专利名称：固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法
技术领域：
本发明涉及八肽胆囊收缩素(辛卡利特包括醋酸盐、三氟乙酸盐)的制备方法，尤其涉及固相法和液相法相结合合成八肽胆囊收缩素的方法。
背景技术：
八肽胆囊收缩素，也称辛卡利特，英文名=Sincal ide 结构式H-ASP-TYR(S03H) -MET-GLY-TRP-MET-ASP-PHE-NH权利要求
1.固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是具体包含以下步骤 I).液相法合成L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺将N-(叔丁氧羰基)-L-苯基丙氨酸用有机溶剂溶解，然后C端酰胺化得到N-(叔丁氧羰基)-L-苯丙酰胺，再和芴甲氧羰基-天冬氨酸-4-叔丁脂加激活试剂反应，反应得到N-(9芴甲氧羰基)L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺，然后用哌啶脱芴甲氧羰基保护，萃取，旋蒸，结晶得到L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺； 2).固相法合成八肽胆囊收缩素全保护片段将N-(9芴甲氧羰基)-蛋氨酸用有机溶剂溶解加到二氯三苯基树脂中，再加有机碱，室温反应2-3小时，完毕后，用甲醇封闭，用布氏漏斗过滤氨基酸树脂，再用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇依次洗涤收缩，把做完的树脂放到固相反应器中，溶胀，然后加脱保护液脱保护，然后洗涤，加入片段的第二个具有芴甲氧羰基保护基团的氨基酸和激活试剂反应，控温反应1-2个小时，凯撒试验检测，反应完全后，脱芴甲氧羰基保护，依次往下偶联，最后得到八肽胆囊收缩素全保护片段肽树脂； 3).弱酸切割全保护片段往八肽胆囊收缩素全保护片段肽树脂中加入适量的弱酸切割液，室温切割，得到八肽胆囊收缩素全保护片段； 4).液相缩合全保护片段和二肽片段得到全保护八肽胆囊收缩素八肽胆囊收缩素全保护片段与之前的L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺，再加I-羟基-苯并-三氮唑以及N-甲基吗啡啉和N，N- 二异丙基乙胺中的一种，冰浴下搅拌，加入缩合剂，反应后撤掉冰浴，室温搅拌过夜后得到全保护八肽胆囊收缩素； 5).切割将全保护八肽胆囊收缩素加入切割液切割，然后加入冰乙醚沉淀得到八肽胆囊收缩素粗品； 6).粗品通过高相液相色谱纯化，制备，旋蒸，冻干得到八肽胆囊收缩素精品采用C18类型的反相分离设备纯化八肽胆囊收缩素粗品。
2.根据权利要求I所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤I)所述的有机溶剂为四氢呋喃，激活试剂为N，N-二异丙基碳化二亚胺和I-羟基-苯并-三氮唑的混合试剂，所述的C端酰胺化是以N-甲基吗啡啉作为有机碱，然后滴加氯甲酸乙脂作为羧基活化试剂，加氨水反应。
3.根据权利要求I所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤2)所述二氯三苯基树脂替代度在0. 9-1. 2mmol/g,所用的有机溶剂为二氯甲烷，所用的有机碱为N，N-二异丙基乙胺，投料比为N-(9芴甲氧羰基)-蛋氨酸二氯三苯基树脂N，N-二异丙基乙胺的体积比0. 6:1:2. 5 ;所述的脱保护液为质量百分含量为20%的哌啶和N，N-二甲基甲酰胺。
4.根据权利要求I所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤2)脱保护反应时间为5min+15min。
5.根据权利要求I所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤2)所述具有芴甲氧羰基保护基团的氨基酸，分别为N-(9芴甲氧羰基)-色氨酸、N-(9芴甲氧羰基)_甘氨酸、N-(9芴甲氧羰基)_蛋氨酸、N-(9芴甲氧羰基)-磺酸钠盐酪氨酸、芴甲氧羰基-天冬氨酸-4-叔丁脂，激活试剂选择N，N-二异丙基碳化二亚胺/I-羟基-苯并-三氮唑、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯/I-羟基-苯并-三氮唑、0-苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲四氟硼酸/I-羟基-苯并-三氮唑或六氟磷酸苯并三唑-I-基-氧基三吡咯烷基磷/I-羟基-苯并-三氮唑混合试剂中的一种，偶联反应中的有机碱为N，N-二异丙基乙胺或N-甲基吗啡啉。
6.根据权利要求I所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤2) —次偶联反应完毕和脱芴甲氧羰基保护后，都需要用凯撒试验检测，凯撒试验为三种溶剂A:质量百分含量为5%的茚三酮乙醇溶液、B :质量百分含量为80%的苯酚乙醇溶液、C :重蒸吡啶。
7.根据权利要求I所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤3)所述弱酸溶液为质量百分含量为1%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液或者醋酸三氟乙醇二氯甲烷体积比=2:2:6的混合液。
8.根据权利要求I所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步 骤4)所述缩合试剂为二环己基碳二亚胺。
9.根据权利要求I所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤5)所述切割液三氟乙酸三已丙基硅烷H20体积比=95:3:2，切割需要冰浴控制在0-10℃。
10.根据权利要求I所述固相法和液相法结合合成八肽胆囊收缩素的方法，其特征是步骤6)具体为 将八肽胆囊收缩素粗品溶于质量百分含量为25%的乙腈水溶液中，过滤，滤液经C18色谱柱纯化，流动相有两种A :质量百分含量为0. 1%的三氟乙酸+质量百分含量为99. 9%的乙腈:质量百分含量为0. 1%的三氟乙酸+质量百分含量为99. 9%的H2O ;梯度259^35% ；流速为110ml/min，检测波长为220nm，然后转醋酸盐，悬蒸浓缩小体积冻干，获得成品。
全文摘要
本发明涉及八肽胆囊收缩素的制备方法，尤其涉及固相法和液相法相结合合成八肽胆囊收缩素的方法。主要解决现有合成方法存在中间产物分离麻烦、制备周期长且反应中容易产生副产物、成本高、产率较低等技术问题。技术方案为合成方法包括以下步骤1)液相法合成L-天冬氨酰-4-叔丁基酯-苯丙酰胺；2)固相法合成八肽胆囊收缩素全保护片段；3)弱酸切割全保护片段；4)液相缩合全保护片段和二肽片段得到全保护八肽胆囊收缩素；5)切割将全保护八肽胆囊收缩素加入切割液切割，然后加入冰乙醚沉淀得到八肽胆囊收缩素粗品；6)粗品通过高相液相色谱纯化，制备，旋蒸，冻干得到八肽胆囊收缩素精品。本发明用于八肽胆囊收缩素的制备。
文档编号C07K1/02GK102775471SQ20121027387
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者徐红岩, 沈永刚 申请人:上海吉尔多肽有限公司, 吉尔生化(上海)有限公司, 滨海吉尔多肽有限公司