专利名称：一种具有抗过敏活性的大枣中环磷酸腺苷的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种从大枣中提取具有抗过敏活性环磷酸腺苷的方法
背景技术：
枣树是我国特有的一种果树，我国的枣树栽培面积占全世界栽培总栽培面积的95%以上。大枣是一种常用中药，大枣中环磷酸腺苷(cAMP)含量为100 600nmol/g，在180多种天然植物中含量最高。“环磷酸腺苷”(简称cAMP)具有扩张血管和抗过敏作用，过敏性患者大多是由于人体细胞内cAMP浓度下降，环磷酸鸟苷(cGMP)浓度增高，cAMP和cGMP比值偏低所致。cAMP和cGMP是存在于机体的一对重要的环核苷酸酶，广泛存在于一切细胞中，在生命活动以及疾病的发生和发展过程中起着重要的作用。大枣内含有丰富的cAMP和cGMP活性物质，当cAMP活性物质被消化道吸收，分布到末梢组织，这些组织内cAMP与cGMP的比值将呈显著持续的增高，使得免疫细胞中的环磷酸腺苷的量增加，进而可以对抑制过敏免疫反应有良好的效果。环磷酸腺苷可以通过化学合成、生物发酵、天然产物分离提取等方法获得，但是化学合成所用溶剂有一定的毒性，易污染环境，生物发酵菌种限制且难以分离，而植物尤其是大枣中cAMP含量是目前所知中最高的，如何从天然产物中较简便的分离出cAMP，是当前研究所要解决的主要问题。目前关于天然来源cAMP提取物的发明专利国内外都比较少，国内的刘孟军、王永惠等以及国外的Truelsen TA等测定了多种植物中的cAMP的含量，其中大枣以38nmol/g居首位。目前国内关于大枣中cAMP的提取方法比较常用的有Hanabusa K等利用溶剂浸 提的方法从大枣中提取cAMP，李明润等通过三次阴离子交换柱层析和一次氧化铝层析提取cAMP。但是提取工艺繁琐、提取成本较高、提取效率低且提取过程中糖分没有被完全提取出来。因此，从提高提取效率、降低工艺成本、加强综合利用等方面来看，现有的生产工艺都需要大力提高。这对环磷酸腺苷的工业化生产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是充分利用我国丰富的大枣资源，深层挖掘大枣以及枣中cAMP抗过敏的保健价值，具有工艺简单、提取率高、成本低、原料丰富等特点。为实现上述目的，本发明由以下步骤组成I)将筛选后的大枣原料进行去皮、去核、洗涤、粉碎等预处理，利用乙醇进行闪式提取。提取液冷却至室温后通过抽滤、浓缩、静置得到澄清透明枣汁。2)将澄清提取液通过装有大孔树脂的树脂柱进行吸附，根据饱和吸附试验的结果确定采用HPD-400型树脂。在一定pH值下通过适宜浓度的乙醇洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱液。3)将洗脱液收集，经过真空浓缩，浓缩至原体积的1/3，加入无水乙醇，静置、过滤并通过真空冷冻干燥得到大枣cAMP提取物粉末。将得到的大枣cAMP提取物进行Elson-Morgan法抗过敏检测,得到其抗过敏抑制率。
步骤I)所述的乙醇水溶液的浓度为40 % 70 %。步骤I)所述的料液比为I : 20 30。步骤I)所述的提取时间为20 40s。步骤2)所述的pH值为4. O 5. 5。步骤2)所述的洗脱流速为2 4BV/H。步骤2)所述的洗脱乙醇浓度为40 70%。步骤3)Elson-Morgan法抗过敏检测透明质酸酶活性为500_800U/mL。一般植物提取过敏抑制率达到50%即认为有抗过敏效果，而本产品抑制率达到 76. 2%。
下面对附图进行简要说明。图I是大枣环磷酸腺苷通过闪式提取、纯化并进行抗过敏活性检测的工艺流程图。图2是样品浓度在O 30mg/mL范围内的环磷酸腺苷抗过敏活性检测抑制率图。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明的范围。实施例I :取IOOg大枣进行去皮、去核、洗涤等预处理后，加入60%的乙醇溶液放入闪式提取器进行闪式提取，提取时间为40s，料液比为I : 20。提取液冷却至室温后通过抽滤、浓缩、静置得到澄清枣汁。在内径为I. 5cm的交换柱内装入大孔吸附树脂HPD-400，大枣闪提液上柱后除杂(去离子水)，pH = 4. 5，吸附以及洗脱流速为4BV/H，选择40 70%乙醇溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱液。洗脱液经过浓缩、真空冷冻干燥后测定cAMP的提取率为 135. 24ug/g。实施例2 称取500g大枣经过进行去皮、去核、洗涤等预处理后加入60%的乙醇溶液放入闪式提取器进行闪式提取，提取时间为40s，料液比为I : 20。提取液冷却至室温后通过抽滤、浓缩、静置得到澄清枣汁。在内径为5cm的交换柱内装大孔吸附树脂HPD-400型500mL，大枣闪提液5000mL上柱后除杂(去离子水)，pH = 4. 0，吸附及洗脱流速为4BV/H，选择40 70%乙醇溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱液。洗脱液经过浓缩、真空冷冻干燥后测定cAMP的提取率为121. 43ug/g。实施例3 对实施例I中的cAMP提取物通过Elson-Morgan法进行抗过敏检测，将提取物加入2. 5mol/L的氯化钙溶液中，加入500U/mL的透明质酸酶O. 5mL,加入pH = 5.6的醋酸缓冲液O. 5mL,在37°C下保温20min,加入I. 6mg/L的透明质酸钾O. 6mL,并在37°C下保温40min,室温下放置IOmin并加入NaOH溶液以及ImL乙酰丙酮,经过沸水浴15min、冰水浴5min、放置室温IOmin后，加入ImLP-DAB显色剂，室温放置30min后测量其在585nm处的吸光值，通过以下抑制率公式进行计算
权利要求
1.一种从大枣中提取具有抗过敏活性环磷酸腺苷(CAMP)的工艺方法，其特征在于包括下述步骤将筛选后的大枣原料进行包括去皮、去核、洗涤和粉碎的预处理后，利用乙醇溶液进行闪式提取，提取液通过装有HPD-400型树脂的树脂柱进行吸附、乙醇梯度洗脱、解吸、解吸液浓缩、干燥后得到含cAMP的大枣提取物产品。
2.一种如权利要求I所述的从大枣中提取具有抗过敏活性环磷酸腺苷(cAMP)的工艺方法，其特征在于包括以下步骤 1)将筛选后的大枣原料进行包括去皮、去核和洗涤的预处理，利用乙醇溶液在闪式提取器进行闪式提取，得到提取液； 2)提取液冷却至室温后通过抽滤、浓缩、静置得到澄清透明枣汁； 3)将澄清提取液在装有HPD-400型大孔树脂的树脂柱中进行吸附，pH= 4. O 5. 5，吸附及洗脱流速为2 4BV/H，选择浓度为40 70%的乙醇溶液为适宜的洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱液； 4)上述步骤中得到的解吸液经浓缩、干燥后得到cAMP大枣提取物产品。
3.根据权利要求I或2所述的从大枣中提取具有抗过敏活性环磷酸腺苷(cAMP)的工艺方法，其特征在于对cAMP大枣提取物产品进行Elson-Morgan法进行抗敏活性检测，并通过抑制率公式得到其过敏抑制率最大为76. 2%。
4.根据权利要求2所述的，其特征在于所述的步骤I)中的乙醇溶液浓度为40 60%。
5.根据权利要求2所述的，其特征在于所述的步骤I)中的乙醇料液比为I: 20 30。
6.根据权利要求2所述的，其特征在于所述的步骤I)中的提取时间为20 40s。
7.根据权利要求2所述的，其特征在于所述的HPD-400型树脂乙醇溶液洗脱梯度为40 70%。
8.根据权利要求2所述的，其特征在于所述的HPD-400型树脂适宜的吸附pH= 4. O 5.0，吸附及洗脱流速为2 4BV/H。
9.根据权利要求I或2所述的，其特征在于干燥后cAMP的提取率为120 135μ g/g。
10.一种具有抗过敏活性环磷酸腺苷(cAMP)，其特征在于是采用如权利要求I 9任一项所述的方法进行制备。
全文摘要
本发明是一种从大枣中提取具有抗过敏活性的环磷酸腺苷(cAMP)的工艺方法。将大枣经过预处理后，利用乙醇进行闪式提取(乙醇浓度40％-70％、料液比1∶20～30、提取时间20～40s)、提取液在装有大孔吸附树脂的树脂柱中进行吸附(HPD-400型树脂、pH＝4.0～5.5、吸附及洗脱流速为2～4BV/H、乙醇浓度40～70％)、经过乙醇梯度洗脱解吸，解吸液浓缩、干燥后得到含cAMP的大枣提取物产品，对提取物进行Elson-Morgan法抗过敏检测，得到抑制率为76.2％。本发明具有工艺简单、提取率高、成本低、原料丰富、提取测试周期短等特点。
文档编号C07H19/213GK102875625SQ20121041923
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者任迪峰, 曹晨晨, 王维有, 吴宏力, 鲁军, 欧赟 申请人:北京林业大学