耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原HI₂的纯化方法

专利名称：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原HI₂的纯化方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，特别涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原HI2的纯化方法。
背景技术：
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)是能够感染人体任何一个部位的革兰阳性球菌，局部感染经久不愈，全身感染死亡率高达20%，已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一。万古霉素是治疗MRSA的最后一道防线，但1997以来年耐万古霉素的MRSA相继被分离出来，使MRSA即将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，加强对MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。因此，研发一种有效的疫苗可能是预防和控制MRSA感染及其耐药性发展有效途径。细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接·有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。IsdB不仅是MRSA —个重要外膜铆钉蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具。以IsdB为组分的基因工程疫苗正在进行II期临床试验。此外，金黃色葡萄球菌可通过产生溶血素、凝固酶、杀白细胞素等多种致病因子引起人和动物的多种疾病一溶血素(Hla)便是其中的一种重要的致病因子。Hla是一个在大多数临床分离株上都表达的穿孔形成毒素。它与多种疾病有关如肺炎，败血症关节炎及脑脓疮等。Hla单体约33kDa，以七聚体形式发挥功能，每个单体的110-150氨基酸互相靠拢在磷脂双分子层上形成孔。随后导致细胞膜破坏，胞内离子渗出等。其毒性很强，在很低浓度情况下即可致病。Hla抗血清能够抑制金黃色葡萄球菌的细胞毒性作用，也能降低金黃色葡萄球菌黏附到宿主细胞上的机率。Hla免疫接种后使机体获得抗金黃色葡萄球菌感染的保护作用。Hla和IsdB都是MRSA的固有蛋白成分，其编码基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候选抗原。我们已经构建了既能很好去除MRSA这些蛋白对细胞的毒性，又能保持这些蛋白抗原性的重组双亚单位基因工程蛋白HI2。目前尚未见针对(MRSA)重组双亚单位基因工程蛋白HI2疫苗制备中的纯化方法的报道。

发明内容
本发明的目的，是提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组双亚单位基因工程疫苗候选抗原HI2制备中的纯化方法。该方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，回收率较好。本发明采用了以下步骤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程疫苗候选抗原HI2制备中的纯化方法，该抗原HI2的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，其纯化方法包括以下步骤A)收集自构建表达抗原HI2的大肠杆菌工程菌高密度发酵的菌体；B)采用高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切，MMC层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的HI2进行纯化，获得了高纯度的rHI2。所述步骤B具体如下I)高压破菌将收集的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程蛋白HI2的大肠杆菌菌体以pH7. 0-7. 5的10-20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；2)硫酸铵分步沉淀4°C搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集沉淀；3)沉淀复溶称量沉淀湿重，按重量体积比1:10比例加入pH7. 0-7. 5的10_20mMPBS缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清；4) GST亲和纯化选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBS-Tween80pH7. 0-7. 5条件下对目标蛋白进行纯化,Prescission Protease酶(PP酶)进行酶切洗脱5) MMC层析纯化步骤4)收 集的样品，pH调至3-5，使用pH3_5的NaAC缓冲液平衡层析系统及MMC层析柱，采用ρΗΙΟ. 5-11为Na2CO3缓冲液梯度洗脱；6)凝胶过滤层析纯化将步骤5)纯化获得的样品，使用凝胶过滤Superdex层析柱纯化，采用PH7. 0-7. 5的10-20mM PBS平衡层析系统及层析柱，去除痕量非目标蛋白等杂质，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液。步骤I)所采用生产或中试纯化中的60_80MPa高压匀浆破菌技术，破菌率大于96%，离心获取破菌上清。步骤2)酸铵硫分步沉淀和步骤3)再复溶。步骤4)所述的GST亲和纯化，所使用的填料为GST-S印harose4B或GST_Sepharose6B 或 GST-Sepharose FastFlow 或 GST-Sepharose HP。步骤4)所使用的Prescission Protease酶带有GST标签，以利于去除PP酶。步骤5)所述的纯化方法，MMC层析的填料为Capto MMC ；步骤6)所述的凝胶层析柱为 Superdex75 或 Superdex200 或 Superdex HR10/30。所述抗原通过以下步骤制备的I)设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码HI2蛋白活性片段的核酸序列；2)将步骤I)所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；3)诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。发明效果采用的本发明所述纯化方法，从表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组双亚单位基因工程候选抗原(本申请明明为HI2)的大肠杆菌工程菌中可以获得大于98%的HI2,得率60%以上，整个纯化过程无需额外再置换缓冲液。经鉴定本发明人构建获得的HI2分子量约为46kD。本发明所述的纯化方法主要有硫酸铵分步沉淀、GST纯化、MMC层析、分子筛各步SDS-PAGE。通过上述工艺处理不同批次的HI2作12%SDS_PAGE，呈现出单一目标蛋白条带，分子量约为46kD。HPLC C3柱分析呈现单一的峰，纯度在99%以上。等电点在pH7.1左右。不同HI2肽指纹图谱各峰峰数均保持一致，各峰的保留时间均在±10Sec内波动，说明肽图谱重现性好。纯化后的HI2与氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂共同注射免疫BalB/C小鼠，发现HI2加免疫佐剂组血清中的I gG水平显著高于阴性对照组(PBS组)(P〈0. OI)，证明使用本发明人纯化方法获得的HI2可有效刺激机体产生较高的免疫应答。使用MRSA国际标准株252 (购自ATCC)感染，发现HI2W免疫佐剂组感染率为15%，阴性对照组(PBS组)感染率为90%，计算得出HI2抗MRSA感染的保护率为83. 3%，表明该蛋白片段具有良好的免疫原性和免疫保护性，可用作耐甲氧西林葡萄球菌重组基因工程疫苗的候选抗原。


图1为硫酸铵沉淀SDS-PAGE结果图，图中，泳道1:标准蛋白；泳道2 30%硫酸铵上清；泳道3 :30%硫酸铵沉淀；泳道4 :40%硫酸铵沉淀上清；泳道5 :40%硫酸铵沉淀；图2为HI2蛋白GST亲和层析及PP酶切SDS-PAGE结果图，图中，泳道1:标准蛋白；泳道2 =GST结合PP酶切样品；泳道3: GST结合PP酶切后PBS洗涤样品I ;泳道4 =GST结合PP酶切后PBS洗涤2 ;泳道5 =GST结合前样品；泳道6 =GST结合流穿样品；泳道7 =GST结合样品；图3为HI2蛋白MMC层析图；图4 为 HI2 蛋 白 Superder2OO 层析
图5为MMC及Superdex200层析纯化效果图，图中，泳道1:标准蛋白；泳道2 =GST未和PP酶切后样品；泳道3 :MMC层析后样品；泳道4 :Superdex200层析后样品。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作详细描述实施例一抗原HI2的制备(一)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA、IsdB、mSEC基因的克隆1.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA252(来源于ATCC)(第三军医大学药理学教研室保存)2.液氮罐中取出保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌WH0-2菌株涂布于WH0-2专用固体培养基上，于37°C，培养过夜。基因组抽提试剂盒抽提MRSA基因组。3.采用PCR方法自MRSA基因组分别扩增IsdB、Hla的编码基因。I)引物设计合成如下(下划线示酶切位点碱基序列)根据GenBank公布的基因序列及引物设计原则，设计相应的引物，引入酶切位点。2 )目的基因的PCR扩增
权利要求
1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原HI2的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤A)收集自构建表达抗原HI2的大肠杆菌工程菌高密度发酵的菌体；B)采用高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切，MMC层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的HI2进行纯化。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤B如下1)高压破菌将收集的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程蛋白HI2的大肠杆菌菌体以PH7. 0-7. 5的10-20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；2)硫酸铵分步沉淀4°C搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集沉淀；3)沉淀复溶称量沉淀湿重，按重量体积比1:10比例加入pH7. 0-7. 5的10_20mM PBS 缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清；4)GST亲和纯化选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBS-Tween80pH7. 0-7. 5 条件下对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱5)MMC层析纯化步骤4)收集的样品，pH调至3-5，使用pH3_5的NaAC缓冲液平衡层析系统及MMC层析柱，采用ρΗΙΟ. 5-11为Na2CO3缓冲液梯度洗脱；6)凝胶过滤层析纯化将步骤5)纯化获得的样品，使用凝胶过滤Superdex层析柱纯化，采用PH7. 0-7. 5的10-20mM PBS平衡层析系统及层析柱，去除痕量非目标蛋白等杂质， 分离纯化目标蛋白，置换缓冲液。
3.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于步骤I)所采用生产或中试纯化中的 60-80MPa高压匀浆破菌技术，离心获取破菌上清。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤2)硫酸铵分步沉淀和步骤3)再复溶。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤4)所述的GST亲和纯化，所使用的填料为 GST-Sepharose 4B 或 GST-Sepharose 6B 或 GST-Sepharose FastFlow 或 GST-Sepharose HP。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤4)所使用的Prescission Protease酶带有GST标签。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤5)所述的纯化方法，MMC层析的填料为 Capto MMC ；
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤6)所述的凝胶层析柱为 Superdex75 或 Superdex200 或 Superdex HR10/30。
9.如权利要求1至8任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述抗原是通过以下步骤制备的1)设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码HI2蛋白活性片段的核酸序列；2)将步骤I)所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化
全文摘要
本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原HI2的纯化方法。HI2蛋白为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Hla和IsdB两个抗原分子的活性功能片段重组融合、大肠杆菌基因工程菌表达获得。采用对基因工程菌进行高压破菌、盐析、GST亲和层析、PP酶切、MMC层析、凝胶过滤层析等技术，获得高纯度的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组双亚单位基因工程蛋白HI2。该发明纯化工艺简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。
文档编号C07K1/36GK103044531SQ201210375859
公开日2013年4月17日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者郭鹰, 邹全明, 曾浩, 董衍东, 樊绍文, 卢陆, 鲁东水, 章金勇, 敬海明 申请人:重庆原伦生物科技有限公司, 中国人民解放军第三军医大学