专利名称：一种利用离子液体及酶法提取分离饼粕中蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质分离纯化领域，具体涉及一种利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法。
背景技术：
油料饼柏一般含有蛋白、多酚、植酸、多糖等具有较高利用价值的成分。饼柏是一种潜在营养价值很高的植物蛋白资源，其蛋白含量为359^40%，这是饼柏中利用价值最高的成分。这种蛋白中含有大量人体所需的多种必须氨基酸，因此也是极为重要的食品蛋白质源。我们在此以菜籽柏中的菜籽蛋白为例，菜籽饼柏氨基酸总量占其蛋白质总量的83. 8%， 其赖氨酸含量和大豆接近，而蛋氨酸含量比大豆还高，适用于用来补充谷物和许多缺乏这类氨基酸的豆类。与其它蛋白质相比，菜籽蛋白质的优势在于①其氨基酸组成模式与FAO及WHO推荐模式很接近，比大豆蛋白更理想；②含硫氨基酸一蛋氨酸、胱氨酸和组氨酸含量比大豆浓缩蛋白为高。含硫氨基酸是食品中一类最重要氨基酸，也属必须氨基酸，在食品感观功能、营养功能和理调节功能方面作用重大。菜籽蛋白富含谷物中所缺少的含硫氨基酸与碱性基酸，可弥补谷物氨基酸缺陷。我国膳食结构以谷物为主，菜籽蛋白可弥补我国人民膳食结构不足，更好地满足食品等生产和国人生活对蛋白质需要。离子液体是近十年来迅速发展起来的一种可替代传统挥发性有机物的绿色溶剂，离子液体具有不易挥发、不可燃、稳定性高、溶解能力强、功能可调节等优点。离子液体可与多种物质如盐、糖、表面活性剂等形成双水相体系，其在萃取分离生物物质方面表现出优异的性能，这无疑会开拓一种新的绿色分离技术。传统的提取分离蛋白质的方法仍存在着提取率低、成本高且操作复杂等缺点，因此寻找一种高效、绿色且经济的提取分离蛋白质的方法已成为技术研究的重点。因而，发明者根据离子液体-盐双水相体系较传统双水相技术所不具备的诸多优点，如操作简单、无污染、分离效率高、可控制乳化、可循环使用离子液体等，结合酶解提取蛋白质的技术，研究开发了一种更加高效且经济的绿色分离饼柏中蛋白质的新技术。同时本方法在提取分离中极大限度地保持了蛋白质的生物活性不受破坏，提高了蛋白质的品质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法。本发明的目的通过以下技术方案实现一种利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，包括以下步骤(I)将原料饼柏粉碎过筛后用有机溶剂脱脂，得到脱脂饼柏粉；(2)将步骤(I)所述的脱脂饼柏粉与pH值为7 10的缓冲溶液混合后加入复合酶制成混合液，将混合液在4(T65 °C条件下酶解2 5 h后，离心分离，得到酶解液和沉淀；所述脱脂饼柏粉与缓冲溶液的料液质量比为1:7 1:15，所述混合液中的总酶活为9(T250U g ；(3)然后将步骤(2)所述的沉淀碱溶后离心分离，将分离得到的上清液与步骤(2)所述的酶解液合并后，进行酸沉并离心分离，将沉淀水洗后冷冻干燥，得到粗蛋白；(4)将步骤(3)得到的粗蛋白加到离子液体/盐双水相体系中，在温度4(T70 °C、PH4、的条件下震荡后再静置，取上层离子液体相；(5)最后将步骤(4)的离子液体相用膜分离法分离蛋白质，并回收离子液体，将蛋白质冷冻干燥得到高纯度蛋白粉。
上述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其在于，所述复合酶中的酶为a-淀粉酶和纤维素酶，或者a-淀粉酶、纤维素酶和果胶酶，且a-淀粉酶和纤维素酶的酶活力比为5:广2:3。上述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其在于，混合液中，a -淀粉酶和纤维素酶的酶活力分别为6(Tl50 U g ―1和3(T90 U g '上述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其在于，所述的缓冲溶液为磷酸缓冲液或硼酸缓冲液。上述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其在于，所述的步骤
(4)中所述粗蛋白的浓度为2(Tl00 mg*!/1，所述离子液体的浓度为20(T600 mg-mL—1，所述盐的浓度为9(T220 mg -mr1 ;优选为所述粗蛋白的浓度为5(T80 mg吨―1，所述离子液体的浓度为30(T400 mg 所述盐的浓度为130 180 mg mL_10更进一步优选为粗蛋白的浓度为70 80 mg .171,离子液体的浓度为350 380 mg *mL 盐的浓度为150 180 mg .mL'所述的离子液体/盐双水相体系为亲水性离子液体/盐双水相体系，所述的离子液体为亲水性咪唑类离子液体、吡啶类离子液体或胍类离子液体，所述的盐为磷酸盐、碳酸盐或硫酸盐。所述的亲水性咪唑类离子液体为[Amim]Cl、[Bmim] Cl或[Bmim]BF4,所述的卩比卩定类离子液体为[Epy]Br或[BPy]BF4,所述的磷酸盐为K2HPO 4、KH2P04 *K3P04，所述的碳酸盐为NaHC03、Na2CO3或(NH4) 2S04 ;优选的所述的离子液体/盐双水相体系为[Bmim] C1/K2HP04、[Amim]Cl/K2HP04、[Epy] Br/K2HPO4、[Bmim] BF4A2HPO4。更进一步优选为[Bmim] C1/K2HP04。步骤⑵和步骤(3)中所述离心分离的离心速度为3000 5000 r mirT1。步骤(3)中沉淀水洗的次数为3飞次；步骤⑷中，所述震荡的时间为2(T50min，震荡速度为100 300 r mirT1，所述静置的时间为3(T60min。步骤⑴中所述的有机溶剂为石油醚、环已烷、正已烷或四号溶剂。本发明技术方案步骤(3)中用碱溶酸沉法得到粗蛋白，其中“碱溶酸沉”为本领域技术人员所公知的。利用蛋白质“碱溶酸沉”的原理，即蛋白质在碱性条件下，比较容易溶解于水中(萃取)，然后在酸性条件下到达等电点(蛋白质在等电点时溶解度最小)时，蛋白质容易聚集沉淀的原理，将蛋白提取出来。本发明原料饼柏优选是低温或高温压榨过的饼柏。本发明中使用的酶是a -淀粉酶和纤维素酶的混合物，或者a -淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的混合物。申请人曾经有用其他几种方法提取蛋白质或别的酶进行酶解，但是结果都不是很理想，存在的问题较多，其关键在于如何解决高效、保持蛋白质的高级结构且维持生物活性的问题。如果使用传统的碱溶酸沉法提取蛋白质，提取率较低，且时间较长。如果使用蛋白酶进行酶解反应，蛋白酶或酶解条件选择不当，蛋白质会被水解成多肽，失去高级结构。申请人研究发现在PH为疒10，温度40 65 °C，料液比1:7 1:15的饼柏反应液中只添加少量a-淀粉酶和纤维素酶的混合物或者a-淀粉酶、纤维素酶和或果胶酶的混合物，便可以使提取率提高，成功地完成了此项发明。a -淀粉酶、纤维素酶、果胶酶能够分别水解淀粉、纤维素和果胶，以有效降解植物细胞壁的纤维素骨架、崩溃植物细胞壁，从而将蛋白质释放出来而又不破坏蛋白质的结构。当a-淀粉酶和纤维素酶混合作用，或者a-淀粉酶、纤维素酶和果胶酶混合作用时能较好的体现上述机能，此时，a -淀粉酶和纤维素酶的酶活分别为6(T150 U g ―1和3(T90 U g1O本发明研究发现如果酶用量过多，其对蛋白质的提取率影响不大但浪费资源，且对蛋白质的组成及测定产生一定的影响。因此，本发明中最好把总酶活控制在9(T250 U . g -1,a-淀粉酶与纤维素酶的酶活力比在5:广2:3。另外，本发明中使用的a-淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的原料应该首选酶活高的品种，这样可能节省成本提高效益，以上几种酶均可以从市场购得。
将脱脂饼柏粉和pH值为7 10的缓冲溶液混合后加入复合酶，进行酶解反应提取蛋白质。通常的容器中进行加热搅拌，其条件为40飞5 °C、2飞h，料液质量比1:7 1:15，一般搅拌速度50 100 r mirT1。然后于转速3000 5000 r mirT1离心后，将沉淀碱溶后离心分离，将碱溶上清夜与酶解液合并后酸沉并离心分离，将沉淀水洗后冷冻干燥，得到粗蛋白。蛋白质的提取率可达96%以上，粗品蛋白含量80%以上。本发明的提取分离饼柏中蛋白质的要点是酶解法提取饼柏中的蛋白质，并结合离子液体双水相法分离纯化蛋白质的技术，其中离子液体及盐的选择与用量为关键。本发明中使用的离子液体双水相体系优选为I- 丁基-3-甲基咪唑氯盐([Bmim]Cl)/ K2HPO4U-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐([Amim]Cl)/K2HPO4 体系、[Epy]BrA2HPO4 体系或[Bmim]BF4A2HPO4体系。曾经有用几种离子液体及盐形成双水相进行分离纯化，但不很理想，存在较多的问题，其关键在于如何解决形成双水相及提高分离纯化效率的问题。研究发现，磷酸盐能较好的与离子液体形成双水相，且[Bmim]Cl、[Amim]Cl> [Epy]Br或[Bmim]BF4与K2HPO4形成的双水相对蛋白质的分离纯化效率较高，成功地完成了此项发明。本发明中采用的离子液体双水相体系为离子液体-无机盐双水相体系。离子液体分子可看成是由疏水和亲水两部分组成。疏水部分在水溶液中聚集成核，亲水部分向外张开形成胶束。加入辅助无机盐可能起着非特征性的盐析作用，以渗透压作用推动双水相的形成。当蛋白质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同，即各成分在两相间的选择性分配，从而达到萃取分离的目的。在用离子液体-无机盐双水相体系分离纯化粗蛋白中，粗蛋白的浓度为2(Tl00mg.L—1，离子液体浓度为200 600 mg mL—1，无机盐浓度为90 220 mg.mL—1。经过多次实验得优化条件为粗蛋白的浓度为50 80 mg L—1，离子液体浓度为300 400 mg mL—1，无机盐浓度为13(Tl80 mg mL'且当体系的无机盐浓度低于90 mg mL—1或离子液体浓度低于200 mg mL-1时体系无法形成双水相，随着无机盐浓度的增加，上下相体积比逐渐减小，但蛋白质在两相间的分配比逐渐增大，当无机盐浓度达到150 mg .mr1时，菜籽蛋白在两相间的分配比最大，此时对菜籽蛋白的萃取率最高；在150^180 mg .mL-1时，分配比将趋于稳定；无机盐浓度大于220 mg 时，分配比将有所减小。当离子液体浓度为30(T400 mg .mr1时菜籽蛋白的萃取率逐渐增大，当离子液体浓度大于400 mg -mr1时，菜籽蛋白的萃取率逐渐减小后趋于一定。因此，优选的本发明饼柏粗蛋白的浓度为5(T80 mg .L-1，离子液体浓度为300 400 !!^ 111171，无机盐浓度为130 180 mg mL—1。另外，本发明所用的离子液体纯度需大于99%。将以上原料混合后，进行双水相萃取分离蛋白质。在恒温振荡器中进行加热震荡，加热震荡条件通常为加热温度40 70 °C、时间20 50 min、振荡速度100 300 r .mirT1, pH
4、时体系对蛋白质的萃取率较高，最优选为pH 6、。静置3(T60 min后分相完全，离子液体相可通过膜分离法分离出蛋白质，蛋白质冷冻干燥后得高纯度蛋白质，离子液体可经旋转蒸发、真空干燥后得以回收再用。本发明的蛋白质的萃取率高达98%，离子液体回收率90%以上，且回收的离子液体对蛋白质的萃取率仍高达94%以上，此方法高效又节能。本发明所采用的提取分离蛋白质的方法关键在于水相酶解法与离子液体双水相法共同作用以得到高纯度的蛋白质，借以提高饼柏的利用价值，得到营养丰富的蛋白质。
离子液体是近年来出现的一种新型绿色溶剂。在室温或接近室温下它以液体状态存在的有机熔融盐，完全由离子组成。离子液体不但具有传统有机溶剂的优势，而且与有机溶剂相比表现出了许多优异性能，如液体状态温度范围宽，可以从15 V 300 °C范围内稳定存在；具有良好的物理化学稳定性；几乎没有蒸汽压，消除了挥发性有机溶剂对环境的污染问题；无可燃性，对大量无机和有机物都有良好的溶解能力；具有溶剂和催化剂的双重功效，可作为反应溶剂和催化剂活性载体；电导率高。同时，离子液体的性质可通过调节阴阳离子进行优化。这就决定了离子液体将成为挥发性有机溶剂的理想替代品。因此，有人把离子液体、超临界0)2和双水相并称为21世纪三大绿色溶剂，具有广阔的应用前景。离子液体双水相体系一般是由亲水性离子液体、无机盐(如磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、氢氧化物等)和水形成的双水相体系，它综合了离子液体和双水相体系的优点。离子液体双水相萃取分离蛋白质属于液-液萃取，其原理与水-有机相萃取的原理相似，但其作为一种高效的新型绿色分离体系，与传统聚合物双水相体系相比，离子液体双水相具有粘度低、分相快、不易乳化、萃取率高、离子液体可以循环利用等优点，因此越来越受到学术界及产业界的重视。本发明所提出的技术方案更加高效节能，符合现代人的低碳环保要求。本发明的蛋白质收集和离子液体回收工艺主要是指将上相离子液体相用超滤膜分离出蛋白质，冷冻干燥后得蛋白质粉；而离子液体可用旋转蒸发和真空干燥得以回收。本发明的酶法结合离子液体双水相提取分离饼柏中蛋白质具有以下特点I.提取分离的效率高、蛋白质纯度高本发明采用水相酶解法与离子液体双水相法结合提取分离饼柏中的蛋白质，对蛋白质进行了多次提取分离且操作简易，解决了大多数方法的单一性及操作复杂等使得蛋白质纯度不理想的问题。2.经济、环保无污染本发明采用的离子液体是一种可替代传统挥发性有机物的绿色溶剂，且可以多次循环使用。本产品迎合了现代低碳节能的要求，市场前景广阔。
具体实施例方式实施例I(I)将高温菜籽柏粉碎过筛，石油醚脱脂，得脱脂菜籽柏粉；(2)将脱脂菜籽柏粉与pH=8. 0的磷酸缓冲液混合后加入a _淀粉酶和纤维素酶制成混合液，将混合液在60 °C条件下酶解4h后，4000 r mirT1离心20min，得到酶解液和沉淀。所述脱脂菜籽柏粉与磷酸缓冲液的料液质量比为1:15;所述混合液中a -淀粉酶和纤维素酶的酶活力分别为110 U g ―1和60 U g '总酶活力为170 U g-1。(3)将步骤⑵沉淀加入10倍量的水中，用0. 5 mo I L—1 NaOH调至pH=10进行碱溶反应，2h后，4000 r mirT1离心20min，将分离得到的上清液与步骤(2)酶解液合并，加0. 5 mol I71盐酸调pH至4. 2 4. 8进行酸沉，4000 r mirT1离心20min,用蒸懼水洗漆沉淀5次后，冷冻干燥，得到粗菜籽蛋白；(4)将粗菜籽蛋白加到[Bmim] Cl /K2HPO4双水相体系中，在温度65 °C，pH 7.0，振荡速度200 r mirT1恒温振荡30 min，再静置40 min，取上层离子液体相；
粗菜籽蛋白浓度为70 mg L-1，[Bmim]Cl 浓度为 350 mg mL—1，K2HPO4 浓度为 150mg mL 1 o(5)离子液体相用膜分离法分离蛋白质，并且用旋转蒸发和真空干燥后除去水分回收离子液体，将蛋白质冷冻干燥得到高纯度菜籽蛋白粉。实施例2(I)将高温菜籽柏粉碎过筛，环已烷脱脂，得脱脂菜籽柏粉；(2)将脱脂菜籽柏粉与pH=8. 0的磷酸缓冲液混合后加入a _淀粉酶和纤维素酶制成混合液，将混合液在55 °C条件下酶解3 h后，4000 r mirT1离心20min，得到酶解液和沉淀。所述脱脂菜籽柏粉与磷酸缓冲液的料液质量比为1:10 ;所述混合液中a -淀粉酶和纤维素酶的酶活力分别为90 U g ―1和50 U g S总酶活力为140 U g '(3)将步骤⑵沉淀加入10倍量的水中，用0. 5 mol吨―1 NaOH调至pH=10进行碱溶反应，2h后，4000 !■ mirT1离心20 min，将分离得到的上清液与步骤(2)酶解液合并，力口
0.5 mol I71盐酸调pH 4. 2 4. 8进行酸沉，4000 r mirT1离心20 min,蒸懼水洗漆沉淀5次后，冷冻干燥，得到粗菜籽蛋白；(4)将粗菜籽蛋白加到[Amim]ClA2HPO4双水相体系中，在温度65 °C，pH 7. 0,200r mirT1恒温震荡40 min,再静置40 min,取上层离子液体相；粗菜籽蛋白浓度为80 mg L-1，[Amim] Cl 浓度为 400 mg mL—1，K2HPO4 浓度为 180mg mL 1 o(5)离子液体相用膜分离法分离蛋白质，并且用旋转蒸发和真空干燥后除去水分回收离子液体，将蛋白质冷冻干燥得到高纯度菜籽蛋白粉。离子液体回收率90%以上。实施例3(I)将低温菜籽柏粉碎过筛，正已烷脱脂，得脱脂菜籽柏粉；(2)将脱脂菜籽柏粉与pH=9. 0的硼酸缓冲液混合后加入a -淀粉酶、纤维素酶和果胶酶制成混合液，将混合液在60 °C条件下酶解5 h后,4000 r mirT1离心20min,得到酶解液和沉淀。所述脱脂菜籽柏粉与硼酸缓冲液的料液质量比为1:15;所述混合液中a -淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的酶活力分别为70 U *g '40 U-g-1和50 U g '总酶活力为160 U g ―1。(3)将步骤⑵沉淀加入10倍量的水中，用0. 5 mol L—1 NaOH调至pH=10进行碱溶反应，2h后，4000 r mirT1离心20min，将分离得到的上清液与步骤(2)酶解液合并，加0. 5 mol I/1盐酸调pH 4. 2 4. 8进行酸沉，4000 r mirT1离心20min,蒸懼水洗漆沉淀5次后，冷冻干燥，得到粗菜籽蛋白；(4)将粗菜籽蛋白加到[Epy] BrA2HPO4双水相体系中，在温度65 V ’ pH 6. 5,200r mirT1恒温震荡30 45 min,再静置30 min,取上层离子液体相；粗菜籽蛋白浓度为60 mg L-1，[Epy]Br浓度为300 mg mL—1，K2HPO 4浓度为130mg mL 。(5)离子液体相用膜分离法分离蛋白质，并且用旋转蒸发和真空干燥后除去水分回收离子液体，将蛋白质冷冻干燥得到高纯度菜籽蛋白粉。 实施例4(I)将低温茶籽柏粉碎过筛，四号溶剂脱脂，得脱脂茶籽柏粉；(2)将脱脂茶籽柏粉与pH=9的硼酸缓冲液混合后加入a _淀粉酶、纤维素酶和果胶酶制成混合液，将混合液在60 °C条件下酶解4 h后,4000 r mirT1离心25 min,得到酶解液和沉淀。所述脱脂茶籽柏粉与硼酸缓冲液的料液质量比为1:10 ;所述混合液中a -淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的酶活力分别为100 U-g '65 U-g一1 和 75 U g ―1，总酶活力为 240 U g -1。(3)将步骤(2)沉淀加入10倍量的水中，用0. 5 mol .L—1 NaOH调至pH =9. 5 10. 5进行碱溶反应，2 h后,4000 r mirT1离心20min,将分离得到的上清液与步骤(2)酶解液合并,加0. 5 mol L-1盐酸调pH 3 4进行酸沉，4000 r mirT1离心20 min,蒸懼水洗漆沉淀5次后，冷冻干燥，得到粗茶籽蛋白；(4)将粗茶籽蛋白加到[Bmim]BF4A2HPO4双水相体系中，在温度70 °C，pH 6.8,200 r mirT1恒温震荡30 min,再静置30 min,取上层离子液体相；粗茶籽蛋白浓度为70 mg I71, [Bmim]BF4浓度为380 mg mL' K2HPO4浓度为160mg mL 1 o(5)离子液体相用膜分离法分离蛋白质，并且用旋转蒸发和真空干燥后除去水分回收离子液体，将蛋白质冷冻干燥得到高纯度茶籽蛋白粉。表I实施例1-4中采用不同的离子液体/盐双水相体系及反应条件对蛋白质萃取率的影响
—I单位 I实施例I I实施例2 I实施例3 I实施例4
M子/茶籽蛋白浓度70806070—
S子液体-一~ [Bmim] Cl ~ [Amim] Cl 一 [Epy] Br [Bmim] BF^~
S子液体浓度—mg.mL/1 ~350 ~400 一300380
瓦HPO4 浓度—mg ^mL/1 ~ 150 ~ 180 一130160
S 度'C~65~65一6570
Fh~7.0 ~7.0 —6.56.8
韋取率|%丨98.24 \92. 35 丨88.94 丨94.87实施例5
(I)将低温菜籽柏粉碎过筛，石油醚脱脂，得脱脂菜籽柏粉；(2)将脱脂菜籽柏粉与pH=9. 0硼酸缓冲液混合后加入a -淀粉酶、纤维素酶和果胶酶制成混合液，将混合液在50 60 °C条件下酶解3 5h后,4000 r mirT1离心20 min,得到酶解液和沉淀。所述脱脂菜籽柏粉与硼酸缓冲液的料液质量比为1:10 ;所述混合液中a -淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的酶活力分别为100 U.g-\70U.g―1和50U g '总酶活力为220U g ―1。(3)将步骤⑵沉淀加入10倍量的水中，用0. 5 mol L—1 NaOH调至pH= 10进行碱溶反应，2h后，4000 r mirT1离心20min，将分离得到的上清液与步骤(2)酶解液合并，加0. 5 mol I/1盐酸调pH 4. 2 4. 8进行酸沉，4000 r mirT1离心20min,蒸懼水洗漆沉淀
5次后，冷冻干燥，得到粗菜籽蛋白；(4)将粗菜籽蛋白加到[Bmim]ClA2HPO4双水相体系中，在一定的温度和pH条件下200 r mirT1恒温震荡30 min,再静置30min,取上层离子液体相；菜籽蛋白浓度、[Bmim]Cl、K2HPO4的浓度以及萃取温度和萃取pH取不同的值，见表2。(5)离子液体相用膜分离法分离蛋白质，并且用旋转蒸发和真空干燥后除去水分回收离子液体，将蛋白质冷冻干燥得到高纯度菜籽蛋白粉，萃取率见表2。表2蛋白浓度、[Bmim]Cl浓度、K2HPO4浓度、温度和pH对蛋白质萃取率的影响
权利要求
1.一种利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)将原料饼柏粉碎过筛后用有机溶剂脱脂，得到脱脂饼柏粉； (2)将步骤(I)所述的脱脂饼柏粉与pH值为7 10的缓冲溶液混合后加入复合酶制成混合液，将混合液在4(T65 °C条件下酶解疒5 h后，离心分离，得到酶解液和沉淀；所述脱脂饼柏粉与缓冲溶液的料液质量比为1:7 1:15，所述混合液中的总酶活为90 250 U.g-1 ； (3)然后将步骤(2)所述的沉淀碱溶后离心分离，将分离得到的上清液与步骤(2)所述的酶解液合并后，进行酸沉并离心分离，将沉淀水洗后冷冻干燥，得到粗蛋白； (4)将步骤(3)得到的粗蛋白加到离子液体/盐双水相体系中，在温度4(T70°C、PH4、的条件下震荡后再静置，取上层离子液体相； (5)最后将步骤(4)的离子液体相用膜分离法分离蛋白质，并回收离子液体，将蛋白质冷冻干燥得到高纯度蛋白粉。
2.根据权利要求I所述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其特征在于，所述复合酶中的酶为a-淀粉酶和纤维素酶，或者a-淀粉酶、纤维素酶和果胶酶，且a-淀粉酶和纤维素酶的酶活力比为5: f 2:3。
3.根据权利要求2所述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其特征在于，混合液中，a -淀粉酶和纤维素酶的酶活力分别为6(T150 U g ―1和3(T90 U g '
4.根据权利要求I所述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其特征在于，所述的缓冲溶液为磷酸缓冲液或硼酸缓冲液。
5.根据权利要求I所述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中所述粗蛋白的浓度为2(T100 mg 所述离子液体的浓度为200^600 mg mL—1，所述盐的浓度为90 220 mg mL—1 ;优选为所述粗蛋白的浓度为50 80mg L—1，所述离子液体的浓度为300 400 mg mL—1，所述盐的浓度为130 180 mg mL—1。
6.根据权利要求I或5所述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其特征在于，所述的离子液体/盐双水相体系为亲水性离子液体/盐双水相体系，所述的离子液体为亲水性咪唑类离子液体、吡啶类离子液体或胍类离子液体，所述的盐为磷酸盐、碳酸盐或硫酸盐。
7.根据权利要求6所述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其特征在于，所述的亲水性咪唑类离子液体为[Amim]Cl、[Bmim]Cl或[Bmim]BF4,所述的卩比唳类离子液体为[Epy]Br或[BPy]BF4,所述的磷酸盐为K2HP04、KH2PO4或K3PO4,所述的碳酸盐为NaHC03、Na2CO3，所述的硫酸盐为(NH4)2SO4 ;优选的所述的离子液体/盐双水相体系为[Bmim]Cl/K2HP04、[Amim] C1/K2HP04、[Epy] BrA2HPO4、[Bmim] BF4A2HPO4。
8.根据权利要求I所述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述离心分离的离心速度为3000 5000 r mirT1。
9.根据权利要求I所述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其特征在于，步骤(3)中沉淀水洗的次数为3飞次；步骤(4)中，所述震荡的时间为2(T50min，震荡速度为100 300 r mirT1，所述静置的时间为3(T60min。
10.根据权利要求I所述的利用离子液体及酶法提取分离饼柏中蛋白质的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的有机溶剂为石油醚、环已烷、正已烷或四号溶剂。
全文摘要
本发明涉及蛋白质的分离纯化领域，具体地，本发明涉及一种用离子液体及酶法提取分离饼粕中蛋白质的新方法。根据本发明所述的用离子液体及酶法提取分离饼粕中蛋白质的方法包括以下步骤1)将原料饼粕粉碎过筛，脱脂，得到脱脂饼粕粉；2) pH7~10，温度40~65 ℃，料液比1:7~1:15条件下将脱脂饼粕粉进行酶解，总酶活为90~250 U·g -1，酶解2~5 h后离心分离；3)步骤2) 所得的沉淀和酶解液进行碱溶酸沉，冷冻干燥，得到粗蛋白品；4)将步骤3)中的粗蛋白加到离子液体/盐双水相体系中，在温度40~70 ℃，pH 4~9下分离纯化蛋白；5)将步骤4)中的离子液体相用膜分离法分离蛋白质并且回收离子液体，冷冻干燥得到高纯度蛋白粉。本发明的操作简单、无污染，蛋白质纯度高且保持其生物活性，是一种绿色节能且高效的蛋白质分离纯化新方法。
文档编号C07K1/14GK102796163SQ20121032878
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月6日 优先权日2012年9月6日
发明者刘晓庚, 刘琴, 陈梅梅, 潘春淋, 高梅, 万忠民, 曹崇江, 彭冬梅, 王立峰, 吴珂 申请人:南京财经大学