专利名称：小鼠抗人β-Tubulin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制作方法
技术领域：
本发明涉及以原核表达的β-Tubulin蛋白免疫小鼠获得的分泌β-Tubulin单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G7，属于生物工程技术领域。
背景技术：
Tubulin即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种微管蛋白，其中ct微管蛋白(a-Tubulin)和β微管蛋白(β-Tubulin)可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种微管蛋白。β -Tubulin是由455个氨基酸组成,分子量为55kDa。a-Tubulin和β-Tubulin这两种微管蛋白具有相似的三维结构，能够紧密地结合成二聚体，作为微管组装的亚基。
微管壁由13个原纤维排列组成，微管可装配成单管，二联管(纤毛和鞭毛中)，三联管(中心粒和基体中)。细胞内微管以胞质微管和纺锤体微管两种形式存在，主要参与细胞运动、细胞器的定位、胞内物质的运输及真核细胞的有丝分裂过程。细胞进入分裂期，其胞质微管解聚成微管蛋白后再组装成纺锤体微管。在分裂后期，纺锤体微管牵引着姐妹染色单体从赤道面移向纺锤体的两极。在有丝分裂结束后，纺锤体微管解聚再组装成胞质微管。因此，这种微管蛋白/微管之间的动态循环(聚合和解聚)，为细胞正常有丝分裂所必需。若破坏此循环将致使进入有丝分裂期的细胞停止分裂，进而延长细胞周期或诱导细胞凋亡。肿瘤细胞具有快速增殖能力，若抑制其纺锤体的形成，必将导致有丝分裂过程的阻断，使得肿瘤细胞生长停滞于G2 / M期。β_微管蛋白可专一性地与某些抗有丝分裂药物，如秋水仙碱(colchicine)、长春花碱和鬼白素等相结合。一旦与药物相结合后就阻止其他蛋白单体的继续添加而抑制微管的聚合，同时还通过诱导微管的解聚抑制纺锤体的形成，使细胞的有丝分裂停止于M期，从而阻止细胞分裂繁殖；紫杉醇类等药物在β -微管蛋白上的结合腔靠近异二聚体和原丝间的重要作用区域，因而在药物与微管蛋白结合的同时也加强了异二聚体和原丝间的结合，结果促进了微管蛋白的聚合又能稳定已形成的微管(抗低温及抗Ca2+的解聚)，使细胞分裂停止于G2 / M期。与正常细胞相比较，肿瘤细胞对细胞凋亡的诱导更加敏感，作用于微管的抗癌药物更容易杀死肿瘤细胞，与其他类型药物相比具有更好的疗效。另外，β_微管蛋白表达异常与肿瘤的恶性生物学行为密切相关，大量的研究表明，α、β_微管蛋白异常表达也出现在直肠癌、乳腺癌、胶质瘤等肿瘤细胞中。故监测β_微管蛋白在癌变过程中表达水平的变化对肿瘤治疗研究以及提高肿瘤细胞对药物的敏感性，改善预后都具有重要意义。其次，由于β -Tubulin的蛋白在大部分细胞中的表达比较恒定，因此也被广泛用于Western Bloting实验时的内参，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。抗β-Tubulin小鼠单克隆抗体可以通过与β-Tubulin的特异性结合再加上相应荧光标记或酶标二抗共同作用对β -Tubulin进行染色来观察细胞结构，或者检测实验样品中β-Tubulin的表达量进而调整上样量,确定上样量相等,进而比较不同条件下或者不同组织中目的蛋白表达量变化。目前，国内外已经获得了多种β-Tubulin的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的β -Tubulin的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高亲和性的、用于科研或临床、可用于科研或临床免疫组化检测β-Tubulin表达、Western Bloting实验时的内参、以及免疫染色观察细胞的微管结构的小鼠抗人β -Tubulin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案 (I)根据β-Tubulin的基因序列(ΝΜ_006086· 3)的编码框，设计I对特异引物，Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增β -Tubulin基因，构建重组表达载体PET28a-0 -Tubulin，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。(2)采用经典的细胞融合技术制备β-Tubulin单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。(3)采用免疫印迹法(Western blot)检测β-Tubulin单抗的效价及特异性,免疫荧光观察细胞微管结构，通过免疫组织化学分析β -Tubulin单克隆抗体染色人宫颈鳞癌、前列腺癌和食管鳞状细胞癌石蜡切片。(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体β -Tubulin重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体β -Tubulin的重链和轻链可变区序列。本发明提供的以原核表达的β-Tubulin蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌β -Tubulin单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为3G7，该细胞株3G7已于2012年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No. 6349，建议分类命名为小鼠抗人β-Tubulin杂交瘤细胞系。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株3G7，CGMCC No. 6349产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID Ν0:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 10。本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO: 7和DNA分子SEQ ID NO:8，DNA分子SEQ ID NO:7编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:9 ;DNA分子SEQ ID N0:8编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO: 10。本发明的优点和有益效果本发明应用重组人的β-Tubulin蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗β -Tubulin的杂交瘤细胞株，命名为3G7，亚型鉴定为IgGl，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用Protein A亲和层析法对β-Tubulin单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上；ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在I : 100000以上。免疫印迹法(Western blot)检测β -Tubulin单抗的效价及特异性，结果显示在分子量55KDa处有一条明显的区带，证明是抗β-Tubulin小鼠单克隆抗体,梯度稀释显示抗体1:40000稀释后条带依然清晰,证明本单抗效价极高；免疫印迹法(Western blot)检测Hela细胞裂解液、大鼠脑组织裂解液、小鼠脑组织裂解液中β -Tubulin蛋白的表达,结果均得到一条特异性条带,表明β -Tubulin蛋白的表达，说明本单抗具有广泛的物种反应性；人宫颈鳞癌、前列腺癌和食管鳞状细胞癌石蜡切片经抗β-Tubulin抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞浆内呈均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的β-Tubulin单克隆抗体,用该抗体检测证实,其对细胞中的β-Tubulin蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测β-Tubulin表达,Western Bloting实验时的内参，以及免疫染色观察细胞的微管结构。
图1SDS-PAGE分析纯化后的β -Tubulin单克隆抗体。图2ELISA法测定β -Tubulin单克隆抗体滴度。图3是免疫印迹法(Western blot)检测β-Tubulin单抗的纯度及特异性。LaneI: β-Tubulin 单抗工作浓度 1:5000。Lane 2: β-Tubulin 单抗工作浓度 1:10000。Lane3: β-Tubulin 单抗工作浓度 1:20000。Lane 4: β-Tubulin 单抗工作浓度 1:40000。图4是免疫印迹法(Western blot)检测Hela细胞裂解液(Lane I)、大鼠脑组织裂解液(Lane 2)、小鼠脑组织裂解液中β-Tubulin (Lane 3)蛋白的表达。图5是免疫荧光检测观察细胞微管结构。I:DAPI染色细胞核。2: β -Tubulin单抗免疫荧光结果。3:Merge(l+2)。图6是免疫组织化学检测分析β -Tubulin单克隆抗体染色人宫颈鳞癌石蜡切片。图7是免疫组织化学检测分析β -Tubulin单克隆抗体染色前列腺癌石蜡切片。图8是免疫组织化学检测分析β -Tubulin单克隆抗体染色食管鳞状细胞癌石蜡切片。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。实施例I :杂交瘤细胞株3G7及其产生的单克隆抗体的获得I、抗原制备(I)获得目的基因在该实施例中，根据β -Tubulin的基因序列(NM_006086. 3)的编码框，设计I对特异引物引物I :5，-GGATCCATGAGGGAGATCGTGCACATCC-3，(SEQ ID NO: I)引物2 :5，-CTCGAGTCACTTGGGGCCCTGGG-3' ； (SEQ ID NO:2)Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增β -Tubulin基因。
(2)构建重组表达载体将步骤(I)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体 PET28a，构建重组质粒 PET28a-P -Tubulin。(3)获得含重组表达质粒的表达菌种将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。(4)诱导表达和蛋白纯化将步骤(2)提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至IOml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，37°C，220rpm培养 IOh,取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为O. 8，加入O. 2mMIPTG诱导表达，16°C诱导过夜，收集菌液超声，取上清用Ni-NTA琼脂糖亲和层析法纯化β -Tubulin 蛋白。2、单抗的制备和纯化(I)、免疫动物—般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。首次免疫。纯化的重组蛋白β-Tubulin (用适量生理盐水稀释)+完全弗氏佐剂，IOOug/只，颈背部皮下多点注射；二次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白β-Tubulin (用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂，IOOug/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白β-Tubulin (用适量生理盐水稀释)，不完全弗氏佐剂，IOOug/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫后7 10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合。加强免疫(融合前3天)，用纯化的重组蛋白50ug腹腔注射。3天后，取脾脏融合。(2)、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(1:5 1:10)，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清以纯化的β-Tubulin蛋白(10 μ g/ml)包被酶标板，每孔100 μ l，4°c包板过夜。甩掉包被液，加入200 μ I 5%的脱脂奶粉，37°C封闭Ih后，洗涤3次，加杂交瘤细胞培养检测上清100 μ I (阴性对照为？8510(^1)，371孵育I小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50 μ I，室温静置5分钟，加终止液50 μ I。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗β-Tubulin杂交瘤细胞株，命名为3G7，亚型鉴定为IgGl。
将选出的阳性杂交瘤细胞株3G7克隆化培养(有限稀释法)，获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人β -Tubulin杂交瘤细胞系3G7，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 6349。(3)单克隆抗体的大量制备与纯化将步骤(2)获得的细胞株3G7接种至Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体。单克隆抗体β-Tubulin的纯化采用Protein A亲和层析法。首先制备proteinA亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗β -Tubulin的腹水过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2. 5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上(参见图I)。
(4)直接ELISA法测定纯化抗体的滴度以纯化的β-Tubulin蛋白(10 μ g/ml)包被酶标板,每孔100 μ 1,4°C包板过夜。甩掉包被液，加入2 O O μ I 5 %的脱脂奶粉，3 7 °C封闭I h后，洗涤3次，将纯化的抗体按1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000 进行稀释，以每孑L100 μ I加入酶标板中(阴性对照为PBS100 μ 1)，37°C孵育I小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50 μ 1，室温静置5分钟，加终止液50 μ I。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在I : 100000以上(参见图2)。实施例2 :单克隆抗体鉴定及应用I、小鼠抗β-Tubulin单克隆抗体的鉴定裂解提取Hela细胞裂解液，上样至10%的SDS-PAGE胶孔中，20 μ g/孔，电泳后将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，封闭后，用抗β -Tubulin抗体进行免疫染色，加入实施例I步骤(3)制备并纯化的β-Tubulin单克隆抗体，工作浓度分别设为1:5000、1:10000、I 20000、1:40000，4°C过夜，加入HRP标记的羊抗鼠抗体，工作浓度1:5000,于37°C反应Ih，每个浓度梯度均出现分子量为55KDa的条带(参见图3)，与文献报道相符，证明此抗体为抗β -Tubulin的特异性抗体；梯度稀释显示抗体1:40000稀释后条带依然清晰,证明本单抗效价极闻。2,Hela细胞裂解液、大鼠脑组织裂解液、小鼠脑组织裂解液中β -Tubulin蛋白表达的检测用Western blot法检测细胞裂解液中β-Tubulin蛋白的表达。各细胞取蛋白各50 μ g，用8% SDS-PAGE电泳分离后电转移到PVDF膜上，封闭后，加入实施例I步骤(3)制备并纯化的β-Tubulin单克隆抗体(工作浓度1:5000)，4°C过夜。加入HRP标记的羊抗鼠抗体(工作浓度1:5000)于37°C反应lh，ECL显色后观察结果。结果均出现分子量为55KDa的条带(参见图4)，说明抗β -Tubulin的3G7单克隆具有广泛的物种反应性。3、免疫荧光细胞染色和DAPI染色人结直肠癌细胞SW480用PBS冲洗3次，4%多聚甲醛室温固定30min，PBS冲洗，用含1%正常羊血清、1%牛血清、O. 5%牛血清白蛋白、O. 1% Triton X-100的PBS室温孵育30min,以阻断非特异性反应。加实施例I步骤(3)制备并纯化的β-Tubulin单克隆抗体(1:50)4°C孵育过夜。冲洗，加TRITC标记的羊抗鼠IgG，室温避光孵育2h。去除二抗，加入DAPI染色液室温作用15分钟以上。PBS冲洗，荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察，用合适波段激发，照相保存实验结果。实验结果清楚观察到DAPI染色的细胞核显现蓝色荧光，细胞骨架呈现红色荧光(参见图5)。说明此抗β-Tubulin的特异性抗体可用于免疫荧光检测观察细胞微管结构。4、免疫组化应用检测用β-Tubulin单抗，按常规法作病理切片，对人宫颈鳞癌、前列腺癌和食管鳞状细胞癌石蜡切片进行免疫组化染色。具体方法为切片依次置于二甲苯Ι、ΙΙ、ΙΙΙ脱蜡每次5分钟，移至无水乙醇1、11中各浸泡4分钟，移至95%酒精中浸泡4分钟，移至85%酒精中浸泡4分钟，再移至70%酒精中浸泡4分钟，流水冲洗2分钟。3% H2O2中浸泡10分钟，流水冲洗蒸馏水冲洗。取出切片，擦干组织周围的水，用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈注意圈接头要接好，防止抗体跑出圈外造成假阴性。PBS缓冲液冲洗。甩去待测组织切片上多余的PBS，滴加一抗，其中 一抗为实施例I步骤(3)制备并纯化的β-Tubulin单克隆抗体，稀释度为1:1000。放置在孵育盒内4°C冰箱中过夜孵育约12小时，将孵育盒从冰箱取出，恢复至室温后取出切片，用PBS洗3次，每次5分钟。滴加通用型二抗-HRP聚合物。将切片放入孵育湿盒中，盖上盖子，连孵育盒一起放入37°C恒温箱中孵育30分钟。取出切片，擦掉组织周围的多余的PBS，加入DAB显色液中显色3 5分钟，在显微镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗5-10分钟，苏木素染液复染I分钟，O. 5%盐酸酒精分化3秒钟，流水冲洗5-10分钟，脱水、透明、封片、镜检。结果判定按照国外学者对组织中β-Tubulin的判定标准，β-Tubulin蛋白阳性反应为黄到棕黄色细小颗粒，定位于胞浆。人宫颈鳞癌(参见图6)、前列腺癌切片(参见图7)和食管鳞状细胞癌(参见图8)经抗β -Tubulin抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞浆内呈均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色，说明此
单克隆抗体可以特异性的应用于免疫组织化学实验。实施例3 :单克隆抗体可变区测序根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物zh08 5’-GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3’(SEQ ID NO :3)zhrll 5’-GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3’(SEQ ID NO :4)z 101 5’-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’(SEQ ID NO :5)zlr05 5’-GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3’(SEQ ID NO:6)Trizol Reagent试剂分别提取5X IO6杂交瘤细胞3G7的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA。用zh08和zhrll为引物进行PCR扩增单克隆抗体β-Tubulin重链可变区，用zlOl和zlr05为引物进行PCR扩增单克隆抗体β -Tubulin轻链可变区，PCR反应均采用热启动，反应条件94°C 5分钟；94°C 45秒，60°C 45秒，72°C I分10秒，30个循环；72°C 7分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段(轻链长度391bp，重链长度420bp)。克隆到PGEM-T(Promega)载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后在IPTGIX-gal平板上进行筛选，取白色菌斑接种于含有氨韦青霉素的LB液体培养基中扩增。筛选阳性克隆，用QIAGEN的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序,确定了单克隆抗体β -Tubulin的重链和轻链可变区序列。单克隆抗体β -Tubulin可变区的DNA序列和氨基酸序列单克隆抗体β -Tubulin 重链可变区 DNA 序列(5，— 3’，420bp) (SEQ ID NO:7)；单克隆抗体β-Tubulin 的轻链可变区 DNA序列(5，—3’，391bp) (SEQ ID NO:8)；单克隆抗体β-Tubulin重链可变区的推断氨基酸序列(140氨基酸)(SEQ IDNO:9)； 单克隆抗体β -Tubulin轻链可变区的推断氨基酸序列(130氨基酸)(SEQ 10 IDNO:10)。
权利要求
1.一种以原核表达的β-Tubulin蛋白免疫小鼠获得的分泌β-Tubulin单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G7，保藏编号为CGMCC No. 6349。
2.一种由权利要求I所述的杂交瘤细胞株3G7产生的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID Ν0:10ο
4.一种DNA分子SEQ ID NO: 7，它编码权利要求3中所述的重链可变区氨基酸序列SEQID Ν0:9。
5.一种DNA分子SEQ ID NO: 8，它编码权利要求3中所述的轻链可变区氨基酸序列SEQID NO:10。
全文摘要
一种小鼠抗人β-Tubulin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌β-Tubulin单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为3G7，保藏编号为CGMCCNo.6349。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株3G7产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:10。本发明还提供了一种DNA分子SEQIDNO:7，它编码重链可变区氨基酸序列SEQIDNO:9；一种DNA分子SEQIDNO:8，它编码轻链可变区氨基酸序列SEQIDNO:10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测β-Tubulin表达，WesternBloting实验时的内参，以及免疫染色观察细胞的微管结构。
文档编号C07K16/18GK102776154SQ20121030070
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月22日 优先权日2012年8月22日
发明者尹芝南, 张林刚, 郗日沫 申请人:天津三箭生物技术有限公司