专利名称：一种依替巴肽的液相合成方法
技术领域：
本发明涉及一种依替巴肽的液相合成方法，属于生物化学领域。
背景技术：
依替巴肽(Eptifibatide)由美国COR Therapeutic公司研发，1998年在美国上市，用于急性冠脉综合症(Acute Coronary Syndrome, ACS)的治疗。通过抑制凝血因子I (Fibrinogen),与血小板糖蛋白II b / III a受体结合,从而抑制血小板聚集。在临床应用中，对不稳定型心绞痛、急性心肌梗死、冠状动脉介入等心血管疾病的治疗均显示了良好疗效。目前，心血管疾病逐年增加已成为现代社会对人类健康威胁严重的常见病之一，作为具有药效高、毒副作用低、不会在体内蓄积中毒等优势的多肽药物，依替巴肽可有效减少心血管事件的发生率，降低死亡率，其临床应用将会越来越广。目前已知的依替巴肽化学合成方法中，固相合成作为实验室研究是一个较好的方法，此方法高效、迅速，但固相合成原料利用率低，使用的试剂及溶剂昂贵、不易处理，用到的乙二硫醇、DMF等毒性较大不适合产业化生产。其中，采用Fmoc-Har-OH这一特殊氨基酸衍生物为起始原料，不但价格相当昂贵，而且由于侧链基团未保护，在有机溶剂中溶解性差，导致副产物增加，合成效率降低。此外，规模较小，仅局限在IL左右的反应体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能大规模制备依替巴肽的液相合成方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种依替巴肽的液相合成方法，包括合成三肽，合成四肽，合成七肽，环化，脱除保护基和胍基化六个阶段。具体步骤如下I)合成三肽将H-Cys (Trt) -NH2与Fmoc-Pro-OH进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸馏、加乙醚重结晶后得到二肽Fmoc-PiO-Cys (Trt) -NH2 ;然后脱除所述Fmoc-Pro-Cys (Trt) -NH2 中的 Fmoc 保护基，得到 H-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;再将得到的所述H-Pro-Cys (Trt)-NH2与Fmoc-Trp-OH进行偶合反应,然后再依次进行洗漆、干燥、减压蒸懼、加乙醚重结晶后得到三肽Fmoc-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ；2)合成四肽将Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH2 中的 Fmoc 保护基脱除，得到H-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;然后将所述 H-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 与 Fmoc-Asp (OtBu) -OH 进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸馏、加乙醚重结晶后得到四肽FmOC-Asp(0tBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;再将所述 Fmoc-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 中的 Fmoc保护基脱除，得到四肽 H-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ；3)合成七肽首先制备三肽Mpa (Trt)-Lys (Boc)-Gly-OH
将H-Gly-OMe与Cbz-Lys (Boc) -OH进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸馏、加乙醚重结晶后得到二肽Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe ;然后将所述Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe 中的 Cbz 保护基脱除，得到 H-Lys(Boc)-Gly-OMe ;再将所述H-Lys (Boc) -Gly-OMe与Mpa (Trt) -OH进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸懼、加乙醚重结晶后得到三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OMe ;再将所述三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OMe用NaOH溶液水解，然后再依次用水和乙醚浸洗，得到三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OH,其中所述水和乙醚质量比为3:1 ；其次将四肽H-Asp (OtBu)-Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2 与三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OH进行偶合反应,然后再依次进行洗漆、干燥、减压蒸懼、加乙醚重结晶后得到线性七肽 Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ；4)环化
Mpa-Lys(Boc)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-NH2将线性七肽环化得到环肽丨^I
权利要求
1.一种依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将H-Cys(Trt) -NH2与Fmoc-Pro-OH进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸馏、加乙醚重结晶后得到二肽Fmoc-PiO-Cys (Trt) -NH2 ;然后脱除所述Fmoc-Pro-Cys (Trt) -NH2 中的 Fmoc 保护基，得到 H-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;再将得到的所述H-Pro-Cys (Trt)-NH2与Fmoc-Trp-OH进行偶合反应,然后再依次进行洗漆、干燥、减压蒸懼、加乙醚重结晶后得到三肽Fmoc-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ； 2)将步骤I)中得到的Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt) -NH2中的Fmoc保护基脱除，得到H-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;然后将所述 H-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 与 Fmoc-Asp (OtBu) -OH 进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸馏、加乙醚重结晶后得到四肽FmOC-Asp(0tBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 ;再将所述 Fmoc-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 中的 Fmoc保护基脱除，得到四肽 H-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2,备用； 3)将H-Gly-OMe与Cbz-Lys(Boc) -OH进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸馏、加乙醚重结晶后得到二肽Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe ;然后将所述Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe 中的 Cbz 保护基脱除，得到 H-Lys(Boc)-Gly-OMe ;再将所述H-Lys (Boc) -Gly-OMe与Mpa (Trt) -OH进行偶合反应，然后再依次进行洗涤、干燥、减压蒸懼、加乙醚重结晶后得到三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OMe ;再将所述三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OMe用NaOH溶液水解，然后再依次用水和乙醚浸洗，得到三肽Mpa(Trt)-Lys(Boc)-Gly-OH,其中所述水和乙醚质量比为3:1 ； 4)将步骤2)中得到的四肽H-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2与步骤3)中得到的三肽Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OH进行偶合反应，然后再依次进行洗漆、干燥、减压蒸懼、加乙醚重结晶后得到线性七肽 Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2;5)将步骤4)得到的线性七肽 Mpa(Trt) -Lys (Boc) -Gly-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2环化得到环肽 6)将步骤5)得到的
2.根据权利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步骤I)中，所述H-Cys (Trt) -NH2与Fmoc-Pro-OH进行偶合反应的工艺条件为在偶和试剂为DIC和HOCt，溶剂为DCM，反应温度为O 35°C的条件下反应，其中，所述H-Cys (Trt)-NH2、Fmoc-Pro-OH及偶和试剂的摩尔数之比为I : I : 1.2; 所述脱除Fm0c-Pr0-Cys(Trt)-NH2中的Fmoc保护基的工艺条件为在试剂为Et2NH和DCM,反应温度为O 35°C的条件下，反应6小时； 所述H-Pro -Cys (Trt)-NH2与Fmoc-Trp-OH进行偶合反应的工艺条件为在偶和试剂为DIC和HOCt，溶剂为DCM，反应温度为O 35°C的条件下反应，其中，所述H-Pro-Cys (Trt)-NH2、Fmoc-Trp-OH及偶和试剂的摩尔数之比为I : I : I. 2。
3.根据权利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步骤2)中，所述脱除Fmoc-Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2中的Fmoc保护基的工艺条件为在试剂为Et2NH和DCM，反应温度为O 35°C的条件下，反应6小时； 所述H-Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2与Fmoc-Asp (OtBu)-OH进行偶合反应的工艺条件为在偶和试剂为DIC和HOCt，溶剂为DCM，反应温度为O 35°C的条件下反应，其中，所述H-Pro-Cys (Trt) -NH2> Fmoc-Asp (OtBu) -OH 及偶和试剂的摩尔数之比为 1:1:1.2 ； 所述脱除Fmoc-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2中的Fmoc保护基的工艺条件为在试剂为Et2NH和DCM，反应温度为O 35°C的条件下，反应6小时。
4.根据权利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步骤3)中，所述H-Gly-OMe与Cbz-Lys (Boc) -OH进行偶合反应的工艺条件为在偶和试剂为DIC和HOCt，溶剂为DCM，反应温度为O 35°C的条件下反应，其中，所述H-Gly-OMe、Cbz-Lys (Boc)-OH及偶和试剂的摩尔数之比为I: I: I. 2 ; 所述脱除Cbz-Lys(B0c)-Gly-OMe中的Cbz保护基的具体步骤为以Pd-C为催化剂，MeOH为溶剂，反应温度为0-35°C的条件下，通入H2进行催化氢化反应，反应时间12小时；其中，所述Pd-C催化剂的重量为所述Cbz-Lys (Boc) -Gly-OMe的10_20%，所述Pd-C催化剂的质量分数为10% ； 所述H-Lys (Boc) -Gly-OMe与Mpa (Trt) -OH进行偶合反应的工艺条件为在偶和试剂为DIC和HOCt，溶剂为DCM，反应温度为O 35 °C的条件下反应，其中，所述H-Lys(Boc)-Gly-OMe、Mpa(Trt)-OH 及偶和试剂的摩尔数之比为 1:1:1.2 ； 所述三肽Mpa (Trt)-Lys (Boc)-Gly-OMe用NaOH溶液水解的工艺条件为溶剂为Imol/L的NaOH溶液，反应温度为O 35°C ;反应时间为I. 5小时。
5.根据权利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步骤4)中，所述H-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) -NH2 与 Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OH 进行偶合反应的工艺条件为在偶和试剂为DIC和HOCt，溶剂为DCM，反应温度为O 35°C的条件下，反应时间4 小时；其中，所述 H-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys (Trt) _NH2、Mpa (Trt) -Lys (Boc) -Gly-OH 及偶和试剂的摩尔数之比为I: I: I. 2。
6.根据权利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步骤5)中，所述环化的具体步骤为将所述 Mpa (Trt)-Lys (Boc)-Gly-Asp (OtBu)-Trp-Pro-Cys (Trt)-NH2 与 I2的DCM溶液，在溶剂为DCM，反应温度为O 35°C的条件下进行反应，反应时间4小时，得到反应液，反应液分别用Na2S2O3溶液和饱和NaCl溶液萃取,再用无水Na2SO4干燥，然后加乙 醚析出粗产物，再用DCM和MeOH重结晶，得到环肽
7.根据权利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步骤6)中，将所 Mpa-Lys(Boc)-GIy-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-NH2述
8.根据权利要求I所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步骤7)中，将环七 Mpa-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2肽盐酸盐I
9.根据权利要求8所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，所述三氧化硫脲的制作步骤为将浓硫酸、双氧水及二氧化硫脲进行反应，反应温度为4°C，反应时间为12小时，水沉淀出所述三氧化硫脲；其中，所述浓硫酸、双氧水及二氧化硫脲的摩尔比为O.05:1:0. 8。
10.根据权利要求I至9任一项所述的依替巴肽的液相合成方法，其特征在于，在步骤I)至步骤4)中，所述洗涤步骤均为用NaHCO3溶液、盐酸溶液及饱和NaCl溶液依次进行洗涤；所述干燥剂均为无水Na2SO4干燥剂；所述减压温度均为30 40°C。
全文摘要
本发明涉及一种依替巴肽的液相合成方法，包括合成三肽，合成四肽，合成七肽，环化，脱除保护基和胍基化六个阶段。本发明液相合成依替巴肽的方法，解决了形成分子内二硫键合成环肽过程中导致副产物生成的问题，确立了脱除环肽侧链保护基的相关条件，建立了将环肽氨基转化为胍基的条件及方法，提高了收率；该方法的原料试剂均价廉易得，能有效降低产品成本，显著提高生产效益。
文档编号C07K7/06GK102924569SQ20121033964
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者高秀伟, 高秀岩, 任孝敏, 王朴 申请人:烟台海安多肽药物研发技术有限公司