专利名称：一种具有抗日本脑炎病毒感染的三肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于抗病毒生物制品技术领域，涉及ー种具有抗日本脑炎病毒感染的三肽及其应用。
背景技术：
日本脑炎又称こ型脑炎最初流行于日本，其分离与鉴定最早报道于1935年。日本学者于死者脑组织和三带_库蚊体内成功分离出JEV中山株(Nakayama strain),从而确定了本病的发病原因。我国最早的流行性こ型脑炎病例的报道是1921年，1940年我国学者从死者的脑组织中分离得到与日本报道的相同的こ脑病毒。
猪是こ脑的主要传染源之一，是其在自然界重要的储存、増殖宿主。猪群感染JEV可经蚊虫传播感染人群，并且与人流行性こ型脑炎感染和公共安全卫生密切相关。同时こ脑也是严重危害养猪业的重要的猪繁殖障碍疾病之一，患病猪主要表现为妊娠母猪流产、死胎、产弱仔，公猪睾丸炎以及少数仔猪的神经症状，给养猪业造成巨大的经济损失。E蛋白是JEV的最主要结构蛋白，其分子量为53KD，由500个氨基酸残基组成，在病毒的吸附与融合、毒力、组织嗜性、诱导免疫保护、血清特异性、血凝性等都起到重要作用，是主要的抗原成分。E蛋白序列有12个半胱氨酸Cys的保守区，形成了 6个ニ硫键。E蛋白的三维结构显示，E蛋白有三个结构域结构域I、II、III。结构域I含有两个ニ硫键，有糖基化位点与带有血凝性及生物活性的抗原表位。结构域II含有3个ニ硫键和ー个疏水区，具有中和活性及血凝活性的抗原表位，该结构域在病毒与宿主细胞发生融合的过程中起重要的作用。结构域III (EDIII)仅含ー个ニ硫键，具有受体结合活性，是JEV的ー个重要结构域。E蛋白单体在成熟的病毒表面以ニ聚体形势存在，在酸性条件下可成为三聚体，这与病毒进入细胞的膜融合有夫。E蛋白具有神经毒性和神经侵袭力的致病位点，E蛋白上第138和第176位的氨基酸在こ型脑炎的减毒过程中起了重要作用，E138突变可引起E蛋白的ニ级结构的变化，这两个位点的氨基酸突变可能改变了 E蛋白对细胞受体的吸附性，或者导致该病毒不能穿透其他细胞。E蛋白是中和作用的主要靶位点和JEV特异性抗体的作用位点，可激发中和抗体和保护性免疫。E蛋白还具有诱生血凝抑制抗体、补体结合抗体、中和抗体的功能，与特异性受体结合可粘附在细胞表面。日本脑炎E蛋白的第三个区域(EDIII)的空间结构已经解析，其结构显示其空间结构整体呈“桶装”结构，在其上端，下端有柔软的loop封顶，有文献报道上端的loop短肽在病毒与细胞受体结合，病毒的嗜性及病毒的毒力相关。因此我们初步确定及筛选NSK短肽，并验证其潜在的抗病毒能力。
发明内容
本发明的目的是提供ー种具有抗日本脑炎病毒感染的三肽NSK。本发明的另ー目的是提供该三肽的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现ー种具有抗日本脑炎病毒感染的三肽，其氨基酸序列为NSK。 本发明所述的三肽在抗日本脑炎病毒感染中的应用。有益效果根据日本脑炎病毒EDIII结构域从多个loop短肽中初步预测及筛选确定ー个小肽，序列是NSK。本发明采用人工合成的NSK三肽进行抗日本脑炎病毒的研究，该三肽作为潜在的抗病毒药物与传统的抗病毒化学药物相比有以下几个优点A此三肽合成方便、纯度高有比较完善和成熟的合成方法，能较方便的进行人工合成及纯化此人工合成的三肽经高效液相纯化及质谱检测，其纯度可达95%以上(图I)。
B无毒害物质此三肽属于蛋白质小肽类，其不具有明显的细胞毒性(图2)。C抗病毒作用明显该新型的三肽具有较好的抗病毒活性，在5 μ M浓度下，其在BHK-21细胞上具有半数抵抗(MOI=O. 02)日本脑炎病毒感染的作用。D具有潜在的临床应用价值此三肽具备较好的潜在抗日本脑炎病毒及各种黄病毒科病毒的活性，因此为这些病毒疾病的治疗和防制提供了可靠的依据。
图INSK活性三肽在ΒΗΚ-21细胞上的细胞毒性的测定結果。图2噬斑试验测定NSK活性三肽在ΒΗΚ-21细胞上抑制日本脑炎病毒感染的活性。1(^11-10(^丽51(三肽预先与朋1(-21细胞4で孵育I小时后，用日本脑炎病毒接毒(MOI=O. 02) ΒΗΚ-21细胞，48小时后取上清用噬斑试验测定滴度。图3荧光定量测定NSK活性三肽在ΒΗΚ-21细胞上抑制日本脑炎病毒感染的活性。10 μ Μ-100 μ匪SK活性三肽预先与ΒΗΚ-21细胞4°C孵育I小时后，再用日本脑炎病毒接毒(Μ0Ι = O. 02)BHK-21细胞，48小时后提取病毒RNA，进行荧光定量PCR測定。图4 Western blot测定活性三肽在BHK-21细胞上抑制日本脑炎病毒感染的活性。10 μ Μ-100 μ M NSK三肽预先与ΒΗΚ-21细胞4°C孵收集细胞，再用日本脑炎病毒接毒(Μ0Ι =0.02)BHK-21细胞，48小时后收取细胞，分别用针对JEV囊膜E蛋白的单抗及β-actin的单抗进行检，β-actin作为内參。图5 NSK活性三肽可以保护BALB/C小鼠免受日本脑炎病毒感染
具体实施例方式试验材料日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株购自上海生物制品公司，Escherichia coliDH5a, BL21 表达菌株均购自上海英俊公司；CytoTox 96 Non-Radioactive CytotoxicityAssay试剂盒购白promega公司，其他所用化学试剂及试剂盒均购白Takara公司；BHK_21细胞(仓鼠肾细胞)购自上海然泰生物科技有限公司，BALB/C小鼠购自上海生エ公司。实施例I通过分析日本脑炎病毒的E蛋白第三个区域EDIII，筛选出EDIII “桶装”结构上端的一个柔软loop肽，在初歩确定此loop肽抗日本脑炎病毒活性的基础上，运用丙氨酸替换的方法将此loop上的各个氨基酸(丙氨酸除外)突变为丙氨酸，然后将各个突变体EDIII进行原核可溶性表达纯化，然后測定各个突变体EDIlI的抗日本脑炎病毒的活性，通过与未突变的EDIII抗病毒活性相比，确定NSK是具有潜在抑制日本脑炎病毒活性的短肽。我们通过人工合成的方法合成NSK，并经过高效液相色谱纯化(4. 6X250_的C18柱，流动相A :水+0. 1% TFA B こ腈+0. I % TFA)，其出峰时间为3. 238分钟，通过质谱检测此三肽分子量为347. 78，纯度为95%。实施例2 NSK三肽在BHK-21细胞上的细胞毒性的测定结果BHK-21细胞记数后用含10%小牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，以2X103/孔的浓度滴加到96孔板，置于37°C，5% CO2培养箱中待细胞贴壁成单层(约17-18h)后用含2%小牛血清的DMEM营养液将合成的NSK小肽进行稀释200 μ Μ，100 μ Μ,50 μ Μ, 25 μ Μ, 10 μ Μ,每个浓度做五个重复，在96孔细胞培养板上将稀释的NSL小肽样品以100 μ I/孔分别预处理ΒΗΚ-21细胞24和48h后，分别取50 μ I上清，250g,离心5分钟， 然后转移到酶标板孔中，然后用CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒(promega公司)进行检测,在酶标板中490nm,读取数据(图I),由图2可见经NSK三肽(不同浓度200 μ M，100 μ M，50 μ M，25 μ M，10 μ M)处理的细胞释放到上清中的LDH (乳酸脱氢酶)的量与未经NSK三肽处理的细胞释放到上清中的量相比，两者没有明显的差别，说明NSK在ΒΗΚ-21细胞上不具有明显的细胞毒性。实施例3活性三肽在ΒΗΚ-21细胞上抑制日本脑炎病毒感染的活性(噬斑试验，荧光定量 PCR, Western blot)(I)噬斑试验测定活性三肽在BHK-21细胞上抑制日本脑炎病毒感染的活性BHK-21细胞记数后用含10 %小牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，以2X104/孔的浓度滴加到24孔板，置于37°C，5% CO2培养箱中待细胞贴壁成单层(约17-18h)。三肽NSK和打乱顺序对照肽SNK用无血清DMEM稀释到特定浓度后10 μ Μ-100 μ Μ,预先与ΒΗΚ-21细胞4°C孵育I小时后，再用日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株(购自上海生物制品公司)接毒(MOI=O. 02) BHK-21细胞，37°C，5% CO2培养箱孵育2小时，用PBS洗三遍，加2%小牛血清的DMEM维持夜500ul，置于37°C，5% CO2培养箱中培养48小时后，取上清，进行10倍比稀释后，接种到铺有单层的BHK-21的6空板中，37°C，5% CO2培养箱孵育2小时，用PBS洗三遍，加入含有2%小牛血清的1%低熔点琼脂糖，37°C，5% CO2培养箱培养3-5天，用I %结晶紫室温染色30分钟，然后进行空斑计数，结果显示NSK都能产生明显抑制JEV感染，通过Microsoft Excel软件曲线拟合的方法得出半数抑制浓度为5 μ Μ，并且具有明显的计量依赖性(图2)。(2)荧光定量測定活性三肽在ΒΗΚ-21细胞上抑制日本脑炎病毒感染的活性ΒΗΚ-21细胞记数后用含10 %小牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，以2 X IO4/孔的浓度滴加到24孔板，置于37 °C，5 % CO2培养箱中待细胞贴壁成单层(约17-18h)。三肽NSK及打乱顺序对照肽SNK先用无血清DMEM稀释到特定浓度后10μΜ-100μΜ，·*~ΒΗΚ-21细胞4°C孵育I小时后，再用日本脑炎病毒接毒(MOI=O. 02)BHK-21细胞，37 °C，5% CO2培养箱孵育2小时，用PBS洗三遍，加2%小牛血清的DMEM维持夜500ul，置于37°C，5% CO2培养箱中培养48小时后，提取病毒DNA。用Takara公司病毒DNA提取试剂盒按其操作说明书提取JEVRNA，溶于30ml超纯水中，用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测。在ABI公司7300型全自动实时荧光定量PCR仪上扩增并检测荧光。同时采用肌动蛋白(β-actin)基因作为内參。所用的PCR引物β-actin_F:5-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3 (SEQ ID NO. I)；β -actin-R:5-ATGGAGCCACCGATCCACA-3 (SEQ ID NO. 2); JEV-NS 1_F: 5-ACACTCGTCAGATCACAGGTTCA-3 (SEQ ID NO. 3) ；JEVNS 1-R: 5-GCCAGAAACATCACCAGAAGG-3 (SEQ ID NO. 4)。25 μ L PCR 反应体系中含 2X SYBRGreen PCR MasterMix 12. 5 μ L，10pmol/L 的上、下游引物各 I μ L，DNA 2 μ L, 2. 5mMdNTP2 μ L，TaqDNA 聚合酶 0· 25μ L，超纯水 6· 25 μ し扩增參数为95°C 30s，95°C 10s、55°C 15s、72 °C 30s，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的測定，反应条件为95°C 15s、60 °C lmin、95°C 15s,60 °C 15s。反应结束后通过 ABIPRISM7300SDS software (AppliedBiosystems)软件分析数据。本实验中采用2_Λ 法进行PRV的相对定量。即提取単独接毒JEV的DNA作10倍梯度稀释(稀释范围为10°-10_6)的样品做出标准曲线，由此确定各组所用的稀释度，同时测得各组样品的ct值，然后采用相对定量公式，经内參基因GAPDH的内均一化处理后即可算出各组样品相对于单独接毒JEV样品的表达量。结果显示NSK都能产生明显抑制JEV感染，并且具有明显的计量依赖性(图3)。 (3) Western blot测定活性三肽在BHK-21细胞上抑制日本脑炎病毒感染的活性BHK-21细胞记数后用含10 %小牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，以2 X IO4/孔的浓度滴加到24孔板，置于37 °C，5 % CO2培养箱中待细胞贴壁成单层(约17-18h)。三肽NSK先用无血清DMEM稀释到特定浓度后10 μ Μ-100 μ M，预先与BHK-21细胞4°C孵育I小时后，再用日本脑炎病毒接毒(Μ0Ι=0. 02)BHK-21细胞，37°C，5% CO2培养箱孵育2小时，用PBS洗三遍，加2%小牛血清的DMEM维持夜500ul，置于37°C，5% CO2培养箱中培养48小时后，弃去上清，加200ulPBS，冻融三次后，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度，进行SDS-PAGE分析，确保每空总蛋白量一祥多，然后转印PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，然后PBST洗三次，每次10分钟，分别用抗JEV囊膜E蛋白的单抗，及β -actin的抗体进行孵育，室温2小时，然后PBST洗三次，毎次10分钟，然后用过氧化物酶标记的羊抗小鼠ニ抗(I :5000)进行检测，室温I小时，然后PBST洗三次，用ECL发光试剂盒进行曝光检测(图4)。由图5可见，BHK-21细胞感染こ脑病毒的E蛋白的量随着NSK三肽浓度的減少有明显的增多，说明病毒的量随着NSK三肽浓度的增多有明显的減少，与对照相比此三肽有明显的抑制活性，并具有计量依赖性。实施例3活性三肽在小白鼠模型上抑制日本脑炎病毒感染的活性2周龄的BALB/c小鼠,饲养一周后,此三肽30mg/kg预先腹腔注射小白鼠，I小时后，再经腹腔攻毒(5倍的LD50病毒量)，同时设PBS (不攻毒)，PBS (仅攻毒)对照，6天后，对照组开始死亡，8天全部死亡，试验组成活率仍为90%，然后持续观察21天，试验组成活率为25% (图5A)。此外此三肽2mM的浓度，预先脑部注射小白鼠30ul，I小时后，再经脑部攻毒(2倍的LD50病毒量)，同时设PBS (不攻毒)，PBS (仅攻毒)对照，4天后全部死亡，试验组成活率仍为90%，然后持续观察21天，试验组成活率为70%。其结果说明此三肽(NSK)能明显提高致死剂量JEV攻毒后，小白鼠的成活率(图5B)。
权利要求
1.一种具有抗日本脑炎病毒感染的三肽，其氨基酸序列为NSK。
2.权利要求I所述的三肽在抗日本脑炎病毒感染中的应用。
全文摘要
本发明属于抗病毒生物制品技术领域，公开了一种具有抗日本脑炎病毒感染的三肽及其应用。根据日本脑炎病毒EDIII结构域的loop肽中筛选确定一个三肽，其序列为NSK。体外实验结果显示用此肽预处理BHK-21细胞，能明显干扰及抑制日本脑炎病毒的感染；体内实验结果表明先腹腔或脑部给药此三肽再用致死剂量的日本脑炎病毒攻击BALB/c小白鼠后，能明显提高小鼠的成活率。
文档编号C07K5/093GK102827248SQ20121035842
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者茅翔, 李晨, 于亚玲, 葛玲玲, 王月, 孙明霞 申请人:南京农业大学