专利名称：一种从赭色小莫勒菌中提取杜斯塔宁的方法
技术领域：
本发明涉及一种从赭色小莫勒菌中提取杜斯塔宁的方法。
背景技术：
赭色小莫勒菌{Moelleri ella ochracea )为子囊菌门、分菌纲、肉座菌目、麦角菌科、莫勒菌属，它是粉虱的重要病原真菌，以往充分利用其对粉虱的自然控制作用，在生物防治方面取得了显著效果，随着对该菌研究的全面深入，人们已从其代谢产物中分离、纯化出一些有活性的物质，如杜斯塔宁，其分子式C3tlH5tlO2,分子量444，是三萜类五元碳环物质，具有抗结核杆菌的作用，IC50=12. 5ug/ml，可见，莫勒菌在医学上具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的是公开一种从赭色小莫勒菌中提取杜斯塔宁的方法，以促进其药理学的进一步研究和临床上更好的开发和应用。本发明采取的技术方案如下
一种从赭色小莫勒菌中提取杜斯塔宁的方法，包括以下步骤
1)赭色小莫勒菌活化后，取菌块接种PDB培养基中，在120 160r/min、20 28°C条件下连续培养5 10天即初级培养，按8% 10%接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120 160r/min、20 28°C条件下连续培养25 30天即次级培养；
2)将菌液和菌丝体分离，菌丝体在28-35°C下干燥后研磨成粉状，加I 2倍体积的乙酸乙酯浸泡10 14小时，超声20 40分钟，浸泡液旋蒸得菌丝体浸膏，回收乙酸乙酯；菌液用乙酸乙酯萃取，萃取液旋蒸浓缩得菌液浸膏，回收乙酸乙酯；
3)将菌丝体浸膏和菌液浸膏合并，上200 300目硅胶柱，以石油醚和丙酮梯度洗脱，收集石油醚丙酮体积比=20:1部分洗脱液，旋蒸浓缩，氯仿溶解，溶解液自然挥干，再经甲醇重结晶得杜斯塔宁。所述菌液用乙酸乙酯萃取具体操作为将菌液与乙酸乙酯按体积比I :1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取20 40min,静止12 24小时,萃取1_3次。所述超声的功率为300 500W，频率为30 40KHz。所述PDB培养基的制备为200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L。本发明的显著优点
1)原料取材简单；
2)提取步骤简单，成本低；
3)制得的化合物纯度高。
图I为提取的杜斯塔宁的纯度验证图。
具体实施例方式实施例I
O取赭色小莫勒菌(邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现.菌物学报，2009. 28(1):148-150)为材料，无菌条件下挑取长宽约为Icm的菌块到PDB培养基(200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，在121°C高压下灭菌25min)中，在160r/min、25°C条件下连续培养8天即初级培养，按9%接种量再次转接到PDB培养基中，继续在160r/min、25°C条件下连续培养28天即次级培养；
2)将菌液和菌丝体分开，菌丝体在室温下干燥之后研磨成粉状，加2倍体积(w/v)的乙酸乙酯浸泡12小时，超声30分钟，浸泡液旋蒸得浸膏，回收乙酸乙酯；将菌液与乙酸乙酯按体积I :1混合、倒入分液漏斗中，摇瓶萃取30min，静止16小时，倒出乙酸乙酯，将其旋蒸浓缩得菌液浸膏，回收乙酸乙酯。·3)合并菌液浸膏和菌丝体浸膏，氯仿溶解浸膏，上200目硅胶柱，以石油醚丙酮体积比=50-10:1梯度洗脱，收集石油醚丙酮体积比=20:1部分洗脱液。旋蒸浓缩，氯仿溶解洗出，自然挥干，甲醇重结晶得赭色小莫勒菌中的杜斯塔宁。4)杜斯塔宁的纯度通过点硅胶板来验证，如图I所示。展开剂为甲醇二氯甲烷体积比=1:20, Rf=O. 43,据文献(Isaka M, Hywel-Jones NL, Sappan M, MongkolsamritS， Saidaengkham S. Hopane triterpenes as chemotaxonomic markers for the scaleinsect pathogens Hypocrella s. lat. and Aschersonia. Mycological Research,2009，113(4) :491-497)可以确定得到的纯度为99%的杜斯塔宁。提取率3. 23%(提取率％=纯杜斯塔宁重量/菌液浸膏和菌丝体浸膏总量X 100%)。实施例2
O取赭色小莫勒菌(邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现.菌物学报，2009. 28(1):148-150)为材料，无菌条件下挑取长宽约为Icm的菌块到PDB培养基(200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，在121°C高压下灭菌25min)中，在120r/min、20°C条件下连续培养5天即初级培养，按8% %接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120r/min、20°C条件下连续培养25天即次级培养；
5)将菌液和菌丝体分开，菌丝体在室温下干燥之后研磨成粉状，加I倍体积(w/v)的乙酸乙酯浸泡10小时，超声20分钟，浸泡液旋蒸得浸膏，回收乙酸乙酯；将菌液与乙酸乙酯按体积I :1混合、倒入分液漏斗中，摇瓶萃取20min，静止12小时，倒出乙酸乙酯，将其旋蒸浓缩得菌液浸膏，回收乙酸乙酯。6)合并菌液浸膏和菌丝体浸膏，氯仿溶解浸膏，上200目硅胶柱，以石油醚丙酮体积比=50-10:1梯度洗脱，收集石油醚丙酮体积比=20:1部分洗脱液。旋蒸浓缩，氯仿溶解洗出，自然挥干，甲醇重结晶得赭色小莫勒菌中的杜斯塔宁。7)得到纯度为99%的杜斯塔宁。提取率3. 01% (提取率％=纯杜斯塔宁重量/菌液浸膏和菌丝体浸膏总量 X 100%) O实施例3O取赭色小莫勒菌(邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现.菌物学报，2009. 28(1):148-150)为材料，无菌条件下挑取长宽约为Icm的菌块到PDB培养基(200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，在121°C高压下灭菌25min)中，在160r/min、28°C条件下连续培养10天即初级培养，按10%接种量再次转接到PDB培养基中，继续在160r/min、28°C条件下连续培养30天即次级培养；
8)将菌液和菌丝体分开，菌丝体在室温下干燥之后研磨成粉状，加2倍体积(w/v)的乙酸乙酯浸泡14小时，超声40分钟，浸泡液旋蒸得浸膏，回收乙酸乙酯；将菌液与乙酸乙酯按体积I :1混合、倒入分液漏斗中，摇瓶萃取40min，静止24小时，倒出乙酸乙酯，将其旋蒸浓缩得菌液浸膏，回收乙酸乙酯。9)合并菌液浸膏和菌丝体浸膏，氯仿溶解浸膏，上300目硅胶柱，以石油醚丙酮体积比=50-1:1梯度洗脱，收集石油醚丙酮体积比=20:1部分洗脱液。旋蒸浓缩，氯仿溶解洗出，自然挥干，甲醇重结晶得赭色小莫勒菌中的杜斯塔宁。 10)得到纯度为99%的杜斯塔宁。提取率3. 14%(提取率％=纯杜斯塔宁重量/菌液浸膏和菌丝体浸膏总量X 100%)。
对比实施例I
培养基用沙氏培养基，其配方蛋白胨10.0 g,葡萄糖40.0 g,混勻后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100 ml，在121°C高压下灭菌20 min，其它步骤同实施例I。提取率1. 52%(提取率％=纯杜斯塔宁重量/菌液浸膏和菌丝体浸膏总量X 100%)。对比实施例2
培养基用M102培养基，其配方蔗糖30g，麦芽提取物20 g，蛋白胨2.0 g，酵母提取物1.0 g，KCl 0.5 g, MgSO4 0.5 g, KH2PO4 0.5 g，混匀后加单蒸水定容至1L，分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，在121°C高压下灭菌20min，其它步骤同实施例I。提取率1. 78%(提取率％=纯杜斯塔宁重量/菌液浸膏和菌丝体浸膏总量X 100%)。
权利要求
1.一种从赭色小莫勒菌中提取杜斯塔宁的方法，其特征在于该方法包括以下步骤 1)赭色小莫勒菌活化后，取菌块接种PDB培养基中，在120 160r/min、20 28°C条件下连续培养5 10天即初级培养，按8% 10%接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120 160r/min、20 28°C条件下连续培养25 30天即次级培养； 2)将菌液和菌丝体分离，菌丝体在28-35°C下干燥后研磨成粉状，加I 2倍体积的乙酸乙酯浸泡10 14小时，超声20 40分钟，浸泡液旋蒸得菌丝体浸膏，回收乙酸乙酯；菌液用乙酸乙酯萃取，萃取液旋蒸浓缩得菌液浸膏，回收乙酸乙酯； 3)将菌丝体浸膏和菌液浸膏合并，上200 300目硅胶柱，以石油醚和丙酮梯度洗脱，收集石油醚丙酮体积比=20:1部分洗脱液，旋蒸浓缩，氯仿溶解，溶解液自然挥干，再经甲醇重结晶得杜斯塔宁。
2.根据权利要求I所述的从赭色小莫勒菌中提取杜斯塔宁的方法，其特征在于所述菌液用乙酸乙酯萃取具体操作为将菌液与乙酸乙酯按体积比I :1混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取20 40min,静止12 24小时,萃取1_3次。
3.根据权利要求I所述的从赭色小莫勒菌中提取杜斯塔宁的方法，其特征在于所述超声的功率为300 500W，频率为30 40KHz。
全文摘要
本发明公开了一种从赭色小莫勒菌中提取杜斯塔宁的方法。包括先将菌株活化，初级培养，次级培养，再将发酵液抽滤，菌丝体干燥，研磨，有机溶剂浸泡，旋蒸得浸膏，少量有机溶剂溶解浸膏上200～300目硅胶柱，以石油醚:丙酮体积比=50:1梯度洗脱，收集石油醚丙酮体积比=20:1部分洗脱液，旋蒸浓缩，氯仿洗出，自然挥干，甲醇重结晶得赭色小莫勒菌中的杜斯塔宁。本发明原料取材简单；提取步骤简单，成本低；制得的化合物纯度高。
文档编号C07J63/00GK102838650SQ20121028882
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者邱君志, 毛丽慧, 宋飞飞, 邱云锋, 关雄, 涂洁, 张伟, 谢小聪 申请人:福建农林大学