专利名称：Kdr肽和包括该肽的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗和预防肿瘤、作为癌症疫苗极为有用的新的肽以及包括这些肽的药物。
背景技术：
肿瘤-排斥抗原基因主要是针对恶性黑色素瘤被鉴定出来的，因此，开发利用这些基因的癌症免疫治疗。具体地说,认识到在抗-肿瘤免疫应答中⑶8-阳性T细胞的重要性，已经注意到体内诱导肿瘤-特异的CD8-阳性T细胞的癌症疫苗治疗，并将其用于多种临床应用。此外，也阐明了组成大约10个氨基酸残基的肽通过I类途径，经多种共刺激分子的帮助而活化T细胞以诱导肿瘤-特异的细胞毒性T细胞(CTLs)的机制。另外，积极地鉴定了限于个别HLA分子的肽。然而，目前完全控制肿瘤是不可能的。这可能是由于肿瘤细胞的异质性、肿瘤细胞中MHC-1类表达的减少或消失、以及肿瘤细胞中靶分子的缺乏。此外，目前鉴定出来的肿瘤抗原肽只存在于一些肿瘤类型中，但不存在于所有的肿瘤类型中。因此为了解决这些问题，本发明不使用肿瘤细胞作为靶细胞，而是关注于肿瘤血管的内皮细胞。更具体地说，内皮细胞几乎没有涉及MHC-1类表达的减少或消失或异质性的任何问题。因此，如果可诱导靶向肿瘤血管的CTLs，就可以克服传统癌症疫苗治疗中的问题，`例如I类的消失和靶分子的缺乏，而不必考虑肿瘤的类型，并且可以预见优良的治疗效果。对肿瘤血管生成的研究起始于70年代由Folkman等人提出的先驱性的假说，并且已经从多个角度进行了研究。已经在血管内皮生长因子(VEGF)-血管内皮生长因子(VEGF)受体(VEGFRs)上进行了许多研究来评估它们在肿瘤血管生成中的有效性。已经积极地开发了血管生成的抑制剂作为靶定向的药物，特别是在癌症治疗中，并且正在进行临床测试。然而，还未使用基于这个理念用于癌症疫苗治疗的疗法。一个原因可能是对在正常细胞中表达的VEGFR的免疫耐受性。然而，在90年代，Plate, Millauer,和Risau等人证实在肿瘤组织的内皮细胞中强烈表达VEGFRs。此外，对也在正常细胞中表达的自发抗原，例如CEA和HER/neu的免疫应答却不一定会有免疫耐受性。因此，本发明人推论VEGFRs可用作癌症疫苗治疗的靶。近来，有报道说针对VEGFRs的活化免疫能够抑制肿瘤中的血管生成和转移(TheJournal of Experimental Medicine, 2002，195:12，1575-1584)。然而这篇文献只使用溶解的VEGFR蛋白质，并且对于有效肽的氨基酸序列没有进行研究。
发明内容
本发明人关注于靶向VEGFR2(KDR/flk_l;以下称为KDR)的可能的癌症疫苗治疗，其中VEGFR2在肿瘤组织的内皮细胞中强烈表达，并且认为其涉及对VEGF信号的内皮细胞增殖。此外，本发明人筛选了能够有效用作疫苗的肽，检验了它们的特异性，并且完成了本发明。更具体地说，本发明提供了下列[I]至[22]。[I]选自包括SEQ ID NO: 2、3、5、8、11或12的氨基酸序列的肽之九肽。[2]具有细胞毒性T细胞可诱导性的肽，其中对SEQ ID NO: 2、3、5、8、11或12的氨基酸序列进行一个、两个、或多个氨基酸的取代或添加。[3] [2]的肽，其中N末端的第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸。[4] [2]或[3]的肽，其中C-末端的氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。[5]选自包括SEQ ID N0:29、30、33、34、40或46的肽之九肽或十肽。[6]具有细胞毒性T细胞可诱导性的肽，其中对SEQ ID NO: 29、30、33、34、40或46的氨基酸序列进行一个、两个、或多个氨基酸的取代或添加。[7] [6]的肽，其中N末端的第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。[8] [6]或[7]的肽，其中C-末端的氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。[9]用于治疗和/或预防肿瘤的药物，其中该药物包括[I]至[8]中任何一项的一个或多个肽。[10]用于治疗糖尿病性视网膜病、慢性类风湿性关节炎、牛皮癣和动脉粥样硬化的药物，其中该药物包括权利要求[I]至[8]中任何一项的一个或多个肽。[11]在其表面呈递包括[I]至[8]中任何一项的肽和HLA抗原复合物的外来体。[12] [11]的外来体，其中 HLA 抗原是 HLA-A24 或 HLA-A02。[13] [12]的外来体，其中 HLA 抗原是 HLA-A2402 或 HLA-A0201。[14] 一种利用权利要求[I]至[8]中任何一项的肽诱导具有高细胞毒性T细胞可诱导性的抗原-呈递细胞的方法。[15] 一种利用权利要求[I]至[8]中任何一项的肽诱导细胞毒性T细胞的方法。[16] 一种诱导具有高细胞毒性T细胞可诱导性的抗原-呈递细胞的方法，其中所述的方法包括将包括编码[I]至[8]中任何一项的肽的多核苷酸的基因导入抗原-呈递细胞的步骤。[17]利用[I]至[8]中任何一项的肽诱导的分离的细胞毒性T细胞。[18]呈递HLA抗原和[I]至[8]中任何一项的肽的复合物的抗原_呈递细胞。[19] [18]的抗原-呈递细胞，其是通过[14]或[15]的方法诱导的。[20]用于在疾病部位抑制血管生成的疫苗，其中该疫苗包括权利要求[I]至[8]中任何一项的肽作为活性成分。[21] [20]的疫苗，将其施用于HLA抗原为HLA-A24或HLA-A02的受试体。[22] [20]或[21]的疫苗，将其用于抑制恶性肿瘤的生长和/或转移。本说明书包括在日本专利申请Nos.2002-267285、2003-062003、和 2003-167042的说明书和附图中所描述的内容，本发明以其为优先权的基础。
图1显示针对靶细胞的CTLs克隆的细胞毒性。图2显示已建立的CTL克隆的HLA-四聚体分析的结果:(a)由本发明的肽诱导的CTL克隆，和培养细胞；以及(b)饲养细胞(对照)。图3显示利用本发明的肽进行疫苗接种对接种Colon26的BALB/c小鼠存活率的影响。图4显示利用本发明的肽进行疫苗接种对Colon26来源的肿瘤生长的影响。图5显示利用本发明的肽进行疫苗接种对接种B16的小鼠存活率的影响。图6显示利用本发明的肽 进行疫苗接种对B16黑色素瘤来源的肿瘤生长的影响。在皮下注射B16肿瘤细胞前，用A2/Kb TGM疫苗接种两次，间隔时间为I周，用KDR773脉冲的Dc (黑圆)、单独的DC (白三角)、或HBSS (白方块)。该图显示平均的肿瘤生长(P〈0.01)。图7显示CTL克隆C29-169对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。图8显示CTL克隆C29-169对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。图9显示CTL克隆KDR C85-775 (KWC85-775)对呈递本发明肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。图10 显示 CTL 克隆 KDR C85-775 (KWC85-775)对呈递 KDR 肽的 HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。图11显示CTL克隆KDR C51-1328 (KWC51)对呈递本发明肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。图12 显示 CTL 克隆 KDR C51-1328 (KWC51)对呈递 KDR 肽的 HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。图13显示CTL克隆KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L)对呈递本发明肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。图14显示CTL克隆KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L)对呈递本发明肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。图15 显示 CTL 克隆 KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L)对呈递 KDR 肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。图16显示每种类型的抗体对CTL克隆的细胞毒性效果的抑制作用。图17显示本发明的肽对A2/KbTGM中B16细胞诱导血管生成应答的抑制活性。用HBSS、未脉冲的DC、或用本发明的表位肽脉冲的DC (KDR190、KDR772、KDR773、KDR773-2L、KDR775、或KDR1084)疫苗接种小鼠两次。箭头标明了新形成的血管，其以锯齿形的特征性模式行进。图18显示本发明的肽对转基因小鼠中人肿瘤体积增加的抑制作用。图19显示在存在肽(黑框)或缺乏肽(白框)时，CTL克隆KWC65-190对呈递本发明肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。图20显示在存在肽(黑框)或缺乏肽(白框)时，CTL克隆KWC72-772对呈递本发明肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。
图21显示CTL克隆KWC72-772对呈递KDR肽的HLA-A0201-阳性细胞的细胞毒性作用。HePG2-VEGFR2:黑框；HePG2_EGFP:白框。图22显示在存在肽(黑框)或缺乏肽(白框)时，CTL克隆C7-1318对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。图23显示在存在肽(黑框)或缺乏肽(白框)时，CTL克隆KWC46对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。图24显示在存在肽(黑框)或缺乏肽(白框)时，CTL克隆C18-189对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。图25显示在存在肽(黑框)或缺乏肽(白框)时，CTL克隆C65-826对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。图26显示CTL克隆C7-1318对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。HT29-VEGFR2:黑框；HT29_EGFP:白框。
图27显示CTL克隆KWC46对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。HT29-VEGFR2:黑框；HT29_EGFP:白框。图28显示CTL克隆C18-189对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。HT29-VEGFR2:黑框；HT29-EGFP:白框。图29显示CTL克隆C65-826对呈递本发明肽的HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。HT29-VEGFR2:黑框；HT29-EGFP:白框。图30显示本发明的肽对BALB/c小鼠中Colon26细胞诱导血管生成应答的抑制活性。用HBSS、未脉冲的DC、或用本发明的表位肽脉冲的DC (KDR189或KDR826)疫苗接种小鼠两次。箭头标明了新形成的血管，其以锯齿形的特征性模式行进。图31显示本发明的肽对BALB/c中Colon26细胞诱导血管生成应答的抑制。柱状表不平均值，而垂直误差的柱状表不标准误差。图32显示在存在肽(黑菱形)或缺乏肽(白方块)时，来源于用本发明肽刺激的患者的CTL对HLA-A24-阳性细胞的细胞毒性作用。(A)通过用SEQ ID NO:8 (其中氨基酸的起始位置是KDR169)刺激而获得的结肠癌症患者来源的CTL的细胞毒性作用；(B)通过用SEQ ID NO: 5 (其中氨基酸的起始位置是KDR189)刺激而获得的结肠癌症患者来源的CTL的细胞毒性作用；(C)通过用SEQ ID NO: 3 (其中氨基酸的起始位置是KDR220)刺激而获得的结肠癌症患者来源的CTL的细胞毒性作用。
具体实施例方式本发明人首先考虑到在被降解为9-基体(9-mer)的肽后(九肽)，抗原呈递细胞上体内呈递了多种蛋白质，因此检验了 KDR蛋白质的9-基体或10-基体部分肽与HLA抗原的结合亲合力，HLA抗原是人的主要组织相容性抗原(MHC抗原)。表I右侧所示的肽序列中小写字母标明了第5个氨基酸。人KDR蛋白质的氨基酸序列是已知的，例如，如美国专利号5，861，301所公开的，并且可由本领域的技术人员容易地获得。可根据所获得的KDR蛋白质的全长氨基酸序列，通过从任何位置开始合成肽来获得9-基体或10-基体的肽。可根据肽化学中使用的常规方法来合成肽。普遍用于合成的方法在例如Peptide Synthesis, Interscience, NewYork, 1996;The Proteins, vol.2, Academic Press Inc., New York, 1976;PeptideSynthesis (Peputido Gousei),Maruzen C0., Ltd., 1975;Foundations andExperiments in Peptide Synthesis(Peputido Gousei no Kiso to Jikken), MaruzenC0., Ltd., 1985;and Development of Pharmaceuticals, New Series (Iyakuhin noKaihatsu,Zoku), Volume 14,Peptide Synthesis(Peputido Gousei), HirokawaShoten, 1991，的文献以及例如国际公开N0.W099/67288的出版物中有描述。可通过分离在其细胞表面上包括HLA抗原的细胞，例如树突状细胞，并且利用测量肽与细胞的结合的常规方法来测量与HLA抗原的结合。备选地，可使用目前可在互联网上获得的软件程序，例如在Parker K.C.，J.1mmunol.152，1994中所描述的软件程序在娃芯片上计算机模拟(in silico)各种肽和HLA抗原之间的结合亲合力。可如例如在Parker, K.C., J.1mmunol., 152, 1994;和Nukaya,1.，Int.J.Cancer, 80, 1999中所描述的测量与HLA抗原的结合亲合力。为了得到足够的结果，优选使用据说在日本人中高表达的A-24型和A-02型抗原作为HLA抗原。更优选的，使用例如A-2402和A-0201的亚型。然而临床地，通过预先确定需要接受治疗的患者的HLA抗原类型，可适当地选择与该抗原具有高水平的结合亲合力，或对抗原呈递具有高水平的细胞毒性T细胞(CTL)可诱导性的肽。此外，为了获得具有高水平的结合亲合力和CTL可诱导性的肽，可根据天然存在的KDR部分肽的氨基酸序列进行一个、两个或几个氨基酸的取代或添加。在此，术语“几个”是指5个或以下，或优选为3个或以下。除了天然的肽，显示与HLA抗原结合的肽的序列规律是已知的(J.1mmunol.，152，3913，1994; Immunogenetics.41:178, 1995; J.1mmunol.155:4307, 1994)。因此，也可在所获得的肽上根据这个规律进行改进。例如，N末端的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，以及C-末端的氨基酸被取代为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的肽也可优选用作具有高HLA-24结合亲合力的肽。另一方面，N末端的第二个氨基酸被取代为亮氨酸或甲硫氨酸，以及C-末`端的氨基酸被取代为缬氨酸或亮氨酸也可优选用作具有高HLA-0201结合亲合力的肽。此外，也可向肽的N和/或C末端加入一个或两个氨基酸。然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的部分氨基酸序列相同，其可能产生副作用，例如，自身免疫疾病或针对特异物质的过敏症状。因此，优选使用可获得的数据库来进行同源性搜索，以避免该序列与另一个蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。此夕卜，如果同源性搜索发现不存在即使包括一个或两个氨基酸不同的肽，就没有为了增加与HLA抗原的高亲合力和/或CTL可诱导性而改进上述氨基酸序列所导致的这种问题的风险。如上所述，预期具有与HLA抗原的高亲合力的肽作为癌症疫苗是高度有效的。然而，需要确定利用高结合亲合力作为指标选择出来的候选肽实际上是否具有CTL可诱导性。通过诱导包括人MHC抗原的抗原-呈递细胞(例如，B-淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞)，更具体地来源于人外周血单核白细胞的树突状细胞；用肽刺激细胞；将细胞与CD-8阳性细胞混合；然后测量针对靶细胞的细胞毒性，从而证实CTL的可诱导性。至于反应系统，可使用为表达人HLA抗原而产生的转基因动物(例如，在Hum.1mmunol.2000Aug.;61(8):764-79Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimalepitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice:dependence on HLA class IIrestricted T(H) response., BenMohamed L., Krishnam R., Longmate J., Auge C., LowL.,Primus J., and Diamond DJ.中所描述的)。例如，通过用51Cr等放射标记祀细胞，可从靶细胞释放的放射活性计算细胞毒性。备选地，通过在存在具有固定肽的抗原-呈递细胞时测量由CTL产生和释放的IFN- y，并且利用抗-1FN- y单克隆抗体肉眼观察介质上的抑制带来检验活性。如上所述检验肽的CTL可诱导性的结果表明具有对HLA抗原的高结合亲合力的肽不是必定具有高的可诱导性的。此外，选自VYSSEEAEL(SEQ ID NO:2)、GYRIYDVVL(SEQ IDNO: 3)、SYMISYAGM(SEQ ID NO: 5)、RFVPDGNRI (SEQ ID NO:8)、KWEFPRDRL(SEQ ID NO: 11)、或 DFLTLEHLI (SEQ ID NO: 12)的氨基酸序列的九肽，和选自 AMFFWLLLV(SEQ ID NO: 29),VIAMFFffLKSEQ ID NO: 30), AVIAMFFffL (SEQ ID NO: 33)、KLIEIGVQT (SEQ ID NO: 34),YMISYAGMV(SEQ ID NO:40)、或 IQSDVWSFGV(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列的九肽和十肽显示特别高的CTL可诱导性。本发明进一步提供具有细胞毒性T细胞可诱导性的肽，其中对SEQ ID N0:2、3、5、
8、11或12的氨基酸序列进行一个、两个、或几个氨基酸的取代或添加。可以对由9个氨基酸组成的SEQ ID N0s:2、3、5、8、ll和12的氨基酸序列进行一个、两个、或几个氨基酸的取代或添加，只要它们具有CTL可诱导性并且不与另一个蛋白质的氨基酸序列匹配。特别的，例如，N末端的第二个氨基酸优选被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，或C-末端的氨基酸优选被取代为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸；或向N末端和/或C末端添加一个或两个氨基酸。本发明也提供具有细胞毒性T细胞可诱导性的肽，其中对SEQ ID NOs:29、30、33、34、40或46的氨基酸序列进行一 个、两个、或几个氨基酸的取代或添加。可以对由9个或10个氨基酸组成的SEQ ID N0s:29、30、33、34、40和46的氨基酸序列进行一个、两个、或几个氨基酸的取代或添加，只要它们具有CTL可诱导性并且不与另一个蛋白质的氨基酸序列匹配。特别的，例如，N末端的第二个氨基酸优选被取代为亮氨酸或甲硫氨酸，或C-末端的氨基酸优选被取代为缬氨酸或亮氨酸；或向N末端和/或C末端添加一个或两个氨基酸。这种修饰的肽的实例是SEQ ID N0:30的肽，其中N末端的第二个氨基酸被取代为亮氨酸(SEQID N0:54)，但这个实例不是限制性的。用这些修饰的肽刺激所得到的CTL克隆能够识别最初的肽，并导致破坏。本发明的肽可单独使用或两种以上组合使用作为能够体内诱导CTL的癌症疫苗。通过施用本发明的肽，该肽在抗原-呈递细胞的HLA抗原上以高密度呈递。诱导特异地与在所陈列的肽和HLA抗原之间形成的复合物起反应的CTLs，增加被靶向的肿瘤细胞中对血管内皮细胞的侵占。备选地，可通过从受试个体衍生树突状细胞，并用本发明的肽进行刺激来获得其细胞表面固定有本发明肽的抗原呈递细胞。将所得到的抗原-呈递细胞再施用于受试个体以在受试合体中诱导CTL。结果是，可增加指向靶细胞的侵占。更具体地，本发明提供治疗肿瘤或预防肿瘤的增殖、转移等的药物，其中该药物包括一个或多个本发明的肽。病理部位的血管生成不仅与肿瘤紧密相关，而且与例如糖尿病性视网膜病、慢性类风湿性关节炎、牛皮癣和动脉粥样硬化的疾病，以及实体瘤的转移紧密相关(Folkman, J., Nature Med.1:27-31 (1995) ; Bicknell, R., Harris, A.L., Curr.0pin.0ncol.8:60-65(1996))。因此，本发明的肽可用于治疗肿瘤、例如糖尿病性视网膜病、慢性类风湿性关节炎、牛皮癣和动脉粥样硬化的疾病，以及实体瘤的转移。证实本发明的肽抑制曲折血管的形成，这种血管在形态上有别于正常的血管，并且在恶性肿瘤的组织中形成。分析接种疫苗的小鼠中伤口的愈合和繁殖力的结果也证实该肽对正常的生理学上的血管形成无不良效果。此外，利用识别本发明肽的CTL克隆，体外测试对非增殖性或增殖性的内皮细胞的细胞毒性。这些克隆显示针对增殖性的内皮细胞比对非增殖性的内皮细胞有更强的活性。更具体地，它们对于涉及增殖性内皮细胞的病症，以及特别为癌症可十分特异地发挥作用。可通过将细胞暴露于高浓度的肽，轻易地用本发明的肽体内或体外刺激树突状细胞，这导致这些肽替换最初固定在细胞上的肽。因此，本发明所使用的肽必须至少具有一定水平的结合HLA抗原的亲合力。 本发明的药物可直接以本发明肽本身的形式给药，或以通过常规配制方法配制的药物组合物的形式给药。在这种情况下，本发明的药物除了本发明的肽以外，可适当的包括载体、赋形剂、以及一般用于药物的制剂，而没有特别的限制。本发明的药物可用于治疗和预防各种肿瘤，例如胃癌、十二指肠癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和脑瘤。本发明的肽不是靶向肿瘤细胞本身，而是靶向在肿瘤组织中新形成的血管的内皮细胞。因此，很多种类的肿瘤可以是治疗的标靶，并且不特别 地限制本发明药物的用途。包括本发明的肽作为活性成分、用于治疗和/或预防肿瘤的药物可以伴随佐剂给药以有效诱导细胞的免疫性；可伴随例如抗肿瘤剂的其他活性成分给药；可以颗粒剂的形式给药。在文献(Clin.Microbiol.Rev.，7:277-289，1994)中描述的佐剂等是可应用的。此外，本发明的药物可以下列形式给药:如脂质体制剂、结合直径为几微米的珠子的颗粒制齐U、以及结合脂类的制剂。给药的方法可以是例如，口服、皮内地、或皮下地、或经过静脉内的注射等。全身性给药或对靶肿瘤附近的局部给药都是可应用的。可根据待治疗的疾病、患者的年龄和重量、给药方法等适当地调节本发明肽的剂量。一般地，优选地几天一次或几个月一次地施用0.0Olmg至1，OOOmg,优选0.0lmg至1，OOmg,更优选0.1mg至IOmg的本发明的肽。本领域的技术人员能够适当地选择合适的剂量。备选地，本发明提供呈递在本发明的肽和其表面的HLA抗原之间形成的复合物的胞内囊泡。可根据例如在国际公开号Hei 11-510507和2000-512161的公开的日文翻译文本中具体描述的方法制备外来体。优选利用从待治疗或预防的目标受试个体获得的抗原呈递细胞制备外来体。本发明的外来体可如同本发明的肽，作为癌症疫苗进行接种。将使用的HLA抗原的类型必须与需要接受治疗和/或预防的受试个体的HLA抗原类型相匹配。例如，对于日本人，HLA-A24或HLA-A02，特别是HLA-A2402或HLA-A0201经常是合适的。本发明也提供利用本发明的肽诱导抗原呈递细胞的方法。通过诱导来自外周血单核细胞的树突状细胞；然后将它们与本发明的肽体外或体内接触(刺激)来诱导抗原呈递细胞。将本发明的肽施用于受试个体诱导受试个体体内的抗原呈递细胞，其上固定有本发明的肽。备选地，本发明的肽可固定至将被作为疫苗施用到受试个体的抗原呈递细胞上。本发明也提供用于诱导具有高水平的细胞毒性T细胞可诱导性的抗原呈递细胞的方法，其中所述的方法包括将包括编码本发明肽的多核苷酸的基因体外导入抗原呈递细胞。待导入的基因可以是DNA或RNA的形式。导入的方法可以是本领域普遍使用的各种方法，例如脂质体转染、电穿孔、和磷酸钙法，而没有特别的限制。更具体地，这些方法可如在例如，Cancer Res., 56:5672, 1996; J.1mmunol., 161:5607, 1998; J.Exp.Med.，184:465, 1996;或国际公开号2000-509281的公开的日文翻译文本中所描述的进行。通过将基因导入抗原呈递细胞，该基因在细胞中经历转录、翻译等。然后所得到的蛋白质经受I或II类MHC过程和递呈通路以呈递部分的肽。此外，本发明提供利用本发明的肽诱导CTLs的方法。通过将本发明的肽施用于受试个体,在受试个体体内诱导CTLs，增强了针对肿瘤组织中血管形成内皮细胞的免疫性。备选地，该方法可用自体内的治疗方法，其中将来源于受试个体的抗原呈递细胞、CD8-阳性细胞、或外周血单核白细胞体外接触本发明的肽(刺激)以诱导CTLs，然后将该细胞返回该受试个体。此外，本发明提供利用本发明的肽诱导并分离的细胞毒性T细胞。已经通过用呈递本发明肽的抗原-呈递细胞刺激而诱导的细胞毒性T细胞优选是来源于待治疗和/或预防的目标受试个体。细胞毒性的T细胞可以单独施用，为了抗肿瘤效果的目的，与其他药物组合施用，包括本发明的肽、外来体等。所得到的细胞毒性T细胞特异地针对呈递本发明肽的靶细胞发挥作用，或优选地针对呈递用于诱导的相同肽的靶细胞发挥作用。靶细胞可以是内源表达KDR的细胞，或被迫表达KDR的细胞。此外，也可以靶向由于经这些肽的刺激而在其细胞表面呈递本发明肽的细胞。本发明也提供呈递在HLA抗原和本发明的肽之间形成的复合物的抗原呈递细胞。通过与本发明的肽、或与编码本发明肽的核苷酸接触而获得的抗原呈递细胞优选来源于待治疗和/或预防的受试个体。抗原呈递细胞可作为单独的疫苗而施用，或与其他的药物，例如本发明的肽、外来体和细胞毒性T细胞组合使用。实施例下文中，本发明将利用实施例进行具体描述，但并不认为仅限于此。[实施例1] VEGFR-2 (KDR)-来源的肽一 I (HLA_A*2402)的预测根据KDR蛋白质的完整氨基酸序列，利用BioInformatics & Molecular AnalysisSection (BIMAS) HLA 妝结合预测软件(http://bimas.dcrt.nih.gov/cg1-bin/molbio/ken_parker_comboform),以与HLA_A*2402的最高结合亲合力的顺序预测12种9-基体肽(SEQ ID Nos:l至12)，和12种10-基体肽(SEQ ID Nos: 13至24)(表I)。表I显示按照最高值，以及KDR蛋白质氨基酸序列中N末端的位置的顺序排列的每个9-基体和10-基体的结合亲合力。在表中，CE652(SEQ ID NO:25)是指已由 Nukaya,1.(Int.J.Cancer 80，1999)报道过的肿瘤抗原CEA (癌胚抗原)的一个表位。使用HIV肽(ILKEPVHGV(SEQ ID NO: 55)和RYLRDQQLL(SEQ ID NO:56))作为阴性对照肽。根据标准的固相合成方法，利用Cleaved PepSet (Mimotope, San Diego, CA)合成肽，并通过反相HPLC纯化。利用HPLC和质谱仪分别确定肽的纯度(>95%)和类型。表1HLA_A*240 2与KDR-来源的肽的结合
权利要求
1.九肽或者十肽，其选自包含SEQID N0:29、33、34或40的氨基酸序列的肽。
2.具有细胞毒性T细胞可诱导性的肽，其中对SEQID NO:29、33、34或40的氨基酸序列进行一个、两个、或多个氨基酸的取代或添加。
3.权利要求2的肽，其中N末端的第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。
4.权利要求2或3的肽，其中C-末端的氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。
5.九肽，其选自包含SEQID NO: 2、3、5、11或12的氨基酸序列的肽。
6.具有细胞毒性T细胞可诱导性的肽，其中对SEQID NO:2、3、5、ll或12的氨基酸序列进行一个、两个、或多个氨基酸的取代或添加。
7.权利要求6的肽，其中N末端的第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸。
8.权利要求6或7的肽，其中C-末端的氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
9.用于治疗和/或预防肿瘤的药物，其中该药物包括权利要求1至8中任何一项的一个或多个肽。
10.用于治疗糖尿病性视网膜病、慢性类风湿性关节炎、牛皮癣和动脉粥样硬化的药物，其中该药物包括权利要求1至8中任何一项的一个或多个肽。
11.在其表面 呈递包括权利要求1至8中任何一项的肽和HLA抗原的复合物的外来体。
12.权利要求11的外来体，其中HLA抗原是HLA-A24或HLA-A02。
13.权利要求12的外来体，其中HLA抗原是HLA-A2402或HLA-A0201。
14.一种在体外利用权利要求1至8中任何一项的肽诱导具有高细胞毒性T细胞可诱导性的抗原-呈递细胞的方法。
15.—种在体外利用权利要求1至8中任何一项的肽诱导细胞毒性T细胞的方法。
16.一种在体外诱导具有高细胞毒性T细胞可诱导性的抗原-呈递细胞的方法，其中所述的方法包括将包括编码权利要求1至8中任何一项的肽的多核苷酸的基因导入抗原-呈递细胞的步骤。
17.利用权利要求1至8中任何一项的肽诱导的分离的细胞毒性T细胞。
18.呈递HLA抗原和权利要求1至8中任何一项的肽的复合物的抗原-呈递细胞。
19.权利要求18的抗原-呈递细胞，其是通过权利要求14或16的方法诱导的。
20.用于在疾病部位抑制血管生成的疫苗，其中该疫苗包括权利要求1至8中任何一项的肽作为活性成分。
21.权利要求20的疫苗，将其施用于HLA抗原为HLA-A24或HLA-A02的受试体。
22.权利要求20或21的疫苗，将其用于抑制恶性肿瘤的生长和/或转移。
全文摘要
本申请涉及KDR肽和包括该肽的疫苗。具体地，提供选自包括如SEQ ID NOS:29、33、34或40所示氨基酸序列肽的九肽；提供选自包括如SEQ ID NOS:29、33、34或40所示氨基酸序列的九肽或十肽；具有通过取代或添加一个至几个氨基酸而来源于上述任何氨基酸序列并且能够诱导细胞毒性T细胞的肽；以及包含这种肽而用于治疗或预防肿瘤的药物。这些肽可用作疫苗。
文档编号C07K14/71GK103073620SQ20121043072
公开日2013年5月1日 申请日期2003年9月12日 优先权日2002年9月12日
发明者和田聪, 角田卓也, 田原秀晃 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司