专利名称：一种肽的固相合成方法及其合成的肽的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种含不对称二硫键的肽的固相合成方法，以及由此方法合成的肽。
背景技术：
二硫键(disulfide)在蛋白质及多肽分子中对保持其生物活性和构象稳定有着举足轻重的作用。含有二硫键的小分子肽通过溶液法或固相合成法合成时，通常是将脱保护的线性肽链中的两个半胱氨酸(Cys)残基的巯基氧化成二硫键。两个半胱氨酸形成一个二硫键的方法有很多，例如，中国专利申请CN102336808A报道了一种奥曲肽二硫键氧化环合的方法，其采用醋酸铵缓冲液作为氧化工作液，在pH 7. 5-8. 5下，将合成的奥曲肽前体直八肽氧化成环八肽，所述方法氧化条件温和，副反应少，产物纯度高，最后产品收率高，适用于规模化生产。当多肽分子含多对Cys残基时，二硫键的形成受许多因素影响，可能导致 形成多种异构体，产物的产率降低，且给分离纯化带来许多麻烦。现有技术中没有不对称二硫键的合成方法，而实际多肽药物中有许多含有不对称二硫键的药物。因此，需要一种含不对称二硫键的肽的合成方法。
发明内容
本发明提供了一种含不对称二硫键的肽的合成方法，其包括以下步骤(I)合成与固相载体2-三苯甲基氯树脂相连接的肽，所述肽包含三个或三个以上的半胱氨酸或高半胱氨酸的残基，其中两个所述半胱氨酸或高半胱氨酸的侧链各自被S-烷基-硫基保护基团保护，其中所述烷基为未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其卤代变体或卤素进一步取代，其中两个保护基为相同或不同，其中其余的半胱氨酸或高半胱氨酸的侧链被三苯甲基-、叔丁基-、乙酰氨基甲基-、烷基化的乙酰氨基甲基-、烷基化的三苯甲基-保护基团保护，(2)使所述肽与S-烷基-硫基保护基团去除剂反应，(3)使所述肽在氧气存在下且在无非均相催化剂存在下形成不对称二硫键，(4)裂解肽树脂得到含不对称二硫键的肽。此外，本发明还提供一种合成的含不对称二硫键的肽，其具有以下通式
权利要求
1.一种含不对称二硫键的肽的合成方法，其包括以下步骤 (1)合成与固相载体2-CTC树脂相连接的肽，所述肽包含三个或三个以上的半胱氨酸或高半胱氨酸的残基，其中两个所述半胱氨酸或高半胱氨酸的侧链各自被S-烷基-硫基保护基团保护，其中所述烷基为未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其卤代变体或卤素进一步取代，其中两个保护基为相同或不同，其中其余的半胱氨酸或高半胱氨酸的侧链被三苯甲基_、叔丁基_、乙酰氨基甲基_、烷基化的乙酰氨基甲基_、烷基化的三苯甲基-保护基团保护， (2)使所述肽与S-烷基-硫基保护基团去除剂反应， (3)使所述肽在氧气存在下且在无非均相催化剂存在下形成不对称二硫键， (4)裂解肽树脂得到含不对称二硫键的肽。
2.权利要求I的合成方法，其中所述方法包括在步骤(4)后采用HPLC方法纯化所述肽，最终得到精肽；优选所述纯化方法为将所述肽经过滤后用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟乙酸水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，其中流动相A相为体积比为O. 1% TFA水溶液，B相为纯乙腈。
3.权利要求I的合成方法，其中在步骤(I)中用于合成肽的偶联剂包括选自以下的一种或多种混合酸酐、活化的酯或酰基卤、碳二亚胺、活化的苯并三嗪衍生物、苯并三唑的脲鎗或鱗盐衍生物、BOP, PyBOP, PyAOP, HCTU, TCTU, HATU, TATU, TOTU, HAPyU,或其混合物；步骤(I)优选在碱存在下发生反应，所述碱优选为N，N- 二异丙基乙胺、N, N’ - 二烷基苯胺、2,4,6-三烷基吡啶或N-烷基吗啉，其中所述烷基是直链或支链C1-C4烷基，更优选为N-甲基吗啉或2，4，6_三甲基吡啶，最优选为2，4，6_三甲基吡啶；步骤(I)优选使用偶联添加齐U，特别是苯并三唑类的偶联添加剂，优选为N-羟基苯并三唑衍生物或N-羟基苯并三嗪衍生物，更优选为N-羟基丁二酰亚胺、N-羟基-3，4- 二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪、1_羟基-7-氮杂苯并三唑和N-羟基苯并三唑，最优选为N-羟基苯并三唑；步骤(I)优选使用20%哌啶/N-甲基吗啉溶液，20%哌啶/DMF溶液，进行碱不稳定性N α的脱保护，尤其用于固相合成中N-末端的Fmoc或Boc保护。
4.权利要求I的合成方法，其中步骤(I)中的所述肽具有至少另一种侧链保护基团，包括Trt、tBu、Pbf、OtBu, Acm, Boc ;优选地，所述S-烷基-硫基保护基团为S-叔丁基硫基保护基团；优选地，步骤(I)所得的肽的替代度范围可小于O. 5mmol/g,优选为O. 1-0. 5mmol/g，更优选为O. 3mmol/g0
5.权利要求I的合成方法，其中所述肽中半胱氨酸或高半胱氨酸被至少3个残基隔开，优选被至少5个残基隔开；优选地，所述肽包括2-100个氨基酸残基；优选地，所述高半胱氨酸的侧链包括2-15个亚甲基和I个巯基。
6.权利要求I的合成方法，其中所述S-烷基-硫基保护基团去除剂为三烷基膦或巯基试剂，优选为三正丁基膦或硫醇类；其中所述三烷基膦或硫醇类的投料倍数优选大于10倍，更优选为10倍-100倍，最优选为50倍。
7.权利要求I的合成方法，其中步骤⑵的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮，或其混合物，优选N，N-二甲基甲酰胺/异丙醇混合液(混合比优选为10 D ;步骤(2)优选在惰性气体保护下进行反应，所述惰性气体优选为氮气、氩气，更优选为氮气。
8.权利要求I的合成方法，其中步骤(3)的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、二氯亚砜，或其混合物，优选DMF和DCM的混合液(混合比优选为4 I);步骤(3)优选在碱存在下发生反应，所述碱可为碱性盐(如乙酸钠)或胺，优选为胺，更优选为叔胺，最优选为三乙胺；步骤(3)中所述的氧气优选是鼓泡到反应液体中的；步骤(3)的所述非均相催化剂可为炭；步骤(3)的反应时间优选为10h-40h，更优选为20h-35h，最优选为 30h。
9.权利要求I的合成方法，其中步骤(4)是脱除所有侧链保护基同时将粗肽从树脂上切割下来得到含不对称二硫键的肽，其中肽树脂裂解所采用的裂解液优选为三氟乙酸、三异丙基硅烷和水的混合试剂，所述混合溶剂的比例优选为-JFA为85% -99% (V/V) ,TIS为10% -1% (V/V)、余量为水，更优选比例为 90%-95% (V/V)、TIS 为 5%-3% (V/V)、余量为水，最优选为TFA TIS :水=94 : 3 : 3 (V/V);或者，所述裂解液优选为三氟乙酸、三异丙基硅烷、苯甲醚、苯甲硫醚的混合试剂，所述混合试剂的比例优选为TFA TIS :苯甲醚苯甲硫醚=90 : 3 : 2 : 5。
10.一种根据权利要求1-9中任一项的方法合成的含不对称二硫键的肽，其具有以下通式
全文摘要
本发明提供了一种含不对称二硫键的肽的固相合成方法，以及由此方法合成的肽。
文档编号C07K1/04GK102875639SQ20121036482
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者王宇恩, 陈永汉, 刘剑, 马亚平, 袁建成 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司