日本血吸虫重组抗原及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种日本血吸虫重组抗原，该重组抗原包含：日本血吸虫PGMRC2蛋白的SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。本发明还公开了该日本血吸虫重组抗原的制备方法及其在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用。本发明的日本血吸虫重组抗原，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组抗原的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体，两次动物保护实验分别诱导了22.08％和20.097％的减虫率，表明该重组抗原适于作为抗血吸虫病候选疫苗，具有很好的应用前景。
【专利说明】日本血吸虫重组抗原及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程【技术领域】，尤其涉及一种日本血吸虫重组抗原及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]日本血吸虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病。虽然我国在血吸虫病的防治上已经取得了巨大成就，但是由于中间宿主钉螺难以消灭及血吸虫重复感染现象严重，全面控制血吸虫病传播的前景仍不容乐观。吡喹酮自问世以来，以其高效、低毒、使用方便、价格低廉等优点在血吸虫病临床治疗和防治工作中得到广泛应用，并成为目前治疗血吸虫病的唯一药物，20多年来，未见有新的治疗血吸虫病的药物出现。然而，近年来在曼氏血吸虫上已经有了吡喹酮抗性虫株的报道，耐药虫株的出现引起了人们的不安与高度关注。因此，加强抗血吸虫高效疫苗的开发和新药物靶标的筛选显得格外重要。
[0003]在中国，日本血吸虫可以天然感染40余种哺乳动物，然而东方田鼠是目前为止发现的唯一一种日本血吸虫在其体内不能够发育完全的哺乳动物。基因芯片技术分析不同宿主即抗性宿主东方田鼠、非适宜宿主大鼠和适宜宿主BALB/c小鼠来源的IOd日本血吸虫童虫的基因差异表达情况，鉴定出一些基因在不同宿主来源的IOd虫体中呈现差异表达，其中在东方田鼠来源虫体中显著低表达的基因与血吸虫生长发育、新陈代谢、信号转导与发育进程相关。推测这些基因可能与血吸虫的生长发育密切相关，可以作为潜在的疫苗或者药物靶标进行进一步的研究。
[0004]日本血吸虫基因组对神经内分泌激素及其相关受体的研究发现，血吸虫虽然不像高级哺乳动物那样具有下丘脑、脑垂体、性腺等神经内分泌器官，但是其具有类似功能的一些细胞，可以编码一些激素受体，形成一个完整的激素通道，以致利用宿主的激素促进其自身生长发育。而宿主的性别也对血吸虫感染的进程和感染后症状起到一定的作用。有研究认为血吸虫影响雌性或者雄性宿主的能力是通过激素诱导的宿主免疫应答或者直接的激素作用来调节的。所以对于血吸虫性激素相关受体的深入研究可以促进血吸虫的新疫苗候选分子的研究。
[0005]PGMRC2(膜相关的孕酮受体组件2)以及和其密切相关的PGMRCl属于膜相关的孕酮受体家族(MAPR)，该天然蛋白首次从猪的肝脏细胞中纯化得到，并随后证实存在于多种真核动物中，包括线虫、昆虫、酵母菌和拟南芥等，其氨基酸序列拥有一个信号横跨膜结构和潜在的细胞色素b5的结合位点。该蛋白对孕酮有高亲和力，这种亲和力是相对于睾酮或者糖皮质激素的2-10倍，而且还可以结合其他分子例如亚铁血红素、胆固醇等。对于PGMRCl功能的研究，有证据表明，其可能参与并调节了大鼠粒层细胞中孕酮介导的抗细胞凋亡的过程并且其可能是哺乳动物精子顶体反应中孕酮感应的中间物。迄今为止，PGMRCl结合孕酮的信号转导通道还未被说明，但是在氨基酸序列基础上，预测酪氨酸激酶、激酶的绑定以及SH2和SH3有可能参与其中。
【发明内容】
[0006]本发明要解决目前缺乏抗血吸虫高效疫苗的技术问题，提供一种日本血吸虫重组抗原，该重组抗原包含日本血吸虫膜相关的孕酮受体组件2 (SjPGMRC2)的SEQ ID N0.1所示氨基酸序列，具有良好的免疫原性，适于作为抗血吸虫病候选疫苗。
[0007]此外，还需要提供一种上述日本血吸虫重组抗原的制备方法和应用。
[0008]为了解决上 述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0009]在本发明的一个方面，提供了一种日本血吸虫重组抗原，该重组抗原包含:日本血吸虫PGMRC2蛋白的SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
[0010]在本发明的另 一方面，还提供了一种日本血吸虫重组抗原基因，该重组抗原基因包含:编码日本血吸虫PGMRC2蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述日本血吸虫重组抗原基因的核苷酸序列的重组载体。
[0012]在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。
[0013]在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组抗原的制备方法，包括以下步骤:
[0014]构建含日本血吸虫PGMRC2基因的重组表达载体；
[0015]将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；
[0016]培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达日本血吸虫PGMRC2蛋白；
[0017]纯化重组表达的日本血吸虫PGMRC2蛋白。
[0018]在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述日本血吸虫重组抗原的抗血吸虫疫苗。
[0019]在本发明的另一方面，还提供了一种能与上述日本血吸虫重组抗原特异性结合的抗体。
[0020]在本发明的另一方面,还提供了一种由上述日本血吸虫重组抗原免疫动物产生的细胞因子。
[0021]在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组抗原的应用，用于制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物。
[0022]在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组抗原的应用，用于筛选预防或治疗血吸虫病的药物。
[0023]本发明日本血吸虫重组抗原，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组抗原的特异性IgG、IgGl和IgG2a抗体，还产生IFN-Gamma、IL-4细胞因子，且达到较高水平，两次动物保护实验分别诱导了 22.08%和20.097%的减虫率，表明该重组蛋白具有发展为抗血吸虫病候选疫苗及新药靶的潜力，具有很好的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0025]图1是本发明实施例1的重组原核表达质粒pET32a(+)_SjPGMRC2的双酶切鉴定图；[0026]图2是本发明实施例1的实时定量PCR分析SjPGMRC2在不同发育阶段血吸虫内的差异表达图；
[0027]图3是本发明实施例1实时定量PCR分析SjPGMRC2在不同宿主来源虫体中的相对表达量图；
[0028]图4是本发明实施例1实时定量PCR分析SjPGMRC2在不同性别宿主来源虫体中的相对表达量图；
[0029]图5是本发明实施例1重组蛋白SjPGMRC2表达时相分析图；
[0030]图6是本发明实施例1重组蛋白S jPGMRC2表达和纯化结果图；
[0031 ] 图7是本发明实施例2重组蛋白S jPGMRC2抗原性分析结果图；
[0032]图8是本发明实施例3实时定量PCR分析SjPGMRC2在不同试验组小鼠来源虫体中的相对表达量图；
[0033]图9是本发明实施例3抗rSjPGMRC2特异性IgG抗体水平的检测结果图；
[0034]图10是本发明实施例3细胞因子水平的检测结果图。
【具体实施方式】
[0035]下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京:科学出版社，2004)中所述的方法进行。
[0036]本发明应用生物信息学方法和基因工程技术研制出重组抗原pET32a_SjPGMRC2，该重组抗原在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组抗原的特异性IgG、IgGl和IgG2a抗体，还有IFN-Y、IL-4细胞因子的产生，且两次动物保护实验分别诱导了 22.08%和20.097%的减虫率，表明该重组蛋白具有发展为抗血吸虫病候选疫苗及新药靶的潜力。
[0037]实施例1日本血吸虫重组抗原的表达和纯化
[0038]1.方法
[0039]1.1重组表达质粒的构建
[0040]根据NCBI登录号为FN317689.1的SjPGMRC2的基因序列，设计引物，上游引物:5' ~TCGAATTCTGCGTTCTACTTGGCTATTT~3/ (SEQ ID N0.3，下划线处为 EcoR I 酶切位点)；下游引物:5' ~CGCTCGAGAGCTAATTTTTCTTTGAGTG~3/ (SEQ ID N0.4，下划线处为 Xho I 酶切位点)。以日本血吸虫28天虫体的cDNA为模板，PCR扩增其含有ORF的cDNA片段，反应组成如下:
【权利要求】
1.一种日本血吸虫重组抗原,其特征在于,该重组抗原包含:日本血吸虫PGMRC2蛋白的SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
2.一种日本血吸虫重组抗原基因，其特征在于，该重组抗原基因包含:编码日本血吸虫PGMRC2蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述日本血吸虫重组抗原基因的核苷酸序列。
4.一种包含权利要求3所述重组载体的宿主细胞。
5.一种权利要求1所述日本血吸虫重组抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 构建含日本血吸虫PGMRC2基因的重组表达载体； 将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞； 培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达日本血吸虫PGMRC2蛋白； 纯化重组表达的日本血吸虫PGMRC2蛋白。
6.一种抗血吸虫疫苗,其特征在于,包含权利要求1所述日本血吸虫重组抗原。
7.一种能与权利要求1所述日本血吸虫重组抗原特异性结合的抗体。
8.一种由权利要求1所述日本血吸虫重组抗原免疫动物产生的细胞因子。
9.权利要求1所述日本`血吸虫重组抗原的应用，其特征在于，用于制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物。
10.权利要求1所述日本血吸虫重组抗原的应用，其特征在于，用于筛选预防或治疗血吸虫病的药物。
【文档编号】C07K14/54GK103665149SQ201210330693
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月7日 优先权日:2012年9月7日
【发明者】林矫矫, 吴秀娟, 傅志强, 洪炀, 张旻, 韩艳辉, 李学珍, 赵彬, 王飞, 魏梅梅, 王馨茁, 李长健, 曹晓丹 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所