叶片组织总RNA,采用反转录试剂盒，如Invitrogen公司的SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (目录号 18080-051),合成桉树cDNA (DNA序列如SEQ ID NO: I所示)。合成的cDNA于-20° C保存备用。2.聚合酶链式反应法扩增PGEF12基因
根据聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)方法(Mullis 等人，ColdSpring Harbor symposia on quantitative biology 51: 263-273 (1986)),使用高保真热聚合酶，如 invitrogen 的 Platinum Pfx DNA Polymerase (目录号11708-039)或者T0Y0B0的KOD FX (目录号KFX_101X5)，设计带有含酶切位点接头的引物，所述引物对应的序列是SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4，以上述桉树cDNA为模板，克隆PGEF12基因。PCR产物可在1%琼脂糖凝胶电泳后切下目的条带，并使用TaKaRa的MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3. 0 (目录号D823A)回收纯化。回收的片段使用平末端克隆试剂盒连接到克隆载体，例如pEASY-Blunt Cloning Kit (全式金，目录号CB101)，转化大肠杆菌后，将阳性菌落送生工生物工程(上海)有限公司测序。选取测序正确的单菌落保存。3. PGEF12基因保守区域分析
使用诸如 CD-Search (保守结构域搜索(Conserved Domain Search) ；Marchler-Bauer等人，Nucleic Acids Research 39 (D) : 225-229 (2011);也参见美国国家卫生研究院(National Institutes of Health, NIH)国立医学图书馆(National Libraryof Medicine, NLM)的国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation, NCBI)的万维网网址上对CD-Search及保守结构域数据库(Conserved DomainDatabase)的解释)之类的分析工具，对PGEF12编码的多肽序列(氨基酸序列为SEQ IDNO:2)进行保守结构域分析。图I展示了利用⑶-Search以一种算法在⑶D数据库里面检索的结果。
二、PGEF12过表拟南芥植株的获得及其地面部分营养生长状态的观察
1.重组载体pCAMBIA1301-PGEF12的构建
通过使用工具酶进行质粒双酶切、目的片段回收和连接，将PGEF12克隆至植物表达载体，如PCAMBIA1301，使得该基因位于启动子如CaMV 35S启动子的控制下。按照以下操作方法实施，详细的步骤可根据本领域技术人员已知的方法进行修改使用SanPr印柱式质粒小量抽提试剂盒(生工生物工程(上海)有限公司，目录号SK8192)从上述转化的大肠杆菌中提取含有PGEF12的重组质粒，使用限制性内切酶汝~/11(NEB,目录号(NEB,目录号R0532)进行双酶切;另取pCAMBIA1301质粒，使用BgIll和&7I进行双酶切。酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，分别切下大小约为800bp的PGEF12和大小约为10000 bp的pCAMBIA1301骨架条带，并使用MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit Ver. 3. 0 (Takara,目录号D823A)回收。将上述两个片段按照PGEF12:pCAMBIA1301的摩尔比为3:1混合，使用T4 DNA连接酶(Fermentas，目录号#EL0011)进行连接后转化大肠杆菌，将阳性菌落送生工生物工程(上海)有限公司测序。选取测序正确的单菌落使用SanPrep柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒，所得的质粒即为重组载体 pCAMBIAl301-PGEFl2。2.拟南芥的遗传转化及转化后代的筛选
2.I含有重组载体pCAMBIA1301-PGEF12的根癌农杆菌GV3101细胞的制备
按照本领域技术人员熟知的方法(Wang等人，Agrobacterium Protocols, HumanPress,第2版(2006))，制备根癌农杆菌GV3101的感受态细胞，并使用热激转化法将重组载体pCAMBIAl301-PGEFl2转化根癌农杆菌，制备含有pCAMBIAl301-PGEFl2的根癌农杆菌GV3101 细胞。2. 2拟南芥的遗传转化及转化后代的筛选
取拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型Columbia-O (Col-O)种子，以本领域技术人员熟知的方法(Weigel D 等人，Arabidopsis: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press (2002))将种子播种在培养土进行种植。种植环境温度20-23°C，湿度 70-85%，光照 16 h/天，光照强度 4500 Lux。
以现有的蘸花浸染法(Zhang等人，Nature Protocols 1(2): 641-646 (2006))转化拟南芥及从后代中筛选阳性植株。根据该方法，转化后当代收获的种子为Tl代转基因种子。取拟南芥Tl代转基因种子消毒后在含有50 mg/L潮霉素B (Hygromycin B),l%鹿糖和 0. 8 g/L 的 Murashige and Skoog 培养基(MS 培养基；Murashige 等人，PhysiologiapIantarum 15(3) : 473-497 (1962))上筛选培养12天，能正常生长发育的幼苗即为转基因阳性Tl代植株。将转基因阳性Tl代植株幼苗小心转移到培养土上，于上述培养条件中培养，植株成熟后收获的种子即为T2代转基因种子。为了进一步确认阳性转基因植株，可使用PCR法(Mullis等人，Cold SpringHarbor symposia on quantitative biology 51: 263-273 (1986))对筛选得到的阳性植株进行分子鉴定。在幼苗长出8-10片叶片后，取一片约I cm长的叶片提取基因组DNA作为模板，设计扩增超霉素磷酸转移酶基因(Hygromycin phosphotransferase, hpt)的特异引物，如hpt-F3 (SEQ ID N0:5WPhpt-R3 (SEQ ID NO:6)对hpt基因进行扩增，能成功扩增出约750 bp条带的样品对应的植株可确定为阳性转基因植株。 3. PGEF12过表拟南芥植株地面部分生长状态的观察
取上述T2代转基因种子，消毒后在含有25 mg/L潮霉素B，1%蔗糖和0.8 g/L琼脂的的MS培养基上筛选培养12天，能正常生长发育的幼苗即为转基因阳性T2代植株。另取非转基因Col-O拟南芥种子消毒后在营养成分相同但不含潮霉素B的MS培养基上培养12天，作为对照。选取形态正常的阳性转基因幼苗和对照幼苗分别小心转移到培养土上，于前述的培养条件中培养。移栽28天后统计植株莲座直径和叶片数(样本量>15)，并拍下生长状况的照片。根据统计，过表达PGEF12的拟南芥转化后代(PGEF12-T2)植株相比起未转化的Col-O植株，莲座直径和叶片数均有显著增加，如图2所示。其中莲座直径PGEF12-T2为7. 0±0. 7cm, Col-O 为 5. 2± I. I cm ;叶片数 PGEF12-T2 为 18. 9±2. 6 片，Col-O 为 14. 5±3. 8 片，如图3所示。在t test中，P值〈O. 01，说明PGEF12-T2植株较未转化植株在这两个指标上有明显提闻。三、PGEF12过表达拟南芥植株根系生长表型
过表达PGEF12的拟南芥转基因种子可根据以上所述的方法获得。并可使用垂直平板检测分析过表达PGEF12的拟南芥植株根系生长表型。取上述T2代转基因种子，消毒后点播于有25 mg/L潮霉素B，0. 5%蔗糖和0. 8至1% Phytagel的垂直MS培养基平板上，每个平板点10个种子。另取非转基因Col-O拟南芥种子消毒后点播于相同营养成分但不含潮霉素B的垂直MS培养基平板上，每个平板点10个种子，作为对照。接种后的平板摆放在温度20-23°C，湿度70-85%，光照16 h/天，光照强度2000 Lux的环境中培养。培养12天后统计幼苗的根长(样本量>15)，并拍下生长状况的照片。如6所示，根据统计，PGEF12-T2幼苗根长为4. 6±0. 4 cm, Col-O幼苗根长为3. 2±0. 6 cm。在t test中，P值〈O. 01，说明PGEF12-T2植株较未转化植株幼苗的根长有显著增加。四、PGEF12过表达拟南芥植株无菌培养条件下的生长状态 过表达PGEF12的拟南芥转基因种子可根据以上所述的方法获得。取上述T2代转基因种子，消毒后在含有25 mg/L潮霉素B，1%蔗糖和0.8 g/L琼脂的的MS培养基上筛选培养12天，能正常生长发育的幼苗即为转基因阳性T2代植株。另取非转基因Col-O拟南芥种子消毒后在营养成分相同但不含潮霉素B的MS培养基上培养12天，作为对照。选取形态正常的阳性转基因幼苗和对照幼苗分别小心转移到培养瓶中， 所述的培养瓶为直径8 cm、高12 cm的玻璃广口瓶，内有60 ml含有1%蔗糖和0. 8 g/L琼脂的的MS培养基，使用通气的瓶盖。培养瓶摆放在温度20-23°C，湿度70-85%，光照16 h/天，光照强度3500 Lux的环境中培养。培养35天后统计植株的鲜重(样本量>15)。根据统计，？6已卩12-丁2植株鲜重3.44±0.5 g, Col-O植株鲜重2. 88±0. 3 g。在t test中，P值〈O. 01，说明PGEF12-T2植株较未转化植株在组培条件下，生物量(鲜重)有显著增加。
权利要求
1.一种桉树PGEF12基因，其特征在于，其cDNA序列具有如下特征 具有SEQ ID NO: I所示的DNA序列；或者 其编码具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的多肽。
2.一种植物表达载体，其特征在于其包含如权利要求I所述的桉树PGEF12基因或其片段。
3.根据权利要求2所述的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体为PCAMBIA1301。
4.根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为重组载体pCAMBIAl30I-PGEFl2。
5.一种宿主细胞，其特征在于包含如权利要求I所述的桉树PGEF12基因或其片段或者如权利要求2 4中任一项所述的植物表达载体。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞选自大肠杆菌、农杆菌或植物细胞。
7.—种如权利要求I所述的基因在促进植物营养生长和提高植物生物量方面的应用，其特征在于，将所述基因或其片段转化入植物。
8.—种如权利要求2或3或4所述的植物表达载体在促进植物营养生长和提高植物生物量方面的应用，其特征在于，将所述植物表达载体转化入植物。
9.一种如权利要求5或6所述的宿主细胞在促进植物营养生长和提高植物生物量方面的应用，其特征在于，用所述宿主细胞感染植物。
全文摘要
本发明提供一种桉树PGEF12基因，其cDNA序列具有如下特征具有SEQIDNO:1所示的DNA序列；或者其编码具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽。本发明还提供一种植物表达载体，其包含如上所述的桉树PGEF12基因或其片段。本发明还提供一种宿主细胞，包含如上所述的桉树PGEF12基因或其片段或如上所述的植物表达载体。本发明还提供上述基因、植物表达载体或宿主细胞在促进植物营养生长和提高植物生物量方面的应用，具体是将所述基因或其片段和/或植物表达载体转化入植物，或者用所述宿主细胞感染植物。通过在植物中提高PGEF12的表达量可增加植物叶片数、植株直径，促进根的生长，以及提高生物量。本发明的技术方案可应用于提高林木、蔬菜和经济作物的产量。
文档编号C07K14/415GK102757970SQ20121027122
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者孙长斌, 李奕恒, 许文钊 申请人:普罗米绿色能源(深圳)有限公司